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方法論記事

人工呼吸器関連および院内の細菌性肺炎のマウスの咽頭吸引モデル

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DOI:

10.3791/57672

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2018年6月28日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, LAC+USC Medical Center

この記事について

サマリー

感染性肺炎は人間の最も一般的な感染症の一つです。生体内で適切なモデルは、疾患病態の理解と治療の有効性をテストに不可欠です。このマウスの咽頭吸引性肺炎モデル病態とこれらの致命的な感染症に対する新しい治療法を調べることが 1 つ。

要約

マウス感染モデルは、病気の発症を理解し、原因となる病原体と戦うために設計された治療の有効性をテストのために重要です。伝染性肺炎はクリニックで患者によって提示される最も一般的な感染症の中で、したがって生体内で適切なモデルを保証します。典型的な肺炎モデルを使用して、ターゲットを合併症と副鼻腔炎、胃炎、腸炎、物理的な外傷または微粒子エアロゾルを模倣する噴霧などの症状を引き起こす肺の外の過剰な生物を預金鼻腔内接種ウイルスや結核性、真菌性肺炎のより典型的なスプレッド。これらのモデルは、コミュニティ- または医療取得の典型的な細菌性肺炎の病態を正確に反映しません。対照的に、この咽頭誤嚥性肺炎マウスモデルはヘルスケア市中肺炎における液滴ルートを模倣します。麻酔下のマウスの中咽頭に懸濁液 50 μ L の細菌を接種再帰誤嚥、肺炎の結果が発生します。このモデルでは、1 つは肺炎の原因となる病原体とこれらの病気と闘うための新しい治療法の病因を調べることができます。

概要

下部呼吸器感染症は世界最悪の伝染病および開発途上国1の死の最も一般的な原因です。世界的に、これらの感染症は以上 320 万の死1を占めています。さらに、院内肺炎医療取得感染の最も一般的な致命的な形態の間では、最も耐性病原体2,3によって引き起こされます。両方コミュニティ-取得肺炎および院内肺炎の買収の一般的なルートは、肺胞に咽頭内容の吸引です。多くの場合これらの病気を研究するために使用マウスのモデル鼻腔内接種4を使用オフのターゲット合併症と副鼻腔炎と物理的な外傷、病気と合同であるような症状を引き起こす肺の外の細菌の大部分を入金モデルだった人間の進行をエミュレートするように設計。他のモデルは、micromisting デバイスより正確に模倣するウイルス、結核性、および真菌性肺炎が、典型的な細菌性肺炎のための獲得の通常のルートを正確に要約できない吸入室を使用できます。

マウスの咽頭吸引性肺炎モデルは自然なルートと細菌性肺炎の病態をシミュレートするために利用されるかもしれない。接種した 50 μ L ピペットを使用して麻酔下のマウスの中咽頭に細菌懸濁液、によって伝染性肺炎の結果再帰吸引はすさまじい。このモデルを使用して、1 つは肺炎の原因となる病原体と人間にみられる誤嚥肺炎感染症に類似したより高い忠実度モデルこれらの疾病と戦うための新しい治療法の病態を調べることができます。さらに、口腔内5,6を介して感染する同様のモデルとは異なりこのモデルでは、完全菌それはオフサイトの炎症、感染症、胃炎などを引き起こすことができる腸ではなく肺に達すると腸炎。最後に、喉頭鏡を必要とし、気管7まで再接種別のパブリッシュされたモデルとは異なり、このモデルは強制経口投与針で気道を妨げない、接種配信の注射は必要ありません。代わりに、接種はマウスの自然吸引反射に依存しています。

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プロトコル

動物を含むすべてのプロシージャは、研究員の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認される必要があります。

1. 菌の準備

  1. 細菌のコロニーを分離します。
    1. 適切な滅菌寒天培地 (例えば、トリプシン大豆寒天)、上 (例えば、 A. baumannii "HUMC1") 菌株の連勝されて隔離されたコロニーを生成するように注意してください。
    2. 適切な条件 (例えば、37 ° C で一晩) で孵化させなさい。
  2. 一晩文化を育てます。
    1. 代表、寒天培地の滅菌接種ループから隔離されたコロニーを選択し、適切な滅菌流体培養基媒体 (例えば、トリプシン醤油スープ) 10 mL を接種します。
    2. 適切な条件 (例えば、ベント キャップ、50 mL コニカル バイアルで一晩 200 rpm で振とうしながら 37 ° C) で静止した段階に到達するサンプルを許可します。
  3. サブカルチャーを成長します。
    1. 一晩かけて培養の 100 μ L をピペットを使用して新鮮な滅菌液 10 mL に転送します。
    2. 適切な条件 (例えば、ベント キャップ、50 mL コニカル瓶で 3 h の 200 rpm で振とうしながら 37 ° C) で指数/ログ フェーズに到達することができます。
  4. サブカルチャーを洗います。
    1. サブカルチャーをインキュベーター環境から削除します。
    2. 細菌を餌に 5 分間、4,000 × g で遠心分離機します。
    3. 吸引し、上澄みを廃棄します。
    4. ペレットと完全に再停止されるまで精力的に渦に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加します。
    5. 3 洗浄の合計に対して手順 1.4.2 - 1.4.4 を 2 回、繰り返します。
  5. 細菌懸濁液の濃度を調整します。
    1. 600 の光学濃度を測定する分光光度計を用いた nm (外径600) 細菌懸濁液の光学密度を測定します。
    2. 滅菌 PBS 細菌懸濁液接種の光学密度低下 0.5、外径 φ600までを使用して追加、式 C私× V私=f× Vf濃度、"C"、"V"は、「私」のボリューム初期は、「f」は最終的な。* Cf常に 0.5;Vfは解決する変数です。
    3. 細菌懸濁液が 0.5 の OD600を下回った場合は、細菌を餌し、0.5 の OD600に到達する上清の適切な量を削除する 5 分間 4,000 × g で遠心分離機します。
    4. (例えば、1 × 10-6を達成するために 3 つの 1: 100 希釈) 滅菌 PBS のシリアル希薄を実行とコロニー形成細菌の濃度を明らかに相関係数を決定するための滅菌寒天プレート (CFUs/mL) あたりの単位0.5 の600を OD。
      注: この相関係数の値それぞれの種ごとのひずみによってさまざまですが、感染の接種材料の準備の前に決定する必要があります。
    5. 相関係数を決定した後使用して接種目的濃度 (例えば、2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL);目的菌の OD600 0.5 より大きい場合は、細菌をペレットし、目的の濃度に到達する上清の適切な量を削除する 5 分間 4,000 × g で細菌懸濁液を遠心します。
    6. 生体内でこれらの値には同じ種の細菌分離株と異なる遺伝背景のマウスが異なります各系統マウスの各細菌分離株の病原性を判断するためのパイロット研究を実行します。様々 なグラム陰性菌種特定の菌株が低い接種で致命的なマウス LD100 1 5 × 108 CFUs/マウスでは一般に。
  6. (省略可能) 以前に公開された8として、オンデマンド、正確な接種として将来使用のため同じ因数を凍結します。
    1. 2 500 mL コニカル バイアル、4,000 × g で 5 分間遠心し、上記転送として菌の 1 L を準備します。
    2. 各円錐バイアルから上澄みの 450 mL を破棄し、残りの上清中の細菌のペレットを再懸濁します。
    3. 電磁攪拌棒を含む 250 mL のビーカーに集中して菌を転送し、継続的に 300 rpm で攪拌板の上にミックスします。
    4. 慎重に集中して菌を (例えば、1 × 1010 CFUs/mL) のまさに 600 μ L を転送滅菌 H2O の丁度 300 μ L と 300 を含む 1.6 mL セラムにピペットを使用して滅菌グリセリン; μ L混合し、-80 ° C で保存
      注: ストレージに必要なグリセロールに実験結果を混同でき余分な死亡率を引き起こすので、洗い流す必要があります。
    5. 使用する準備ができたら、室温で 10 分間のサンプルを解凍します。
    6. 1 mL を 50 mL のコニカル バイアルに転送、細菌を餌に 5 分間、4,000 × g で 9 mL の滅菌 PBS と遠心分離機を追加します。上清を吸引し、感染接種目的濃度に到達する PBS の適切なボリュームで CFUs (1 mL × 冷凍ストック濃度 CFUs/mL) のあらかじめ決められた数量を再懸濁します。

2. マウスの麻酔

  1. ケタミン ・ キシラジン
    注: ケタミン ・ キシラジンの併用麻酔は長い期間、新しいマウスを目覚めさせる前に接種手順を実行するこの方法では、研究者のための十分な時間を提供しています。
    1. Pharmaceutifcal グレード、PBS 100 mg/mL ケタミン原液 1 mL 8.5 mL を組み合わせることにより注射液 10 mL を準備 (最終濃度 10 mg/mL)、および 20 mg/mL キシラジン原液 0.5 mL (最終濃度 10 mg/mL)。
    2. 腹腔内 (IP) 注入 (例えば25 g マウスの 250 μ L) による 10 μ L/g を管理します。
    3. 彼らの目は、長時間にわたって麻酔中の損傷になりやすいためケタミン ・ キシラジン麻酔マウスの目に眼軟膏を適用されます。
    4. ケージの中にマウスを置くし、麻酔から覚めるまで監視します。
      注: 動物残さないように無人までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。
  2. イソフルラン
    注: マウスすばやくからウェイク アップ イソフルラン麻酔麻酔のこのメソッドは、接種手順の達人になる後のみ使用する必要がありますので誘導室から削除されました。
    1. 適切なサイズの誘導の部屋に酸素が流れる素朴なマウスを配置します。
    2. 商工会議所はシャット ダウン シール、後麻酔精度の気化器を使用して少なくとも 5 分; 4% (v/v) イソフルランを追加するマウス誘導室からマウスを削除し、麻酔から覚める時間を測定して、麻酔を確認 (〜 60 s)。
      注: は、制度のガイドラインに基づいて麻酔時間が異なる場合があり、いくつかの動物が 5 分以上になる完全に麻酔を必要があります注意してください。
    3. 2-3% にイソフルラン麻酔濃度を調整することで 10 分程度の麻酔を維持します。麻酔の合計期間が場合 > 15 分、麻酔下のマウスの目に眼軟膏を塗る。
    4. ケージの中にマウスを置くし、ステップ 2.1 のように、麻酔から覚めるまで監視します。

3. 接種/感染マウス

  1. 麻酔下のマウスを中断、約 2 回マウスのボディの長さ (例えば、20 cm) 営業の表面 (例えば上高さに固定オブジェクトにセキュリティで保護 (例えばデンタルフロス) 強い、薄い文字列にそのトップの切歯で掛かっています。、実験室ベンチ)。
  2. マウスの生殖不能、鈍終了鉗子を使用して口から舌をゆっくり引き抜きます。偶発的なマウスの舌の圧潰を防ぐために滅菌、手袋をはめた指に舌を転送します。口、咽頭へのアクセスを許可する側に接種の嚥下を防ぐ外舌を保持します。
  3. マウスの舌を押しながら; マイクロ ピペットを使用して咽頭に 50 μ L 接種 (細菌懸濁液) を配置します。中咽頭は、口腔内および咽頭口の後方の交差点に位置します。
    注: のみ、マイクロ ピペットの最初のピット ストップにピペッティングして液体を提供する非常に重要です。マウスは接種を咽頭にある; に配置するとき、数秒間の呼吸を停止します。最終的には、再帰の誤嚥は、肺炎感染の結果、肺に入る液体の特徴的なパチパチ ノイズによって示される、細菌懸濁液を吸い込むには、マウスになります。
  4. 接種は遠くに配置されていない場合はバックアップ口と接種の後続の吸入を介して再帰吸引を強制的に鉗子で鼻孔をつまんで、通常呼吸をブロックするのに十分です。
  5. 接種後、舌をリリース、懸濁液文字列から、マウスを削除、ケージに配置ステップ 2.1 のように、麻酔から覚めるまで監視します。

4. 病気の進行の監視

メモ: 動物の苦しみ、ため様々 な指標は、使用マウスに瀕死の状態になることを示すため安楽死は、以前に承認された IACUC プロトコルに従って、この決定に従い実行されます必要があります。moribundity の様々 なマーカーは、体温、体重減少、外観、歩行、および血 (例えば、 istat コード経由)9,10、11,12から得られる他のバイオ マーカー 13,14,,1516。

  1. 以前に承認された IACUC プロトコル (例えばCO2頚部転位続いて) に従ってマウスを安楽死させます。
  2. 肺を安楽死させたマウスから気管、肺動脈、肺の近く肺静脈を切断することによって削除します。
    1. 顕微鏡
      1. 試験片金型で肺 (またはその一部) を配置します。
      2. 最適な切削温度 (O.C.T.) の化合物は、組織を完全に水没試験片金型を入力します。
      3. -80 ° C でサンプルを凍結します。
      4. セクションおよび顕微鏡検査のためのスライド マウントに病理学研究室にサンプルを送る。
    2. 細菌の負担
      1. 肺組織の分析用天秤で重量を量る。
      2. 50 mL コニカル バイアル 2 5 mL (組織のサイズ) に応じて滅菌 PBS の肺組織に転送します。
      3. 組織ホモジナイザーを用いた肺組織をホモジナイズしてください。
      4. 約 1,000 CFUs/mL、肺で予想される細菌負荷に基づいてを達成するために滅菌 PBS の磨砕液のシリアル希薄を実行します。
        1. たとえば、1 × 109 CFUs/mg が予想される場合は、3 1: 100 希釈を実行: 9.9 mL PBS と渦に磨砕液の転送 100 μ Lこれは、最初の 1: 100 希釈です。最初の 1: 100 希釈の 100 μ L を PBS と渦の 9.9 mL に転送します。これは、2 番目の 1: 100 希釈です。PBS の渦; 9.9 mL に 2 番目の 1: 100 希釈の 100 μ L を転送します。これは 3 番目と最後の 1: 100 希釈です。
        2. 肺の細菌の負荷が既知の場合は、予想の範囲をキャプチャする希釈の範囲を実行します。
      5. 滅菌の寒天プレート dilution(s)。
        1. 滅菌トリプシン大豆スープ (TSB) 寒天 (TSA) と準備: 結合 TSB の 30 g、寒天 15 g、1 L の水、磁気攪拌器、混ぜて、5 分クールなと液体のサイクル 15 分に冷却できるようにするために、オートクレーブをできるようにするための ~ 100 ° C で沸騰するまで加熱 〜55 ° C、転送 10 mL たてオートクレーブ滅菌シャーレ、TSA、部屋の温度に冷却すること。2-5 d または卓上乾燥やバイオ セーフティ キャビネット 10 分の下で発見できます。
        2. 滅菌 TSA を含むシャーレに 100 μ L の希釈を転送し、スプレッダやガラス ビーズを用いた TSA にまたがってください。
        3. 加湿のインキュベーター (すなわち水で満たされた発見の 1 L ビーカーを含む 37 ° C の定温器) で 37 ° C で一晩シャーレを格納します。
      6. 寒天めっきに基づく CFUs/mL 肺乳剤を決定 (例えば、TSA 板上を上記 3 番目と最後の希釈 100 μ 100 CFUs となります 100 CFUs/100 μ L × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109CFUs/mL)。
      7. Mg 肺組織/mL のホモジネート (例えば、上記サンプルを使用して 100 mg の PBS、1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg/5 mL = 5 × 107 5 mL で均質化された肺組織の場合による CFUs/mL 肺乳剤を割ることによって基づく CFUs/mg 肺組織を計算します。CFUs/mg)。

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結果

プロトコルに慎重に従うことによって、再現性と信頼性の高いデータを簡単に取得できます。1 互いに比較する実験のためのカスタマイズされた接種準備プロトコルを厳密に遵守するが重要です。また、感染中にマウスを適切に処理することが重要です。必ず欠いてイソフルラン麻酔室にマウスを配置してください。マウスは事前イソフルランで満たされている室に配置した場合はパニックし、実験結果を損なうことができます可能性が余分なストレスがあります。容器蓋を確保した後ゆっくりと 0% から 4% (v/v); その濃度を段階的に増加によるイソフルランを紹介します。急いでイソフルランの管理に、パニックにマウスもあります。マウスが無意識になると、2-3% (v/v) にイソフルラン麻酔濃度を削減し、追加数分の商工会議所で維持できるようにします。この時点で、マウスがする準備ができている (図 1) を感染しています。

麻酔室からマウ...

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ディスカッション

確かに、マウスは、ミニチュアの人間ではないです。マウス モデルから得られた結果をコンテキストでみなされておりその後の違いと 2 種6間の類似性に基づく人間への適用性の解釈する必要があります。それはまたとして適切なマウスの歪みを選択することが重要あるが他の人よりもいくつかの感染症の影響を受けやすい選択16の病原体の歪みも同様です。

厳格な再現性の高い方法で感染を行うために不可欠です。接種は、マウス 1 つの値ではまだその値の 90% も無害に致命的なことができます。したがって、特に接種の準備、感染するときは、正確な同じ方法でこのプロトコルに記載されているすべての条件を再現してが不可欠です。さらに、それぞれの病原体は、ユニークな菌で病気になります。したがって、マウスのそれぞれの株、病原体の各緊張に適切な接種を決定するためのパイロット実験を行うことが必要です。

グラム陰性菌、≤5 × 108 CFUs/マウスの菌は病...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、国立研究所のアレルギーと感染症国立衛生研究 [許可番号 R01 AI117211、R01 AI130060、R21 AI127954、BS に R42 AI106375] と米国食品医薬品局 [契約によって支えられました。BML に HHSF223201710199C]。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天214530TSBと組み合わせてTSA
ビーズ、ホウケイ酸ガラスキンブル135003各使用前にベーキングまたはオートクレーブで滅菌
ビーカー、250mLパイレックス1003濃縮細菌接種液の正確な分注中に使用
遠心分離SorvallST 40R 4,000回可能;4°Cのg;
麻酔用Cチャンバーケント・サイエンティフィック・コーポレーションVetFlo-0720最大5
クライオモールド、中型Sakura Tissue-Tek4566使い捨てビニール試料型、15回;15回;5 mm
歯科用フロスOral-B37000469537テーブルの高さから約6インチの安定したポストに結びつく
鉗子VWR82027-440口から舌を優しく引き出すために使用されます
肺組織用ホモジナイザーオムニインターナショナルTM125-115初めて使用する前にオートクレーブ; サンプル間をすすぎます
用イソフルランアボット10015516代替薬を使用することができます。それに応じて手順を変更する
iSTATカートリッジAbbott03P79-25さまざまなカートリッジは、あなたのニーズに合わせて利用可能
ケタミン、100 mg/mL西洋医学供給4165PBSで1:10を1 mg / mLに希釈し、1 mg / mLでキシラジンと組み合わせる
目のための軟膏Akornの涙 リニューアルディスペンサーの先端で目に触れることを避け
最適な切断温度(O.C.T.)コンパウンドフィッシャーサイエンティフィック23-730-571サンプルを-80°Cで凍結するために使用されます。病理学のセクショニング
トリ皿VWR25384-302ポリスチレン、使い捨て、滅菌、100回の準備をするためのC;15 mm
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Corning21-031-CMDulbecco's PBS without Calcium and magnesium
Pipette Tips, 200-μLVWR10017-044クレーブ使用前に
ピペッター、200-μLGilsonPipetman P200オートクレーブとキャリブレーション 使用前に
スプレッダー、バクテリア細胞Bel-ArtF377360006ベーキングまたはオートクレーブで滅菌 各使用前に
攪拌バー、磁気、7.9 mm 直径 × 38.1 mm 長さVWR58948-150分注中に濃縮細菌接種を攪拌するために使用されます
攪拌プレート、磁気コーニングPC-620D
トリプシン大豆ブロス(TSB)BD211822寒天と組み合わせてTSA
バイアル、円錐形、滅菌、50mLコーニング431720細菌接種
バイアル、円錐形、滅菌、500mLコーニング431123冷凍接種
バイアル、極低温、2.0mLを調製するための接種液を濃縮するために使用されますコーニング430659濃縮細菌接種
Xylazine、20 mg/mLAkornAnaSed注射PBSで1:20を1 mg / mLに希釈し、1 mg / mLでケタミンと組み合わせ
BD 機匹のマウスを収容 マウスの麻酔です てください 肺ペオートを分注する際に濃縮細菌接種液を攪拌するために使用 剤の極低温保存に使用され、ます。

参考文献

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