方法論記事

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

DOI：

10.3791/57653

⸱

2018年6月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Bristol Medical School, Translational Health Sciences, University of Bristol

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

二本鎖 DNA 切断の修復は、病変を対処した後、休憩だけでなく、その解像度で修復複合体の形成だけではなくを必要とする動的なプロセスです。ここは、蛍光顕微鏡過渡的かつ長期的な二本鎖切断ツールとしてこのゲノム維持機構を解剖します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA の二本鎖切断 (Dsb) の修理は非常に調整されたプロセス、形成し複数タンパク質の修復複合体の解像度が必要です。このプロセスは、関連付けを促進するタンパク質の無数およびこれらの病変に蛋白質の脱退によって規制されています。蛋白質の広大な図書館の機能画面を実行する能力に大部分のおかげで、二本鎖 DNA 切断の修復に必要な遺伝子のより深い理解があります。よくノックアウトまたは化学的阻害剤スクリーンは、DSB の修復に必要な蛋白質のマーカーとして高められた毒性を使用して修理プロセスに関与する蛋白質を識別します。識別する新規細胞タンパク質ゲノムの忠実性を維持に関与するに役立つ、機能解析が必要です興味の蛋白質は、ローカリゼーション、形成、または修復複合体の解像度を促進するかどうかの決定。

蛍光顕微鏡による、明瞭な核の巣として修理蛋白質の蓄積を容易に検出できます。したがって、DNA 損傷のサイトでこれらの蛋白質の加盟および脱退は、二本鎖 DNA 切断の誘導後代表的な間隔でこれらの核の巣を観察することによってアクセスできます。このアプローチは、修理欠陥が修理不完全な遅れに同時に発生しない場合も誤ローカライズされた修復因子蛋白質を識別できます。このシナリオでは、長期的な二重鎖 DNA 切断は細胞と酵素の認識部位が細胞のゲノムに統合されました珍しい切削エンドヌクレアーゼ (例えば、SceI) を表現することによって設計することができます。結果として得られる病変は特に忠実な修復酵素の認識部位、胸の谷間の別のラウンドをプロンプトを再導入すると解決するは難しい。その結果、修復の動態の違いが解消されます。修理錯体が形成されていない場合、ローカリゼーションは妨害されました。このプロトコルでは、修復反応として修復タンパク質の局在の変化を識別するために必要な方法について説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

毎日、人間の体のあらゆる細胞は推定 10,000 殺到 DNA 病変1。この実存的な脅威は、セルと同様、突然変異、発癌のリスクが私たちを置く死。ゲノムの忠実性を保護するために哺乳類細胞は一連の複雑な蛋白質の関連付けと修正と DNA 損傷に対応するため進化してきた。この応答は、まとめて DNA 損傷応答 (DDR)2,3と呼ばれる、複数の経路に編成されます。DDR は、DNA 損傷、時間的、空間的調整で DNA 修理蛋白質の蓄積で構成されています。DDR はよく伝搬または破損した DNA2,4、5のレプリケーション中に発生する被害の激化を避けるために細胞周期の停止を誘導します。ターンも、修理が完了した後修理錯体の関連付けを解除によって細胞周期の停止をオフに細胞の生存のため必要です。

DNA 損傷の様々 な種類、Dsb は最も有害があります。Dsb の修復に失敗したは、染色体組換え誘発または全体の染色体腕の損失など大規模な削除につながります。Dsb の修復は 2 経路6,7、8に分かれています。相同組換え (HR) は、姉妹を必要と染色体 DNA のテンプレートとして使用する、従って細胞周期9,10S と G2/M 後期に限られます。非相同末端結合 (NHEJ) は、これらの制限はありませんが、Dsb11,12を修復するときに小さな削除を引き起こすことができます。

DSB 修復具体的、DDR 一般に調査のアクティブな領域。便利な区切られた経路にまとめられ、にもかかわらず多大な冗長性があります。確かに、複数経路13,14,15,16(BRCA1、BRCA2、および例の複雑な RPA) 多くのタンパク質が関与しています。1 つの経路による病変の修復は、別経路14で修復する必要があります中間の損傷につながることができます。必要な時間の正確な量を適切な場所に右の蛋白質を採用、複雑なタスクと組み合わせて、これらの経路の多階層を規制する必要があります。

最近の報告書は、修理複雑な形成、解像度、およびローカリゼーションの各別々 にできる障害17示すことによって DDR の複雑さを強調表示します。次のプロトコルの全体的な目標は、決定的に DSB を修復する細胞の能力を分析することです。蛍光顕微鏡を用いた、Dsb の誘導代表時点で損傷部位で修理蛋白質の蓄積を視覚化できます。

この技術は、一般的に使用される方法をいくつかの利点を持っています。多くの場合、修理は単一の時間ポイントで調査およびアセンブリの動的過程と修理錯体の解離を表すことができません。フル解像度の最初のライセンス認証から修理の完全な範囲を観察することにより、修理の遅れは完全に抑制として誤認されたないこと。逆に、それは当該対策を不活性化することができる修復反応の誘導は通常または過度の活性化として誤認しないことを保証します。

遅延タンパク質複合体形成と修復タンパク質の誤ローカリゼーションただし、可能性があります明確に区別しないでこの方法で。修復タンパク質がミスとローカライズされた局在の遅延か確かめるには、細胞の DNA の酵素の開裂を「長期的な」DSB を導入できます。結果病変はそれが修復された明瞭な大型核修理フォーカスの結果、募集から時間制限を解除するたびに改修されました。これは、長期的な DSB を誘導するまれな切削エンドヌクレアーゼ (例えば、SceI) の使用に既存のアプローチを変更することによって実現できます。Dsb の寿命は、蛍光顕微鏡でとらえどころのない修復タンパク質の可視化を実現。 にします。抗体の品質、低い研究蛋白質が DNA の修復に影響を与えることがわかったときに役に立つかもしれない機能の制限による検出を妨げてと強化された豊かさが可視化を向上することはまた。

特に、我々 は無料の画像処理と解析ソフトウェア (例えばImageJ) について明示的な指示を提供します。これはより多くのオーディエンスに DNA 損傷修復の尋問を開く、画像解析の主要な金融の障壁を削除します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは U2OS セル - SceI 認識サイト18の書かれているのでご了承ください。セルは U2OS をする必要はありませんが、-SceI サイトを含める必要があります。プロトコルは、調整された (例えば、播種された細胞およびインキュベーション時間の数) にする必要があります使用される電池の種類に応じて。

1. DSB 修復複合体形成反応の定義

  1. 85-90% まで 10 cm 組織培養プレート上の U20S DRGFP のセル成長合流。
  2. メディアを取り外し、2 分のため EDTA の 3 mL の室温 (RT) で孵化させなさい。
  3. 1 mL のトリプシン EDTA に置き換えるし、5 分細胞が顕微鏡下で表示して板の表面から切り離されることを確認の 37 ° C で孵化させなさい。5 mL のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンとトリプシンを中和します。
  4. 細胞診断とトリパン ブルー排除法を使用してこの懸濁液中の濃度を決定します。
  5. シード 6 x 103細胞/ウェルのガラス底 96 ウェル プレートを 200 μ l 添加。また、12 mm coverslips に 8 mL の種子 4 x 106セルは、10 cm のプレートに配置されます。
    注: 各井戸または coverslip コントロールを含む単一の時間ポイントを表します。
  6. 37 ° C、5% CO2で一晩細胞を成長します。
  7. Dsb を誘導
    1. 96 ウェル プレート/10 cm 皿からメディアを交換して H2O2を DMEM + 10% と 25 μ M の濃度に希釈して FBS と 37 ° C 1 時間で孵化させなさい。
    2. PBS x 1 と 3 x と新鮮な DMEM に置換 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した細胞を洗浄します。37 ° C、0、1、4、8、24、および 48 h. 各実験に H2O2の新鮮な希釈液を使用することを確認、セルを孵化させなさい。
      注: ここで使用される H2O2の濃度で細胞を殺す避けるために、老化とアポトーシス細胞の大部分を回避するよう十分なダメージ量が低いことを確認します。回復プロセスを観察するが重要です。これは、最高用量の範囲に感度を測定することによって達成されます。MTT の試金または使用できる水素過酸化物の最小濃度を決定する他の細胞生存率の試金を実行します。
  8. 固定し、細胞の構造
    1. 1x PBS で 3 回洗浄を行う。各時点の 10 cm のプレートから観察を外し、24 ウェル プレートを固定するための単一の井戸の配置。針と鉗子を使って、coverslip と coverslip の表面から細胞を傷を避け慎重に取り外します。
    2. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) と 15 分のためのインキュベーションでセル指定の H2O2露出と新鮮な DMEM 置換 (0、1、4、8、24、および 48 h) の 1 時間後の時間を修正。
    3. PBS で 3 回固定 coverslips を洗います。1x PBS で希釈した 0.5% 非イオン性洗剤でセルを permeabilize します。3 x PBS で洗浄する前に常温では、15 分間インキュベートします。
      注: 透過後、coverslips の貯蔵可能です PBS で 4 ° C で少なくとも 1 週間の。
  9. 複雑な視覚化を修復します。
    1. 3% ウシ血清アルブミン (BSA) と 0.1% 非イオン性洗剤 1x PBS で希釈した溶液に 96 ウェル プレート/coverslips をブロック (3 %bsa 溶液) 室温 1 時間
    2. 1x PBS で 3 回を洗う前に常温では、1 h 3 %bsa 溶液の製造元の仕様に従って希釈、関心の修復タンパク質を対象とする一次抗体とインキュベートします。
    3. 96 ウェル プレート/coverslips を 3 %bsa 溶液で製造元のプロトコルに従って希釈した二次抗体とインキュベートします。セカンダリ fluorophores が重複する励起または発光スペクトルを持っていないことを確認します。
    4. 洗浄のセル PBS 3 時間後 1x PBS で製造元の仕様に従って希釈 DAPI を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。
    5. スライド マウント エージェント、ダウン セル側の顔を確かめるのドロップで coverslips をマウントします。慎重に、coverslips、ワイプで任意の余分なマウント エージェントを吸収します。
    6. 速乾性の透明なマニキュアで coverslips をシールし、スライドとカバーガラスの完全なシールを確保します。
    7. 実験にバイアスを導入することを避けるために (興味の DNA 修復遺伝子からの信号) で他のチャネルの前に、DAPI チャネルに焦点を当てて共焦点顕微鏡画像を取る。
    8. また、目的の地域の Z セクションを取り、すべての検出可能な病巣を可視化する 1 つの平面にイメージを凝縮によって画像を取得できます。
      注: DSB 解像度または興味の蛋白質を選択した時点で見られない場合、決定 Dsb が最初の時点の広い範囲を選択することにより解決する場合 (0-48 h 投稿 DSB 誘導)。注目ポイントは、DSB 誘導法と関心の修復タンパク質によって異なります。
  10. 蛍光顕微鏡画像の核を定義するのに ImageJ フリーソフトを使用します。
    注: 顕微鏡画像を開くには、ImageJ でバイオ形式プラグインをインストールしなければなりません。
    1. ImageJ の「プラグイン」ツールバーから ImageJ ウィンドウに画像ファイルをドラッグすることによってまたは「バイオ フォーマット インポーター」を選択することによって共焦点画像 (.czi または .tif) を開きます。
      注:「バイオ形式インポート オプション」ウィンドウが表示されます。
    2. 構成 DAPI と蛍光画像「バイオ形式インポート オプション」ウィンドウ内に画像を分割する「分割チャンネル」を選択します。
    3. ドロップ ダウン メニューから「カラー オプション」で「発色」を選択します。DAPI を開き、ヒストン H2AX、"OK"を選択 (H2AX) イメージとして個別のウィンドウに、DAPI イメージを選択します。
    4. 「イメージ」ツールバーと核を選択する「しきい値を調整」オプションを選択します。
      注:「しきい値」ウィンドウが表示されます。
    5. イメージのしきい値を調整するには、完全に「しきい値」ウィンドウの下のバーを右にスライドします。核が明瞭な輪郭と背景黒で完全に赤く表示されるまでは、一番上のバーを調整します。選択して適用。「調整しきい値」ウィンドウを閉じます。
    6. 「分析」ツールバー「分析粒子」オプションを選択します。画面に表示される「分析粒子」ウィンドウを参照してください。
    7. 核の最小サイズを入力します。
      注: 入力サイズ以下の粒子は核としてはカウントされません。
    8. 「表示」ドロップ ダウン メニューから「アウトライン」を選択します。「マネージャーに追加」オプションをを選択します。「ROI マネージャー」ウィンドウ開くには"OK"をクリックしてします。
      注: 核の概要が別ウィンドウで表示されます。
    9. 「ROI マネージャー」ウィンドウから選択することができます核に番号を割り当てます。
  11. 蛍光顕微鏡画像で H2AX 巣を定量化するのに ImageJ を使用します。
    1. (蛍光共役二次抗体で染色)"H2AX"巣ウィンドウを選択します。「プロセス」ツールバーを選択し、、核内で巣を検索する「検索マキシマ」を選択します。
      注:「見つけるマキシマ」ウィンドウが開きます。
    2. 「出力の種類」のドロップ ダウン メニューから「シングル ポイント」オプションを選択し、、「プレビュー ポイントの選択」を選択マキシマ/巣を視覚化します。画像 (図 1) の蛍光強度に応じて「ノイズ耐性」の値を入力します。小さな黒い点と白いウィンドウの外観を確認します。
      注: これらのドットは、検出されている H2AX 巣/マキシマを表しています。ノイズ許容値は、分析対象のすべてのイメージのために一定に維持されなければなりません。低/高ノイズ耐性は核内であまりにも多くの/いくつかマキシマ (巣) を描くし、核内病巣の正確な表現はできません。
    3. 核「ROI マネージャー」ウィンドウから H2AX 巣を定量化する必要がありますを選択します。「すべて表示」オプションをチェックし、すべての核を選択します。
    4. 選択した核内でマキシマ/巣の数を測定する「測定」を選択します。
      注: マキシマ/巣の数が 255、すなわちの倍数として表示されます、1 つの最大値が 255 の「RawIntDen」(統合密度) を読む。
    5. "RawIntDen"の値をコピーして、データ分析用ソフトウェアを貼り付けること。

2. 長期的な二重鎖 DNA 切断するためのローカリゼーションの分析

  1. 96 ウェル プレート/coverslips 前述のセクション 1.1 と 1.2 での種子のセル。
  2. 二本鎖 DNA 切断の誘導
    1. メーカーの仕様によると脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた - SceI 発現ベクターを細胞を transfect します。エンドヌクレアーゼ表現を最大限にトランスフェクション後の 24-72 時間を待ちます。単数形の大きな核 γ H2AX フォーカスを持つセルを配置することによって、遺伝子導入が成功したかを確認します。
  3. 画像の取得
    1. 修正を permeabilize、ブロック、および 1.8 のセクションで説明されているように 96 ウェル プレート/coverslips を洗います。
    2. 共同 γ H2AX と関心の修復タンパク質に対する抗体と細胞を孵化させなさい (ここでは、RAD51 に対する主な抗体を使用) 3 %bsa 溶液の製造元の仕様に従って希釈します。
    3. 96 ウェル プレート/coverslips 1x PBS で 3 回洗います。96 ウェル プレート/coverslips を 3 %bsa 溶液で製造元のプロトコルに従って希釈した二次抗体とインキュベートします。セカンダリ fluorophores が重複する励起または発光スペクトルを持っていないことを確認します。
    4. 大規模な核 γ H2AX フォーカスされているセルを識別します。バイアスを避けるためにこれらの細胞の写真を撮るだけ。
  4. 長期的な SceI の解析による巣
    1. 大規模な γ H2AX 巣と関心の修復タンパク質の共局在の巣を持つ細胞数をカウントすることによって、手動で長期的な巣を分析します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図 1は、ImageJ を用いたマキシマ/巣定量化のため正しいノイズ差別の選択を示しています。DAPI のイメージをマージし、関心の修復タンパク質は、左のパネルにあります。図 1 aは 90 のノイズの識別を示していて、巣の正しい数をマークします。エッジ (ピンクの矢印で描かれている) (黄色の矢印で表示) 核外の巣で核は定量化の中にはカウントされません。図 1 bは、50 の低ノイズ耐性を示しています。多数のマキシマは、外核と内核に識別されます。図 1は、220 の高ノイズ耐性を示しています。単焦点 (白い矢印) だけが検出されました。読者の「正」と「負」結果意味を提供するには、典型的な結果を図 2にもまとめました。具体的には、

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA の分析損傷修理一般、二本鎖 DNA 切断の修復具体的には研究の活発な領域その結果基礎生物学6,20に腫瘍にまたがるため。この原稿の詳細14Dsb の修復タンパク質機能を解明するため正確に時間を楽しみ、このメソッドを介して Dsb の解像度に RAD51 と γ H2AX 蛋白質の貢献を暴き出すアプローチを使用できます。修復動態比較とノックアウト、興味の蛋白質と修理機械制御の細胞と細胞の間の誘導私 SceI Dsb の募集は募集、ローカリゼーション、そのタンパク質の貢献を定義し、Dsb の修復要因の解像度。

一般的に使用されるアプローチに比べていくつかの利点を持って修復動態を可視化します。頻繁に修理がアセンブリの動的過程と修理錯体の解離を表すことがない単一の時間ポイントで調査します。フル解像度の最初のライセンス認証から修理の完全な範囲を観察することにより、修理の遅れは完全に抑制として誤認されたないこと。逆に、その...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ジョエル Sanneman とによって、カンザス州立大学獣医学の大学、この手法を開発する努力の彼らのサポートのための資金を提供、共焦点顕微鏡コアの博士 Philine の Wangemann に感謝しますpCBASceI だったマリア Jasin (Addgene プラスミド # 26477) からの贈り物 30。U2OS DR GFP の細胞だったマリア Jasin18からの優しい贈り物です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12 mm カバースリップVWR89015-725
16% パラホルムアルデヒド (PFA)ThermoFisher Scientific28908
24 ウェルプレートVWR82050-892
96 ウェルガラス底板セルビスP96-1.5H-N
アンチ H2AX Alexa488EMD ミリポア05-636-AF488
アンチ Rad51 (D4B10) Cell Signaling Technology8875S
Bio-formats plugin for ImageJNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
ウシ血清アルブミン (BSA)VWR97061-416
DAPIThermoFisher ScientificD1306
DMEM, 高グルコースThermoFisher Scientific12100046
EDTAInvitrogen15576-028
ウシ胎児血清 (FBS)VWR89510-194
ヤギ抗ウサギIgG Alexa594サーモフィッシャーサイエンティフィ A-11012 
過酸化水素シグマ-Aldrich216763-100ML
ImageJ SoftwareNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
I-SCEI発現ベクターAddgene26477マ
ニキュア-インスタDriSally and HansenClearly Quick (103)
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Bio BasicPD8117
ProLong Gold Antifade ReagentLife TechnologiesP36930
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
トリプシン EDTASigma-AldrichT4049-500ML
ターボフェクト トランスフェクション試薬サーモフィッシャーサイエンティフィックR0531
Tween-20フィッシャーサイエンティフィBP337-500
ックック

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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