Method Article

印刷された糖鎖の配列: 小動物対策炭水化物抗体のレパートリーの分析のための高感度な技術

DOI:

10.3791/57662

⸱

February 14th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、小動物の反炭水化物抗体の解析のための印刷された糖鎖アレイ (PGA) 技術の可能性を示しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与えられた個々 の反炭水化物抗体のレパートリーはその免疫学的状態に関連付けられます。個々 の免疫状態は内部および外部の潜在的な脅威信号との闘いにおける成功を決定するだけでなく、循環抗糖鎖抗体 (とその血清学的変動) の特定のパターンの存在がありますが、発症と特定の病理学の条件の進行の重要なマーカーは。ここでは、非常に高い感度で糖鎖ターゲットの数百を測定する機会を提供する糖鎖アレイ PGA の印刷ベースの方法論について述べるサンプルは一般的な制限の場合小さな動物の最小限の量を使用 (ラット、マウス、ハムスター、等)、人間の病気の側面に対処するモデルとして使用されます。このアプローチの代表的な例として BALB/c マウスで自然の抗糖鎖抗体のレパートリーの解析から得られた結果を示す.各 BALB/c マウス遺伝的同一と同じ条件の下で維持されているにもかかわらず、研究に関与するが反炭水化物に対する自然抗体の特定のパターンを開発することを示す.この作品は、PGA レパートリー (特異性) を調査する技術の使用および反炭水化物抗体、健康と、病的な状態の間の両方のレベルを展開する主張します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

抗体は直接活性化補体システム4,5ウイルス1,2と細菌2,3、中和することにより病原体の侵入に対して我々 の防衛で中心的な役割を再生します。貪食6の強化。また、彼らが癌と悪性細胞7および恒常性維持8,9の除去に不可欠な要素です。

免疫系の疾患は、自己免疫疾患および炎症性疾患10と癌11で起因できます。すべてのこれらの病理学の条件は理想的に効率的な治療のための迅速な診断を要求します。自己免疫疾患の場合は、ほとんどの場合の自己抗体の血清学的存在、自己免疫10,12の診断予測です。これらの抗体反応細胞表面と細胞外抗原と、彼らは、自己免疫疾患10,12のプレゼンテーションの前に多くの年のために存在。免疫不全と癌も診断される血液検査でどちらかが免疫抗体、または彼らの機能活動11などのレベルを測定します。

抗体とその血清学的レベルの循環のレパートリーの同定は、予後を設定し、前述の病理学の条件のすべての進行を評価する最優先されます。我々 は以前の血清サンプルの大量の使用を最小限に抑え、問題を回避するを PGA 動物種13-16、抗体の解析手法の可能性に示しています。抗体の交差反応性17と抗体15の豊富なレパートリーの可能高スループット プロファイルに関連付けられています。

糖鎖を用いたイムノアッセイが主に、他の要因によって調節起源と親和性と配位子15,18,19,20 のバインディングを決定する炭水化物の生産、21。懸濁液 (微粒子)15,21,22またはフラット アクティブ面15,21,22、糖鎖を用いたイムノアッセイを開発ことができます。 23,24。最後には、elisa 法 (これらのメソッドのほとんどの従来) と PGA が含まれます。同じ実験の設定15,25,26,27でこれらの方法を比較する多くのデータがないです。我々 は以前有効性と個々 のひと血漿サンプル15抗糖鎖抗体をプロファイルにこれらの免疫性を比較しています。それらターゲットの抗 A/B 血液型など、いくつかの抗体のためすべてのイムノアッセイ統計的有意性それらを検出可能性があります、彼らは積極的に15、18,21に互いに関連付け。一方、抗 P1 抗体は主に高い識別能力と PGA によって検出された、異なる糖鎖を用いたイムノアッセイ15,18,によって行われた決定に相関は認められなかった21. 方法のこれらの違い主に抗体/抗原の比と糖鎖の向き15に関連していた。ELISA および懸濁液の配列は、これらの方法15の抗体に対する抗原の超過があるので PGA より不明確な結合の影響を受けやすい。また、PGA の糖鎖の向きは ELISA とサスペンション アレイ15よりも制限されています。ELISA は、研究には糖鎖の限られたパネルが含まれている場合に便利です。サスペンション アレイ ELISA アッセイの再構成に関する広範な柔軟性を提供します。PGA は、発見のアプローチ15,18,21,28非常に便利です。にもかかわらず、これらの明確な長所と短所、糖鎖抗体の相互作用のさまざまな側面を研究する 3 つの述べられたイムノアッセイを使用できます。研究の最終目標は、1 つがより適切な手法の選択をご案内いたします。

現在目指している小動物の抗糖鎖抗体のレパートリーの分析のための PGA の技術の使用を拡張します。代表的な結果として提案はここで PGA で大人の BALB/c マウスで抗炭水化物に対する自然抗体のレパートリーを評価するために詳細なプロトコル

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Glycochips 生産

  1. マイクロ アレイ作製
    1. 糖鎖 (50 mM) を印刷し、多糖類 (10 μ G/ml) 300 mM リン酸 6 でバッファリングされた生理食塩水 (PBS、pH 8.5) 複製を使用して、N ヒドロキシスクシンイミド誘導体のガラス スライド上に非接触ロボット arrayer (ドロップ ボリューム ~ 900 pL)。各スライドには、6 回繰り返されます (図 1 a色で) のサブ配列の 4 の異なるブロックが含まれています。すべての単一のサブ配列はコントロール (8 行 × 14 列) を含む 112 の異なる糖鎖スポットによって形成される (図 1 b)。
      注: 糖鎖関連の情報は、補足表 1で提供されます。印刷のマイクロ チップに使用される糖ライブラリは IBCh チームの長期的な合成の努力の結果合成の例を関連出版物29,30,31,32,33,34,35,36 で説明します。 ,,3738。糖鎖のライブラリには、血液型抗原とターミナルのオリゴ糖として N ・ O リンクの哺乳類の糖タンパク質や糖脂質、炭水化物の腫瘍関連抗原のコアのモチーフを頻繁に出現するほとんどのいくつかが含まれていて、病原性細菌の多糖類。
    2. インキュベート ボックス水分 (湿度約 70%) のスライド1 時間室温 (25 ° C) で
    3. ブロックのマイクロ アレイ: 常温 (ホウ酸 100 ミリメートル、25 ミリメートル エタノールアミン、0.2% (v/v) 純水トゥイーン 20) ブロック バッファーで 1.5 h のスライドを孵化させなさい。
    4. 超純水 glycochip を洗浄し、空気で乾燥します。
  2. Glycochip 品質管理
    1. 複雑な免疫グロブリン製剤 (CIP、IgG, IgM, IgA を含む) の 1 mg/mL の溶液を使用して各バッチから 2 つのマイクロ アレイの分析二次抗体 (IgM + IgG + 伊賀) としてビオチン標識ヤギ抗ひと免疫グロブリンの 10 μ g/mL の溶液に続いて 1 μ G/ml対応する蛍光ストレプトアビジン共役のソリューション (以下プロトコル経由でステップ 2 を参照してください)。
    2. スキャンし、glycochips (3 糖鎖アレイの解析の手順を参照) を分析します。
    3. 内間マルチチップ相関 0.9 以上でマイクロ アレイのバッチを使用します。

2. 糖鎖アレイ技術

  1. (超純水) で次の水溶液を準備、室温 (25 ° C) でそれらを格納します。
    • バッファー-1: 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS, 1% (v/v) Tween 20 と 0.01% (w/v) ナン3
    • バッファー 2: 1% (w/v) BSA PBS で、0.1% (v/v) Tween 20 と 0.01% (w/v) ナン3。
    • バッファー-3: 0.1% (v/v) トゥイーン 20 PBS で。
    • バッファー-4: 0.001% (v/v) トゥイーン 20 PBS で。
  2. Glycochip およびサンプル準備
    1. 室温 (25 ° C) に到達するまで、テーブルの上のスライド付き収納ボックスを置きます。
      注: 使用、ラテックス パウダー フリー手袋です。Glycochip は、バーコードがある、スライド ガラスの下の部分で操作する必要があります。バーコードは、右側には、糖が印刷された表面が付いている接触を避けることを識別するために役立ちます。
    2. ボックスを開き、glycochip を取る既にろ紙と室内湿度を一定に保つ調節インキュベーション室 (25 ° C) に配置します。
    3. 一方、1.5 mL チューブのバッファー 1 (1:20) とマウス血清を希釈します。血清ソリューションを均質化 (5 s) 渦のミキサー。
      注: 単一 glycochip 表面を完全にカバーするために必要なボリュームは、約 1 mL です。
    4. 均質化後、希釈血清免疫グロブリン凝集を避けるために水浴中で 10 分間 37 ° c をインキュベートします。10,000 x g および 25 ° C で 3 分間チューブを遠心上清を収集し、任意の沈殿させた材料を破棄します。
    5. 培養室で慎重に glycochip の場所。それを glycochip の表面に任意の残留物質を除去するためにバッファー 3 の 1 ml 25 ° C で 15 分間インキュベートします。
    6. 縦位置で、glycochip を押し、バッファー 3 プラスチック パスツール ピペットを使用してのいくつかの滴を洗い直します。ろ紙を使用して glycochip 表面からバッファーを慎重に取り外します。
  3. 結合反応: 抗体
    1. インキュベーション室に、glycochip を配置します。希釈血清サンプルをマイクロ ピペットを使用して glycochip の表面に します。撹拌軌道 1.5 h. glycochip 表面のすべての乾燥地帯が、ピペットの先端を使用して希釈血清サンプルで覆われていることを確認の 37 ° c (30 rpm) で孵化させなさい。
    2. 任意の余分なサンプルを削除し、25 ° C でバッファー 3 で 5 分の glycochip を浸すバッファー 4 (5 分) が付いている容器に、glycochip を移動し、最後に (5 分) 超純水 glycochip を洗います。175 x g と液体を削除する 25 の ° C で 1 分の glycochip を遠心します。
  4. 検出: 二次抗体
    1. インキュベーション室に、glycochip を配置します。ヤギ抗マウス (IgG + IgM) バッファー 2 でビオチンに活用のソリューション (5 μ g/mL) glycochip 表面に広がってください。軌道撹拌 (30 rpm) 37 ° C で 1 時間で孵化させなさい。
    2. 非連結の一部を取り外して、洗浄の手順を繰り返します。
    3. 遠心分離後に、、(バッファー-2) で対応する螢光色素標識ストレプトアビジン溶液 2 μ g/mL と 45 分 (30 rpm) 25 ° C で暗闇の中で、glycochip を孵化させなさい。
    4. 暗闇の中で非連結の一部を削除し、洗浄のステップを繰り返します。
    5. 空気で、glycochip を乾燥します。
      注: Glycochip をできるだけ早くスキャンする必要があります。しかし、染色後すぐにスキャンはできない場合は、glycochips は、暗闇の中で涼しい乾燥した場所に格納できます。

3. 糖鎖アレイの解析

  1. 配列をスキャンします。
    1. 暗闇の中で部屋の温度に達するまでは、テーブルの上、glycochip を残してください。同じ時間でスライド スキャナーとレーザーをオンに (励起波長 633 nm)。
    2. マイクロ アレイを持って、スロットに差し込みます、glycochip、それが背中に触れるまで。
    3. (「実行簡単スキャン」)、glycochip をスキャンして保存するスキャン方法を」.TIFF」ファイルです。
  2. 配列の定量化
    1. ScanArray 解析システムを使用して、配列を定量化します。メイン ウィンドウ (図 1B-D)「構成とファイル グループ」の「ファイル」をクリックして開く以前にスキャンされたイメージ
    2. ギャル形式 (スライド ガラスに印刷された糖鎖の処分) に対応する配列ファイル テンプレートを読み込みます (図 1)。
    3. 慎重にイメージの中の斑点を持つ配列 (グリッド) を合わせ、GAL テンプレートを調整し、定量化 (図 1) を開始します。
    4. 数量パラメーターを選択します。
      • 数量の種類: 実行簡単クワント。
      • 定量化手法: サークルを固定
      • スポットを自動検出: すべてのオプションのアイコンをクリックして
      • 正規化法: LOWESS (局所的重み付け散布図の平滑化プロット)。
    5. 定量化されたデータとして保存"。CSV」ファイル (図 1)。Microsoft Excel または別の適切なアプリケーションを使用して一般的なスプレッドシート ファイルにこのデータを転送します。
    6. 主な統計手法として四分範囲 (IQR) を使用: 各リガンドと四分位偏差に対するすべての信号の中央値 (四分位数 2) の計算 (75 と 25 百分位数、または第 3 四半期と第 1 四半期、上部と下部四分位数それぞれ)。
    7. 階層的クラスタ リングのエクスプ ローラー アプリケーションを使用してデータのインタラクティブな探査を実行します。
    8. パラメーターをクラスター化の使用: 平均リンケージ (UPGMA) との類似性としてユークリッド距離距離測定。正規化なしの行階層的クラスタ リングを実行します。

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Results

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20 BALB/c マウスの人口の自然な抗糖鎖抗体のレパートリーの定量化から得られた代表的な結果の概要を紹介します。本研究で使用される glycochips には、419 の異なる糖鎖構造が含まれています。CH としてほとんどの糖鎖が合成された2チャンネル2チャンネル2NH2スペーサー武装O-CH2CH2NH2または - NHCOCH2NH2配糖体としていくつかのケースでの配糖体。すべての糖鎖構造が高解像度によって特徴付けられる (700 - または 800 MHz) NMR 分光法、精製、hplc では、テストを示す、> 95% の高純度。我々 は IgM を同時に決定した + IgG 抗糖鎖抗体マウス血清量制限があるため。抗体の結合 (この値はトップの糖鎖 RFU の ~ 10%) の肯定的な信号として、PGA は 4,000 RFU の上の値と見な...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

糖鎖マイクロ アレイ40タンパク質糖鎖の相互作用を研究するための不可欠なツールとなっています。現在の仕事では、PGA BALB/c マウスにおける抗体の抗糖の循環のレパートリーを勉強する技術に基づくプロトコルについて説明します。PGA 画面多数不明な生物学的糖鎖の可能性を提供しています, ので、非常に便利な発見ツール13,15,28です。提案手法では、血清サンプル (50 μ L) の減らされた量を用いた糖鎖構造の何百もの同じ実験的設定で、測定する可能性を提供しています。これは小動物 (ほとんど循環血液量) の場合、または同じ実験動物から血の数回を抽出する必要があるときに特に重要です。

ここで示した代表的な結果として遺伝的に同一のマウスは、免疫学的同等; として見なすべきでないこと彼らは自然な反炭水化物抗体 (12 のみの糖鎖特異性が保存されていた)...

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Disclosures

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Nailya KhasbiullinaSemiotik LLC は、この研究で使用される glycochips のサプライヤーの従業員であるアレクセイ ・ Nokel と。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は「フォンド ・ デ ・研究 Sanitarias」によって支えられた (FIS) はカルロス III 健康研究所、スペイン保健省から PI13/01098 を付与。DB G だった欧州連合第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) 付与契約 603049 (TRANSLINK) の下で資金を供給されるポスドク研究の位置から寄与しました。NK、NS と NB の仕事はロシアの科学財団の補助金 #14-50-00131 によって支えられました。DB G は、統計分析の支援のためのアレキサンダー Rakitko と優れたテクニカル サポート アナ Sanchis J. パブロ サルバドール マルタ ブロトに感謝の意を表現したいです。支援を受けて、"Pla de Doctorats 工業デ ラ事務局 d'Universitats 私 Recerca デル Departament d'Empresa 私 Coneixement デ ラ ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ (数 2018 を許可・ ディ ・ 021)。我々 はセルサ プログラムに感謝/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ機関サポートのため。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗体
ビオチン化ヤギ抗ヒトIgsThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USARef. #: 31782
ビオチン化ヤギ抗マウスIgM + IgGサーモフィッシャーサイエンティフィックRef. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYERS5 Scienion AG, Berlin, Germanyhttp://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber)Simport, Beloeil, QC, CanadaRef. #: M920-2
CentrifugeEppendorf, Hamburg, Germany Ref. #: 5810 R
PipettesGilson, Middleton, WI,
スライドスキャナー PerkinElmer, Waltham, MA, USAScanArray GX Plus 
振盪インキュベーターCole-Parmer, Staffordshire, UKRef. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice seraThis paperN/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP)Immuno-Gem, Moscow, Russiahttp://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
化学薬品、試薬、糖鎖 
糖鎖図書館Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, RussiaN/ A
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Ref. #: A9418
エタノールアミンSigma-AldrichRef. #: 411000
Tween-20Merck Chemicals &Life Science S.A., Madrid, SpainRef. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS)VWR International Eurolab S.L, Barcelona, SpainRef. #: E404
Sodium azideSigma-AldrichRef. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate サーモフィッシャーサイエンティフィックRef. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugateGE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UKRef. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H Schott-Nexterion, Jena, GermanyRef. #: 1070936
Whatman 濾紙 Sigma-AldrichRef. #: WHA10347509
1.5 mLチューブエッペンドルフ 参考 #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis SystemPerkinElmerhttp://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer applicationUniversity of Maryland, MD, USAhttp://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
USA http://www.gilson.com/en/Pipette/

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