二本鎖 DNA 切断の修復は、病変を対処した後、休憩だけでなく、その解像度で修復複合体の形成だけではなくを必要とする動的なプロセスです。ここは、蛍光顕微鏡過渡的かつ長期的な二本鎖切断ツールとしてこのゲノム維持機構を解剖します。
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方法論記事
蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
DNA の二本鎖切断 (Dsb) の修理は非常に調整されたプロセス、形成し複数タンパク質の修復複合体の解像度が必要です。このプロセスは、関連付けを促進するタンパク質の無数およびこれらの病変に蛋白質の脱退によって規制されています。蛋白質の広大な図書館の機能画面を実行する能力に大部分のおかげで、二本鎖 DNA 切断の修復に必要な遺伝子のより深い理解があります。よくノックアウトまたは化学的阻害剤スクリーンは、DSB の修復に必要な蛋白質のマーカーとして高められた毒性を使用して修理プロセスに関与する蛋白質を識別します。識別する新規細胞タンパク質ゲノムの忠実性を維持に関与するに役立つ、機能解析が必要です興味の蛋白質は、ローカリゼーション、形成、または修復複合体の解像度を促進するかどうかの決定。
蛍光顕微鏡による、明瞭な核の巣として修理蛋白質の蓄積を容易に検出できます。したがって、DNA 損傷のサイトでこれらの蛋白質の加盟および脱退は、二本鎖 DNA 切断の誘導後代表的な間隔でこれらの核の巣を観察することによってアクセスできます。このアプローチは、修理欠陥が修理不完全な遅れに同時に発生しない場合も誤ローカライズされた修復因子蛋白質を識別できます。このシナリオでは、長期的な二重鎖 DNA 切断は細胞と酵素の認識部位が細胞のゲノムに統合されました珍しい切削エンドヌクレアーゼ (例えば、SceI) を表現することによって設計することができます。結果として得られる病変は特に忠実な修復酵素の認識部位、胸の谷間の別のラウンドをプロンプトを再導入すると解決するは難しい。その結果、修復の動態の違いが解消されます。修理錯体が形成されていない場合、ローカリゼーションは妨害されました。このプロトコルでは、修復反応として修復タンパク質の局在の変化を識別するために必要な方法について説明します。
概要
毎日、人間の体のあらゆる細胞は推定 10,000 殺到 DNA 病変1。この実存的な脅威は、セルと同様、突然変異、発癌のリスクが私たちを置く死。ゲノムの忠実性を保護するために哺乳類細胞は一連の複雑な蛋白質の関連付けと修正と DNA 損傷に対応するため進化してきた。この応答は、まとめて DNA 損傷応答 (DDR)2,3と呼ばれる、複数の経路に編成されます。DDR は、DNA 損傷、時間的、空間的調整で DNA 修理蛋白質の蓄積で構成されています。DDR はよく伝搬または破損した DNA2,4、5のレプリケーション中に発生する被害の激化を避けるために細胞周期の停止を誘導します。ターンも、修理が完了した後修理錯体の関連付けを解除によって細胞周期の停止をオフに細胞の生存のため必要です。
DNA 損傷の様々 な種類、Dsb は最も有害があります。Dsb の修復に失敗したは、染色体組換え誘発または全体の染色体腕の損失など大規模な削除につながります。Dsb の修復は 2 経路6,
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プロトコル
このプロトコルは U2OS セル - SceI 認識サイト18の書かれているのでご了承ください。セルは U2OS をする必要はありませんが、-SceI サイトを含める必要があります。プロトコルは、調整された (例えば、播種された細胞およびインキュベーション時間の数) にする必要があります使用される電池の種類に応じて。
1. DSB 修復複合体形成反応の定義
- 85-90% まで 10 cm 組織培養プレート上の U20S DRGFP のセル成長合流。
- メディアを取り外し、2 分のため EDTA の 3 mL の室温 (RT) で孵化させなさい。
- 1 mL のトリプシン EDTA に置き換えるし、5 分細胞が顕微鏡下で表示して板の表面から切り離されることを確認の 37 ° C で孵化させなさい。5 mL のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンとトリプシンを中和します。
- 細胞診断とトリパン ブルー排除法を使用してこの懸濁液中の濃度を決定します。
- シード 6 x 103細胞/ウェルのガラス底 96 ウェル プレートを 200 μ l 添加。また、12 mm coverslips に 8 mL の種子 4 x 10....
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結果
図 1は、ImageJ を用いたマキシマ/巣定量化のため正しいノイズ差別の選択を示しています。DAPI のイメージをマージし、関心の修復タンパク質は、左のパネルにあります。図 1 aは 90 のノイズの識別を示していて、巣の正しい数をマークします。エッジ (ピンクの矢印で描かれている) (黄色の矢印で表示) 核外の巣で核は定量化の中にはカウントされません。図 1 bは、50 の低ノイズ耐性を示しています。多数のマキシマは、外核と内核に識別されます。図 1は、220 の高ノイズ耐性を示しています。単焦点 (白い矢印) だけが検出されました。読者の「正」と「負」結果意味を提供するには、典型的な結果を図 2にもまとめました。具体的には、
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ディスカッション
DNA の分析損傷修理一般、二本鎖 DNA 切断の修復具体的には研究の活発な領域その結果基礎生物学6,20に腫瘍にまたがるため。この原稿の詳細14Dsb の修復タンパク質機能を解明するため正確に時間を楽しみ、このメソッドを介して Dsb の解像度に RAD51 と γ H2AX 蛋白質の貢献を暴き出すアプローチを使用できます。修復動態比較とノックアウト、興味の蛋白質と修理機械制御の細胞と細胞の間の誘導私 SceI Dsb の募集は募集、ローカリゼーション、そのタンパク質の貢献を定義し、Dsb の修復要因の解像度。
一般的に使用されるアプローチに比べていくつかの利点を持って修復動態を可視化します。頻繁に修理がアセンブリの動的過程と修理錯体の解離を表すことがない単一の時間ポイントで調査します。フル解像度の最初のライセンス認証から修理の完全な範囲を観察することにより、修理の遅れは完全に抑制として誤認されたないこと。逆に、その.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
ジョエル Sanneman とによって、カンザス州立大学獣医学の大学、この手法を開発する努力の彼らのサポートのための資金を提供、共焦点顕微鏡コアの博士 Philine の Wangemann に感謝しますpCBASceI だったマリア Jasin (Addgene プラスミド # 26477) からの贈り物 30。U2OS DR GFP の細胞だったマリア Jasin18からの優しい贈り物です。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 12 mm カバースリップ | VWR | 89015-725 | |
| 16% パラホルムアルデヒド (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24 ウェルプレート | VWR | 82050-892 | |
| 96 ウェルガラス底板 | セルビス | P96-1.5H-N | |
| アンチ H2AX Alexa488 | EMD ミリポア | 05-636-AF488 | |
| アンチ Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, 高グルコース | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| ヤギ抗ウサギIgG Alexa594 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | A-11012 | |
| 過酸化水素 | シグマ-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SCEI発現 | ベクターAddgene | 26477マ | |
| ニキュア-インスタDri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| トリプシン EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| ターボフェクト トランスフェクション試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | R0531 | |
| Tween-20 | フィッシャーサイエンティフィ | BP337-500 |
参考文献
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
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再版と許可
