小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

サマリー

ここでプレニル化とグアノシン 5'-三リン酸 (GTP) を調査するためのプロトコルを説明-GTPase の読み込み。このプロトコルは、2 つの詳細なメソッドで構成されています、すなわち膜分画と gtp アーゼ抗体アッセイします。プレニル化と GTP を測定するプロトコルを使用することができます別の他の低分子量 g タンパク質の読み込み。

要約

Rho である家族は、Ras スーパーファミリーに属するし、人間でおよそ 20 人のメンバーが含まれています。低分子量 g 蛋白質 Rho、細胞骨格、細胞運動、細胞極性、軸索ガイダンス、小胞輸送、細胞周期制御を含む、多様な細胞機能の調節に重要です。Rho GTPase シグナリングの変化は、がん、中枢神経系疾患、免疫システム依存性疾患など、多くの病的状態における重要な規制役割を果たします。における Rho gtp アーゼ (すなわち、メバロン酸経路の中間体によるプレニル化) と GTP 結合の翻訳後修飾は、このタンパク質の活性化に影響を与える重要な要因です。本稿 Rho GTPase の広範な範囲のプレニル化と GTP 結合活性を検出する 2 つの重要なメソッドが提供されます。使用されている技術的な手順の詳細を説明したこの原稿で一歩一歩。

概要

低分子量 g 蛋白質 Rho Gtpase の Ras スーパーファミリーになりユニークな亜科、進化、よく保存されて小さい蛋白質 (21-25 kDa) のグループであります。このスーパーファミリー内各亜科、GTPase 活性とヌクレオチド交換¹関与している共有 G ドメイン コアがあります。Rho ファミリーと他の Ras サブファミリーとの違いは、5^番目の β ストランドと小さい gtp アーゼ ドメイン²の 4^th α ヘリックス内「Rho 挿入ドメイン」の存在です。

最近の分類に基づいて、Rho Gtpase シグナリング分子 gtp アーゼ Ras スーパーファミリー³に収まるの家族と見なされます。哺乳類における Rho gtp アーゼは、一般的性質⁴ ρ、Rac1 と Cdc42 がこのグループのほとんどを学んだメンバーの間では、特定の機能に基づく 22 のメンバーを持ちます。Rho Gtpase は厳しく規制されたメカニズム蛋白質翻訳後修飾を介して分子スイッチ⁵に依存する細胞内シグナル伝達経路を介してにリンクされます。

GTP の読み込みと加水分解の Rho Gtpase 活性化/不活性化サイクルに不可欠な機構が、規制を介してGTPase 活性化蛋白質 (ギャップ)。ギャップは GTP 加水分解を担当し、GTP の読み込み反応に責任があるグアニン ヌクレオチド交換要因 (一種) と連携して動作します。Rho GDP 解離阻害剤 (GDIs) はさらに GDP 結合 Rho gtp アーゼに結合を介して小さな Rho Gtpase の調節を提供します。これは GDP の解離を抑制する、アクティブな細胞内膜サイトから Rho Gtpase の隔離が容易になります。さらにでは、ヌクレオチド加水分解と交換とコントロール GDP/GTP^1,6,7、8をサイクリングの両方を調節する GDIs のプレニル化を含む GTPase 蛋白質の規則はまた。

これら蛋白質^1,9の脂溶性の性質を変更することによって GTPase の細胞質と細胞膜との間の動きは、GTP の読み込みと Rho GTPase プレニル化を関与しています。上記の規制当局は、細胞膜のリン脂質と GDP/GTP 交流活動¹⁰の他の変調の蛋白質と対話します。また、GDIs、解離の阻害剤は GTP 加水分解して GDP/GTP exchange をブロックします。GDIs は、GDP から非アクティブな Rho 蛋白質の解離と、したがって、下流のエフェクターとの相互作用を阻害します。GDIs は、低分子量 g 蛋白質の細胞質と細胞膜の間のサイクリングも規制します。Rho Gtpase の活動は細胞膜; する動きに大幅に依存します。したがって、GDIs はその疎水性領域/ドメイン^11,12を非表示を通って細胞質に低分子量 g 蛋白質を隔離することができます重要な調節因子として見なされます。

その活性化サイクルのすべての段階で最適なシグナル伝達と機能を持っている GTPase の GTP-読み込み/GTP 加水分解の動的なサイクルは重要です。その後細胞極性、増殖、形態形成、細胞質分裂、移行、接着、および生存^13,14など Rho GTPase によって調整される細胞機能の変化のこのプロセスの変更についてのあらゆる種類があります。

現在のプロトコルは、プレニル化・ GDP/GTP ロード調査小さい ρ GTPase 活性化を介して監視する詳細な方法で読者を提供します。このメソッドは、プレニル化と低分子量 g タンパク質の広い範囲の GTP 結合検出にも使用できます。Gtp アーゼ アッセーを使用して、他の種類、Rac1、Rac2、Rac3、H、K、または N Ras、Arf、および Rho¹⁵など低分子量 g 蛋白質の活性化のレベルを測定できます。薬理学的エージェント シンバスタチンは、最近小さな GTPase プレニル化と活動^8,9,14,16の調節に関与すると報告されたなどとして使用します。

プロトコル

1. 膜/細胞質分画を用いた ρ 定位法の定量

1. 細胞培養とシンバスタチン治療
   1. U251 100 mm のセル皿し、ダルベッコの文化のそれらの種 50,000 イーグル培地 (DMEM) (高グルコース, 10% 牛胎児血清 [FB]) に変更。
   2. メディアを取り外して、シンバスタチン含有培地を追加すること (ジメチルスルホキシド [DMSO] に溶解シンバスタチンの 10 μ M)、細胞を治療に 30% 合流と 37 ° C⁸時 36 時間孵化させなさい。車両制御として単独で DMSO を使用します。
      注: 1000 万の細胞は、細胞の細胞質と膜分画に必要です。
2. セルのコレクション
   1. 37 ° C の定温器からセルを削除します。密度を確認する顕微鏡下で細胞を見てください。
      注: セルは 70%-80% の合流をする必要があります。
   2. 培地を吸引、洗浄セル 1 冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と x。5 mL のエチレンジアミン酸 (EDTA) バッファーを追加 (KCl: 400 mg/L の NaCl: 6800 mg/L、NaHCO3: 2200 mg/L、NaH₂PO₄。H₂o: 140 mg/L、D-グルコース: 1,000 mg、EDTA 二ナトリウム: 373 mg/L) プレートとセルが 5 分の 37 ° C の定温器に戻る場所あたり。
   3. 孵化の 5 分後、EDTA と媒体の同じ量を含む 15 mL チューブに細胞を EDTA を収集します。
      注: チューブで媒体を持っている EDTA を中和して細胞膜のそれ以上の消化を防ぐことができます。
   4. アイス ボックスにチューブを設置し、遠心分離機に進みます。
   5. 1,500 × gで 4 ° C に遠心分離機を設定し、5 分のセルをスピンします。
   6. ペレットを乱すことがなく上澄みを除去し、1 mL の冷 PBS を追加します。セルをよく混ぜます。
   7. 4 ° c、1,500 × gで遠心する新しい 1.5 mL チューブに細胞混合物 (ソリューション) を転送し、5 分のセルをスピンします。
   8. (次のステップのバッファー量を推定) のペレット サイズを確認してください。氷の上にサンプルを配置します。ペレットを乱すことがなく上清を完全に破棄します。
   9. 上下、ピペッティングでよくサンプルを混ぜる (10 mM トリス-HCl [pH 7.5]、0.1 ミリメートルの EDTA、0.1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM ジチオトレイトールおよびプロテアーゼ抑制剤のカクテル)、冷たいバッファーを加えて超音波処理に進みます。
3. 超音波処理
   1. 5 サイクル、5、超音波発生装置を設定、それぞれ s とリピートの 3 倍。
   2. 氷の上、超音波処理を実行します。超遠心機に進みます。
      注: 氷と冷たい状態のタンパク質を保持、結果の信頼性を高めます。
4. 超遠心法
   1. 細胞質細胞ホモジネートに分割する、超遠心機を使用し、膜の一部分。遠心分離機を 100,000 × g 4 ° C で 35 分に設定します。図 1のように、ペレット サイズを確認します。
      注: 膜画分はチューブの一番下に、残りは細胞内の他のコンポーネント。
   2. ペレットを邪魔しないように注意しながら完全に上清を収集します。上澄みは、ゾル性細胞質の一部です。新しくラベル付けされたチューブに上清を配置します。
   3. 解離のバッファー (バッファー II) の 300 μ L を追加 (50 mM トリス-HCl [pH 7.5]、0.15 M 塩化ナトリウム、1 mM ジチオトレイトール、1 %sds、1 mM EDTA、グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM とプロテアーゼ阻害剤のカクテル) (膜画分を含む) ペレットにします。上下にピペッティングでよく混ぜます。
   4. タンパク質の定量および西部のしみ (イムノブロット) サンプル準備に進みます。
5. 免疫ブロット
   1. 細胞蛋白質の換散バッファー (20 mM トリス-HCl [pH 7.5] 0.5 mM PMSF、0.5% 非イオン性洗剤 40、100 μ M β グリセロール 3-リン酸と 0.5% プロテアーゼ抑制剤のカクテル) で区切られた分数からの抽出物を準備します。
   2. Lowry 方法⁸を用いたタンパク質濃度を測定し、(20 mM トリス-HCl [pH 7.5]、0.5 mM PMSF、0.5 %nondenaturing 洗剤、octylphenoxypolyethoxyethanol、100 μ M β グリセロール 3-リン酸、および 0.5% の換散バッファーのボリュームを計算プロテアーゼ阻害剤カクテル) サンプルの蛋白質の濃度を正常化します。
   3. 90 ° C、5 分でサンプルを加熱し、蛋白質を分けるのに 15 %sds ページのゲルのサンプルの 15-20 μ L をロードします。
      注: 読み込む各サンプルの蛋白質の 1 μ g です。それに応じて実行する必要がありますボリュームを計算します。
   4. 室温 (RT) 100 V で、2 h の条件 (500 nM グリシン、50 ミリメートル トリス-HCl と 20% メタノール) を還元下でナイロン膜に分けられた蛋白質を転送します。
      注: 正常なタンパク質の転送を確認するには、Ponceau 染色を使用または膜上のタンパク質マーカーを可視化します。
   5. 5% 無脂肪ドライミルクと 1 x 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS/0.01% 非イオン性洗剤の洗剤を含む膜をブロックします。TBST) 1 h の RT、または一晩の 4 ° C で非特異的な抗体の結合をブロックします。
   6. イムノブロット解析の一次抗体を追加し、4 ° C で一晩インキュベート
      注: この実験でパン カドヘリン、GAPDH、ρ cdc42 Rac1/2/3 使用された 1% の牛乳 1 の縮尺希釈で x TBST。パン型カドヘリンおよび GAPDH それぞれ膜と細胞質画分の純度を確認する使用されました。
   7. 3 膜を洗浄 1 洗浄バッファー x 20 分の x TBST。
   8. 抗家兎西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の膜を孵化させなさい-(RT で 1 h) のそれぞれの一次抗体の共役二次抗体。
   9. 黒子を洗う 20 分の 3 倍、化学発光 (ECL) の検出とそれらを開発。

2. 小 G タンパク質活性アッセイを用いた ρ GTP 負荷の測定

1. カウント 10,000 細胞/mL と文化 100 mm の U251 セルの皿します。
2. 1.1.2 の手順で説明するよう、30% 合流、シンバスタチンとセルを扱います。
3. インキュベーター外培養皿をもたらします。密度の確認を顕微鏡下で細胞を見てください。セルが 70-80% の合流であるを確認します。氷のペトリ皿を場所、メディアを吸引、洗浄セル 3 x 氷冷 PBS (pH 7.2)。
4. PBS を吸い出しなさい。PBS のすべての残党を削除する追加分の氷の上にペトリ皿を傾けます。
   注: 残留の PBS は、この試金悪影響を及ぼします。
5. ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を含む冷たい換散バッファーの 700 μ L のボリュームで細胞を溶解させます。
   注: 700 μ L、通常十分な 100 mm シャーレ。各培養器の適切なボリュームを見つけるための表 1を参照してください。
6. 細胞スクレーパー細胞ライセートの収穫します。この技術のため培養プレートを傾斜します。
7. ライセート転送ラベル冷たい cryotube 氷の上保管してください。
8. 渦を使用して徹底的にミックスします。サンプルの蛋白質の集中を測定するための蛋白質の試金の溶解液の 10 μ L を保ちます。
9. スナップ-凍結残った細胞ライセートの液体窒素。
   注: は、細胞ライセート スナップ凍結 ρ gtp アーゼ活性の損失につながることができる繰り返し凍結/解凍サイクルを避けるために、それらの前に、の複数の因数を準備します。
10. -80 ° C のフリーザーにスナップ冷凍 cryotubes を転送および gtp アーゼ アッセーのサンプルを保存します。
    注: は、14 日以上のサンプルを保管しないでください。すぐに働き、氷上で 10 分以上のサンプルが離れない。すべてペトリ皿を同時に扱うことはありません。
11. Lowry 方法⁸を用いたタンパク質濃度を測定し、サンプルの蛋白質の濃度を正常化する換散バッファーのボリュームを計算します。
    注記: 最高濃度は 1 mg/mL;ただし、0.3 - 2 mg/mL は検出可能なことができます。
12. マイクロ チューブに換散バッファーの 60 μ L と結合バッファーの 60 μ L を追加することで空のコントロールを準備します。
    注: 空白のコントロール抗原を除くすべての試薬には、バック グラウンドの引き算のため使用されます。
13. ロー制御タンパク質の 12 μ L、換散バッファーの 48 μ L、結合バッファーの 60 μ L を追加することによって肯定的な制御を準備します。
    注: すべての試薬に加えて、Rho-A-GTP の確認された抗原肯定的なコントロールがあります。
14. そのバッグの Rho の親和性プレートを取るし、氷の上に置きます。
15. 冷たい蒸留水を 100 μ l 添加と井戸の粉溶解します。氷の上のプレートを保ちます。
16. 25 ° C に設定水浴のスナップ固定セル lysates を解凍します。
17. タンパク質濃度を正常化するには、各サンプルに (ステップ 2.11) から冷たい換散バッファーの計算されたボリュームを追加します。
    注: は、換散バッファーの組成の変更を回避するために (真空管式アスピレータを使用) セルを洗浄した後、PBS を削除します。0.8 と gtp アーゼ活性化アッセイのサンプル間の比較を正確に 2 mg/mL の濃度にサンプルの蛋白質を均等化します。表 2は、この試金のために使用するバッファーの詳細についてを提供します。
18. マイクロ チューブに正規化された冷たいサンプルの 60 μ L を転送し、バッファーをバインドの 60 μ L を追加サンプルを徹底的にミックス、氷の上にそれらを保ちます。
19. 完全に削除/水溶液マイクロ プレート、積極的なフリックすることで研究室のマットの上に 5 ~ 7 ハード タップが続きます。
20. 重複で井戸に正規化されたサンプル、空白のコントロールおよび肯定的な制御の 50 μ L を追加します。
21. 300 rpm で 4 ° C で 30 分間軌道シェーカーにプレートを配置します。
    注: 振動の手順は非常に重要で、300 rpm で軌道プレート シェーカーを使用する勧めします。
22. フリックでプレートからサンプルをオフにし、それらを洗浄した積極的で洗浄液 200 μ L を 2 倍洗浄バッファーから削除井戸各洗浄後フリック、タップ、続いてし、プレートをベンチに室温維持
23. 各ウェルに RT 抗原提示バッファーの 200 μ L を追加し、RT で 2 分間インキュベートします。
24. 井戸からソリューションをフリックし、井戸 3 室温洗浄液 200 μ L と x
25. 常に新鮮な 1/250 反 ρ 一次抗体の 50 μ L を各ウェルに追加します。
26. 25 ° C に設定 300 rpm の 45 分の軌道シェーカーでプレートを配置します。井戸からソリューションをフリックします。
27. 洗濯の手順 2 を繰り返します (手順 2.24) x。
28. 常に新鮮な 1/250 反 ρ 二次抗体の 50 μ L を各ウェルに追加します。
29. 25 ° C に設定 300 rpm の 45 分の軌道シェーカーの上にプレートを配置します。
30. 試薬 A と試薬 B の等しい容積を混合することによって HRP 検出試薬を準備します。
31. 各ウェルからソリューションをフリックし、井戸 3 室温洗浄液 200 μ L と x
32. 作りたての HRP 検出試薬 50 μ L を各ウェルに追加します。
33. 最大信号を取得し、適切なソフトウェア パッケージを使用して結果を分析する 3-5 分以内で発光信号を読みます。
    注: 測定値は最大の信号を取得する 3-5 分以内で取られなければなりません。""テスト プレートを実行確認適切な換散バッファー ボリュームが使用されてセル lysates のタンパク質濃度が十分に高い ρ GTPase 活性を検出するようにします。(テスト プレートは換散バッファーの量が適切かどうか、またタンパク質濃度が許容範囲内にあるかどうかを決定するために使用するセルのプレート)肯定的な制御読むべき 4 〜 10 倍空井戸より高い線形の範囲内にある場合です。ない場合は、製造元に問い合わせる、ルミノを調整します。表 3に、ルミノの設定が与えられます。
34. 列見出しがサンプル、平均、標準偏差、 rep1、表示 rep2、 rep3を読むとrep4、各サンプルで行われている複製の数を示すことである raw データを入力します。
35. 意味するには、[入力式=average(Xn:Yn) X rep1Y の列指定子を = = rep4と n 列指定子 = 取り組まれている行の行識別子。
36. 標準偏差、下= stdev (Xn:Yn)数式を入力ここで、X = rep1Y の列指定子 = rep4と n 列指定子 = 取り組まれている行の行識別子。
37. 表示 rep2 rep1等に複製データを入力します。
38. データを入力した後に、サンプル、意味、および標準偏差を選択するクリック ・ ドラッグ メソッドを使います。
39. データ分析ソフトウェアで、作るよう正方形の内側にミニ バー グラフとグラフの関数を選択します。
    注: これは、入力されたデータに基づいて設計チャートにプロセスを作るグラフをもたらします。
40. 縦棒グラフを選択し、入力値を意味する番号を指定します。
    注:を意味する数字のグラフは最初になされた y 軸誤差の標準偏差の欄を指定するし、.これを行うには、グラフのバーをダブルクリックして、 y 軸エラータブを選択、カスタムオプションをクリックして、標準偏差データの場所を入力するワークシートで範囲を選択します。必要なグラフの作成後、比較する必要がありますグループの違いを見ることができます。

結果

膜分画:

超遠心法は、膜と細胞質成分の分別に使われました。図 1に示すように、上清に含まれて細胞質画分とペレットが入っている膜画分。U251 細胞から得られた細胞内導入が期待されて分数の ρ の豊かさはシンバスタチン免疫ブロットを使用で治療後調べた。純度と膜と細胞質画分のコントロールを読み込むは、それぞれパン型カドヘリンおよび GAPDH によって確認されました。図 2に示すように、シンバスタチン治療がそのゾル性細胞質の内容が増加したが膜結合型 ρ GTPase の量を減らします。これは ρ プレニル化の阻害に基づく低分子量 g 蛋白質の転流にスタチン系薬剤の知られている効果と一貫性が。シンバスタチン ρ GTPase のプレニル化を阻害する、したがって、unprenylated ρ は細胞膜に固定す...

ディスカッション

ここで我々 は小さな GTPase プレニル化と GTP 結合小さい gtp アーゼ内局 (膜と細胞質) および Rho GTP の読み込みを測定する正確な方法をについて説明します。低分子量 g タンパク質は真核細胞で表現し、構造、運動、細胞増殖に必須の役割を果たします。プレニル化と GTP 結合; GTPase 活性の調節に関与しています。したがって、プレニル化とこれらの蛋白質の GTP 結合を評価する試金、細胞生物学者^1,8のための重要なツールです。

最近の研究の結果に基づき、Rho 蛋白質 GTP の読み込みは携帯型特定⁸で、したがって、異なる細胞の種類によって異なります。また、内局と Rho 蛋白質の geranylgeranylation (GGT) 彼らの機能の調節に決定する手順を示します。これはまたさらに GEF、ギャップ、および GDI のエフェクタータンパク質の主要な低分子量 g 蛋...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM高グルコース	VWR(カナダ)	VWRL0101-0500
シ胎児血清	VWR(カナダ)	CA45001-106
ペニシリン/ストレプトマイシン	VWR(カナダ)	97062-806
EDTA(エチレンジアミン四酢酸)	VWR(カナダ)	CA71007-118
EGTA(エチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸)	VWR(カナダ)	CAAAJ60767-AE
DTT(DL-Dithiothreitol)	VWR(カナダ)	CA97061-340
過硫酸アンモニウム	VWR(カナダ)	CABDH9214-500G
トリス-ヒドロキシメチルアミノメタン	VWR(カナダ)	CA71009-186
30%アクリルアミド/ビス溶液	Biorad(カナダ)	1610158
TEMED	Biorad (カナダ)	1610801
Protease Inhibitor cocktail	Sigma/Aldrich (カナダ)	P8340-5ML	1:75 希釈
Rho-GTPase 抗体サンプラーキット	Cell Signaling (カナダ)	9968	1:1000 希釈
Pan-Cadherin antibody	Cell Signaling (カナダ)	4068	1:1000 希釈
GAPDH 抗体	Santa Cruz Biotechnology (米国)	sc-69778	1:3000
RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format)	Cytoskeleton Inc. (USA)	BK121	Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide.2016.RhoA
Antibody	Cell Signaling	2117
ECL	Amersham-Pharmacia Biotech	RPN2209
抗ウサギIgG(全分子)ペルオキシダーゼ抗体	Sigma	A6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	1612071A	分光光度計
Nonidet P-40	グ	マ11332473001	非変性洗剤、オクチルフェノキシpolyethoxyethanol
DMSO	シグマ	D8418-50ML
PBS	シグマ	P5493-1L
Phophatase阻害剤カクテル	シグマ	P5726-5ML	1:75希釈