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方法論記事

閉ループ慣性マイクロ流路を用いた患者由来気道分泌からラベル無料好中球の濃縮

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DOI:

10.3791/57673

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2018年6月7日

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1Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Medicine, University of Pittsburgh, 4Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 5Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh

この記事について

サマリー

本研究ではスパイラル慣性マイクロ流体システムの閉ループの操作を使用して臨床の気道分泌物からラベル無料好中球分離法を紹介します。提案手法は、様々 な呼吸器疾患の臨床の in vitroアッセイを拡大します。

要約

気道分泌物には、多数免疫関連細胞、例えば、好中球、マクロファージ、リンパ球は、さまざまな肺疾患、研究および臨床目的のための両方を評価する主要なリソースとして使用することができますにはが含まれています。しかし、患者の粘液の異種と粘性の性質のためありません現在メソッドがあります信頼性の高い解離患者気道分泌の宿主の免疫細胞に被害はありません。本研究では慣性マイクロ流体を使用して、患者さんの免疫の評価のためのサンプル調製法を紹介します。臨床サンプルの異種流体プロパティに関係なく、提案手法は 1,000 倍希釈、気道分泌物のサンプルから好中球の 95% 以上を回復する清潔な生理食塩水のミリリットルと。初期サンプル貯水池へ集中している出力ストリームを再循環によって高濃度、回復、および免疫細胞の純度は用意されています。再循環は、トレードオフが伴う慣性マイクロ流体の単一実行注射器ベースの操作と見なされます。スパイラル マイクロ流体システムの閉ループ操作ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) によって示されるように物理的または化学的にせずに、白血球を提供します-並べ替えられた好中球のエラスターゼ遊離。

概要

細胞は多量の気道分泌物で粘液にカプセル化されて、以来の in vitroアッセイによる白血球の機能評価を妨げられています。ジチオトレイトール (DTT) は最も一般的な換散バッファーを切り離して、細胞学的分析と単離細胞1,2の許容性を提供しながら調停の検出の喀痰を均質化します。ただし、DTT はエラスターゼおよびミエロペルオキシダーゼ (MPO) リリース2,3など好中球機能の中断の結果気道好中球表面結合抗原を妨げることができます。したがって、末梢血好中球肺4の生理学的特性を明らかにするかもしれないとひと気道好中球機能のいくつかの研究が行われています。一方、慣性マイクロは、様々 な患者のマトリックス5,6から細胞を分離することを進歩させてをきました。慣性の揚力とディーン ドラッグ間の平衡により、ラベル無料粒子分離7彼らの大きさに応じて粒子/セルに配置します。当社グループは以前循環腫瘍細胞8,9血8病原体、細胞懸濁液文化10、11,からの試料作製法を導入した12と多形核白血球 (PMNs) 血13,14から。

好中球エラスターゼ (NE) アッセイなど、下流の in vitroアッセイの閉ループ慣性マイクロを使用して患者さんの気道分泌物から免疫細胞を準備するためのプロトコルを紹介します。このメソッドは、セル/粒子の元、セル/粒子の金利が削除される臨床サンプルでよく観察される横方向に重要な重複がある場合は特に、高濃度と復旧の両方を提供します。内部壁 (IW) を再循環によって-廃棄物の貯留層を通過する小さな粘液骨材を用いた背景流体中大きな粒子またはセルへ入力サンプル チューブ、粒子や貯水池の元セルの関心集中を集中。臨床サンプルの異種流体特性、にもかかわらず提案手法を一貫して好中球 1,000 倍希釈、気道分泌物のサンプルからの 95% 以上回復 (〜 1 mL) きれいな食塩水で。対照的に、換散方法は Pmn の広い範囲のサンプル条件によって回収率を示します。提案プロトコルは、物理的あるいは化学的停止することなく、臨床的に低侵襲と生体に挑戦から繊細な細胞を収穫する可能性を提供するが無料のラベルに白血球をキャプチャします。

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プロトコル

サンプル コレクションは、ピッツバーグ大学制度審査委員会 (IRB # PRO16060443, PRO10110387) によって承認されました。すべての実験は、バイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けの下で実行されます。

1. デバイス作製とソフト ・ リソグラフィー

注: 標準的なソフト ・ リソグラフィー技術15,16はポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ チャネルを作成する使用されました。

  1. ベースと硬化剤の比率 10:1 の PDMS 前駆体をミックスします。
  2. 微細加工によるアルミ金型の PDMS 前駆体混合物の 30 グラムを注ぐ (寸法は図 1を参照) および 100 mm のペトリ皿に PDMS 前駆体の混合物の 20 g。
    注: ペトリ皿、支持層の PDMS (~ 3 mm) の厚いフィルムのために使用されます。PDMS の支持層は、マイクロ流体全体で均一な表面物性を提供します。また、スライド ガラス上の PDMS 薄膜を使用できます。特定のチャネル寸法マスター金型設計し、アルミのシートでの微粉砕により作製しました。本研究で使用されるスパイラル チャネルは、1 つの入口と半径 8 mm から 24 mm サイズ ベースの効率的な分離のために増加の 2 つのアウトレット 8 ループ スパイラル マイクロだった。
  3. ドガの画面で、通常 5-10 分、デシケータ用家真空気泡がなくなるまでに真空デシケータに金型とペトリ皿を配置します。
  4. 真空を解放し、1 時間 90 ° C のオーブンで、カビやペトリ皿を配置します。
    注: ホット プレートまたは他の加熱ツールは、オーブンの代わりに使用できます。
  5. 金型とペトリ皿をオーブンから取り出し、10 分間室温で冷却するようにし、なさい。
  6. 慎重に輪郭をカット、2 mm パンチャーを使用してデバイスの流体アクセス穴をパンチします。
    注: パンチのサイズ チューブまたは流体のガイドのサイズによって異なります。
  7. テープ デバイスのチャネル側と PDMS、厚膜を付着し、ほこりを削除する鉗子で慎重に皮をむきます。
  8. デバイスと空気プラズマ プレーン PDMS とプレーン PDMS (図 1 a) の準備のサポート層との絆のチャネル側の両方を扱います。
  9. スライド ガラス 50 mm × 70 mm のチップを置き、接着強度を高めるために、少なくとも 30 分の 70 ° C のオーブンで配置します。

2 機械的に換気された患者から気管分泌コレクション

注: 気管分泌物することによって機械的に換気された患者の通常ルーチン気道ケア中に標準的な大人の換気患者を収容する従来の方法から変更されたプロトコルを使用しています。サンプルは識別不能化されますされ、処理に直ちに送信されます。

  1. 気管吸引が示される場合は、気道の分泌物を抽出するカテーテルを使用します。
  2. 気管内チューブにカテーテルを慎重に半分の方法を進めるし、あらかじめ 10 mL のシリンジから 0.9% 滅菌生理食塩水入り 5 mL を植え付けます。
  3. カテーテルは完全に、高度なまたは抵抗が満たされると、分泌物を吸引し、滅菌喀痰コレクション コンテナーを収集します。
  4. 滅菌喀痰容器に気管分泌物の 10 mL を収集し、氷の上に置きます。すぐに処理するためのサンプルを送信します。

3. 気管分泌物サンプル準備

注: すべての実験はバイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けの下で実行する必要があります。

  1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (10 倍希釈) のプラスチックの 10 mL の注射器を使用しての 9 mL の気道分泌のサンプルの 1 つの mL を分散させます。粘液サンプルを均質化するのに鈍ピペットを使用します。
  2. 希釈剤を大きな塊や血栓は、マイクロ アクセス穴またはチャネルをブロックすることができますを削除する 40 μ m ナイロン セル ストレーナー付けひずみ。処理後、氷の上、サンプルを配置します。
  3. PBS バッファー、希薄懸濁液 x 1,000 の結果の 100 倍量を使用して各サンプルの希釈剤を分散させます。氷の上全体の解離操作中にサンプルを配置します。

4. 実験のセットアップ

注: すべての実験はバイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けの下で実行する必要があります。

  1. 4 スパイラル マイクロ (図 1 b) のそれぞれに一様流を適用する流体のガイドと PDMS チップを組み立てます。
    注: 4 つのチャンネルは、結果の懸濁液の量と細胞密度の最適化と同様に並列処理によってスループットを増やすに使用されました。流体のガイドは、設計されて、透明樹脂の光造形タイプの 3 D プリンターで作られました。入口と流体のガイドの出口ポート接続と操作中に安定したシール性を女性のルアーロック コネクタを使用します。
  2. 1/16 インチ男性ルアー コネクタを入口と内部壁 (IW) アウトレット、流体のガイドの外側の壁 (OW) 出口ポートに接続し、サンプルの懸濁液にシリコン チューブを接続します。
  3. インレットとアウトレット サンプル貯水池の底に到達するための各終わりに鈍のヒントを挿入します。
  4. インレット チューブ蠕動性ポンプを接続します。
  5. サンプル タンクの入口配管と IW アウトレット チューブの端に配置し、(図 1d) 廃棄物貯蔵所の OW アウトレット チューブの端を置きます。
  6. サンプル保存容器にカルシウムとマグネシウムなしフィルター処理された PBS の 50 mL のチューブを置きます。
  7. デバイスを総理する低流量 (〜 1 mL/分) でポンピングを開始します。
    注: チャネル内の泡をキャプチャすると、不安定にし、空気の気泡を除去するピンセットでチャンネルの上部をプッシュします。デバイスが完全に緩衝液でいっぱいになる、気道分泌のサンプル チューブを準備する PBS チューブを変更します。
  8. サンプル タンクのサンプルを配置すると、蠕動運動型ポンプのスイッチ、4 mL/分 (図 1d) で流量を設定します。
  9. サンプル ボリュームでは、指定されたボリューム (〜 1 mL) に達すると、操作を中止、シリコン チューブを外します。
    メモ: 提案手法は大量の希釈液を減らすことでより効率的な (> 50 mL) をマイクロ遠心チューブ ボリューム (〜 1 mL) (図 2)。

5 フローサイトメトリー解析

注: 解離手法 (マイクロおよび換散) を比較するため, 蛍光抗体法とフローサイトメトリーが使用されました。

  1. かに (FITC) - 共役マウス抗 CD66b モノクローナル抗体とアロフィコシアニン (APC) - 共役マウス抗 CD45 抗体初期懸濁液 (ステップ 3.3) し、結果として得られる懸濁液 (ステップ 4.9) (200 μ L を追加します。各抗体) の 1:25 の比率で v/v。
  2. 4 ° c 30 分間暗闇の中でサンプルをインキュベートします。
  3. Pmn を定量化する流れの cytometer で両方のサンプルを分析します。
    注: は CD45 陽性、CD66b 陽性 FITC APC 二重肯定的な人口が好中球としてと考えられた.回復は、入力と結果の懸濁液の総細胞数の比率で算出しました。

6. NE リリース解析

注: 分離されたの機能を比較するには、マイクロ流体システムと溶解法による好中球 NE アッセイ キットを使いました。

  1. 各結果サスペンション (4.9 のステップで取得) を 50 の最終濃度に PMA (アッセイ キットで提供されます) を追加 nM。
  2. 2 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
  3. 10 分間 300 x g で懸濁液を遠心します。
  4. それぞれの上清の 10 μ L を (アッセイ キットで提供されます) 96 ウェル プレートに転送します。
    注: 平らな底と黒ポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートをも使用できます。
  5. (アッセイ キットで提供されます) 希釈アッセイバッファーの 90 μ L を各ウェルに追加します。
  6. エラスターゼ基板 (Z アラ アラ アラ アラ 2Rh110、アッセイ キットで提供される) の 10 μ L を追加します。
  7. 37 ° C で 1.5 時間インキュベートします。
  8. 485 の励起波長で、蛍光光度計を用いた 96 ウェル プレートを読む nm、発光波長 525 nm。
    注: NE のレベルだった流れフローサイトメトリー解析から多核白血球数で割った値。

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結果

孟とマイクロ流体解離 (図 3 a) を DTT と両方で透明な免疫細胞懸濁液を達成しました。マイクロ解離収集 105 Pmn x 4.40 平均 (2.1 x 10 x 10 の5 Pmn 5.60 に4 n = 6) 気道分泌のサンプルから 1,000 倍希釈 (容量 50 mL) きれいな懸濁液の 1 mL に。初期希釈 94.0 %pmn と比較して (CD66b+/CD45+) 6 臨床サンプルにわたって一貫して、少量で回収されました。ただし、DTT 孟手法では, 53.5% 回復平均で重要なサンプルにサンプル変化 (30.8 96.0%) と(図 3 b)。

次に、エラスターゼのリリースは、概念実証として商業 NE...

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ディスカッション

慣性マイクロ粒子と細胞は、マイクロ流路のサイズ5,18,19,20に基づいて特定の水平位置にローカライズします。ディーンの複合効果による力と慣性の揚力曲線マイクロ、大きな粒子、好中球をドラッグ (> 10 μ m) 6 より小さいチャネルと小さな粒子、粘液の集計、および残骸の中にある μ m を配置以外の一定の流速でチャネル条件の10、11,13,14を実行します。

ただし、他のセル/粒子粒子の分離サイズの範囲または興味のセルに重なっている場合は特に、マイクロ流体を使用する場...

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開示事項

著者は、ここでは説明された技術の特許出願を提出しました。

謝辞

この作品は、NIH U24 サンプル温存法プログラム (U24 AI118656) だけでなく、NIH/NIAID (R21AI119042) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PDMS前駆体ダウコーニング184 SIL ELAST KIT 3.9KG10:1 ベースと硬化剤の比率
VWR 重力対流オーブンVWR414005-128PDMS前駆体は90度で硬化します。
100mmペトリ皿VWR89000-324PDMS支持層の製造
ハリスユニコアパンチャーシグマアルドリッチWHAWB1000762mmの直径またはチューブサイズに応じて他
エアプラズママシンフェムトサイエンスキュートボトムベースへのPDMSデバイスの表面プラズマ処理。
2 "×3"スライドガラスTED PELLA、INC.2195PDMSデバイスをサポートするには
Masterflex スプールプラチナ硬化シリコーンチューブ、L / S 14Cole-ParmerEW-96410-14マイクロ流体および蠕動ポンプ用チューブ
1/16 インチ ルアーコネクタ、オスハーバード装置PC2 72-1443流体ガイド用コネクタ
50mL ファルコンチューブコーニング21008-940サンプル収集と調製
リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムおよびマグネシウムを含まない1XCorning45000-446 サンプルを希釈するための緩衝液
ハリヤードクローズドサクションカテーテル、エルボ、14F /チャンネル4.67mmHALYARD HEALTH22113気管分離吸引カテーテル
0.9% 滅菌 正常生理食塩水、10mLプレフィルドシリンジBD PosiFlushNHRIC:8290-306547患者からの気管分離収集用
SecurTainer™III検体容器、20mLSimport1176R36滅菌喀痰(気道分泌物)収集容器
Luer-Lokチップ付きシリンジ、10mLBDBD309604粘液サンプルをピペットで均質化し、サンプルチューブの底に到達するには
BD ブラントフィルニードル、BD Luer-Lok付き ヒントBDペットで粘液サンプルを均質化し、サンプルチューブ
40µの底に到達します。m ナイロンセルストレーナー Falcon21008-949マイクロ流体アクセスホールやチャネルを塞ぐ可能性のある大きな塊や血栓を除去するため。
蠕動ポンプ(Masterflex L/S Digital Drive)Cole-ParmerHV-07522-30マイクロフルイディクスの操作
BD LSR II フローサイトメーターBD BioscienceLSR II フローサイトメーター細胞回収率の定量化
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識マウス 抗ヒトCD66bモノクローナル抗体BD Bioscience561927フローサイトメーター分析のための好中球の免疫染色
アロフィコシアニン(APC)標識マウス 抗ヒトCD45モノクローナル抗体BD バイオサイエンス561864フローサイトメーター分析のための好中球の免疫染色
プレートリーダーサーモフィッシャーサイエンティフィバリオスカ好中球エラスターゼアッセイ用プレートリーダー、ex485/em525
好中球エラスターゼアッセイキットケイマンケミカル600610好中球機能評価
Fluoresbrite YGマイクロスフィア10.0µmポリサイエンス株式会社18140-2マイクロ流体における白血球の軌跡を発現する蛍光粒子
ピック

参考文献

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