このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

植物感染試験: スプレーと傷を介した植物病原体イネいもち病菌接種

12.4K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/57675

⸱

2018年8月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application, National Demonstration Center for Experimental Plant Production Education, Beijing University of Agriculture, 2College of Plant Protection, State Key Laboratory of Agrobiotechnology, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Pest Monitoring and Green Management, China Agricultural University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、提案する植物病原菌と植物病原性をテストするためのプロトコルいもち病。このレポートは菌分離株の pathotype の大規模スクリーニングに貢献し、分子育種中植物の耐性メカニズムを理解するための優れた出発点として役立ちます。

要約

植物病原性菌による潜在的な脅威から身を守るための強力なシステムを所有しています。農学上重要な植物は、ただし、このような病原体と戦う対策の現状はあまりにも保守的な証明している、したがって、十分に効果的なと潜在的環境は危険が伴います。したがって、それは非常に制御する病害抵抗性遺伝資源の識別、分離抵抗性遺伝子の解析と分子育種を通じて自然を支援する宿主抵抗性要因を識別するために必要です抵抗力がある品種。この点で、繁殖植物抵抗性遺伝子を開発し正確・迅速かつ大規模な接種方法を確立する必要があります。米は、真菌病原体イネいもち病菌原因重症症状を爆破し、損失をもたらします。最近では、イネいもち病菌は、植物病原菌の相互作用のメカニズムを研究するためのモデル生物として浮上しています。したがって、私たちはイネいもち病菌の特定は、植物病原性試験法の開発を報告します。このメソッドは、胞子懸濁液を噴霧接種法と負傷接種キューブ菌糸または胞子懸濁液の液滴の両方を提供します。戸建イネ葉の負傷の接種法の重要なステップは、ホスト貫入抵抗による任意の干渉を回避する植物の葉で傷をすることです。このプロトコルがスプレー/負傷したイネいもち病菌菌株の生じの迅速、正確、かつ大規模なスクリーニングに貢献します。これは統合し、体系的な植物感染症法は植物病理学の問題の広い視野を得るための優れた出発点となります。

概要

イネいもち病菌によるイネいもち病は、水稲品種世界中1,2のための最も深刻な病気のひとつです。イネいもち病菌感染宿主植物プロセス分生胞子生産と付着、分生胞子の発芽および付着器形成、形成穿と感染菌糸の分化は、病気を広める3。 これらすべての段階が多く他植物病原糸状菌、一般的で、確かに、任意の 1 つのステージの封鎖ホスト植物の感染が防止します。経済的重要性、遺伝的少ないのためイネいもち病菌は、植物病原菌の相互作用1,4のメカニズムを研究するためのモデル生物として浮上しています。したがって、スクリーニングとデザイン小説候補遺伝子の同定と真菌病原性の分子機構の解明を助けるこれら発達段階のイネいもち病菌の分子基盤を勉強殺菌剤5。

イネいもち病菌感染に関する最近の報告は前侵入の段階、特に、制御、付着器形成、浸透ペグ、伝染の成長3,の分子機構に焦点を当てています。6。 したがって、イネいもち病菌感染をテストする詳細なプロトコルを開発するが不可欠です。本明細書で詳細な胞子懸濁液とイネいもち病菌菌糸のプラグに傷接種スプレーを介した感染アッセイを利用して感染テスト方法を提案する.本報告では、プロトコルは、噴霧のため制御する溶液の調製と植物イネいもち病菌の菌糸のプラグを介した接種菌株のうち、文化に焦点を当てください。詳細は以下で、メソッドの全体のワークフローを示した概略図でこれらの手順を説明し、典型的な病変は、それぞれ図 1 2に示すように。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1 イネいもち病菌の分生胞子懸濁液の噴霧接種法

  1. M.griseaの真菌培養
    1. 菌のオートミール トマト寒天 (OTA) 培養液を準備します。
    2. オートミールの 30-50 グラムの重量を量る 800 mL の蒸留水または脱イオンされた水 (ddH2O) にこれを追加し、電気ポットで 30 分間混合物を沸騰させます。
    3. ガーゼの部分をビーカーにゆでオートミール ジュースをフィルターします。
    4. 150 mL トマト ジュースと寒天 20 g をビーカーに濾液に追加し、追加 ddH2O 1,000 mL。
  2. 実験材料の準備
    1. イネ (イネ) 品種 Lijiangxintuan heigu (LTH) ddH2O 3 d 約 50 種を浸すまたはオオムギの約 50 種を浸す (オオムギcv 黄金の約束) ddH2O 約 1 d のために。
    2. 湿ったガーゼで米や麦の種子をラップし、28 ° C で 10 cm × 10 cm の直径の約 30 ペトリ皿で湿潤ろ紙上発芽イネ種子の発芽時間は約 2-3 d、オオムギ種子の発芽時間は約 2 d。温室内の相対湿度は約 70% です。
    3. オートクレーブ potting 土と水遣りを使用して鍋で米や麦の苗を植えるし、バーミキュ ライトの層でそれらをカバーします。
    4. 1 約 25 ° C でキャビネットの適切な温室の成長の植物を置く 〜 2 週間。
    5. (各サークルには 8 cm 径はず) 無菌手術ハサミで円のフィルター紙の 3 層をカットし、100 mm 滅菌プラスチック プレートの上に配置。
    6. ろ紙を浸して皿ごとに ddH2O を追加します。
    7. フィルター ペーパーは完全に濡れていることを確認が、余分な水を追加しません。
    8. 真空ポンプの過剰な水を削除します。
    9. 米/麦の穂をサポートする培養皿に場所 2 滅菌つまようじ葉;スペース、つまようじ 2 ~ 3 cm。
    10. 稲の葉に種子を播種後 2 週間を収集したり種子を播種後 7 d の大麦の葉を取る。
    11. 米/麦の 4-6 葉苗を使用して、上から 〜 5 cm で茎の下の部分をカットし、葉を収集します。
  3. 噴霧接種プロトコル
    1. ~ 4 d のためのサーモスタットのインキュベーター (25 ° C) で太田プレートに真菌のひずみを文化します。
    2. DdH20.5 - 5 mL ピペット各 4 日古いプレートを使用して O 〜 2 mL を加えます。
    3. 接種ループ菌糸破片にイネいもち病菌の野生型株と変異株の菌糸体を擦る。
    4. 菌糸体の破片を集めるし、新しい太田プレートに転送。菌糸破片やクリーン ベンチのブロードライを取る。
    5. 24-48 h の泊 (10 h) の日 (14 h) および 23 ° C の 25 ° C で温室の分生子の成長に必要な湿度を確保するためのガーゼの 3 層プレートをカバーします。
    6. それぞれの皿に ddH2O 2 mL を追加し、レンズ ペーパーの 2 層を介して濾過に続いて滅菌綿棒で胞子を優しくこすり。培地の表面に傷を付けないように注意します。
    7. 100-1,000 μ L ピペットで新しい 50 mL のチューブに分生胞子懸濁液を転送します。
    8. 25 ° C で 5,000 × g の最低 5 分間遠心
    9. 上澄みを除去し、0.025% (v/v) トゥイーン 20 ソリューションの mL あたり 2 × 104分生胞子を与えるにペレットを再懸濁します。トゥイーン 20 ソリューションは通常、約 10-20 mL です。
    10. ハンドヘルド スプレーに胞子懸濁液を注ぐ。
    11. 7 日古い大麦幼植物の葉約 10 mL の 2 週齢イネやオオムギの葉の上に胞子懸濁液を卵巣摘出し、25 ° c ~ 24 h. スプレーの暗く、湿気の多い部屋で 0.025% (v/v) トゥイーン 20 ソリューション コントロール植物を孵化させなさい。
    12. 12 時間日長の 25 ° C で蛍光灯の下の別の湿ったチャンバーに葉を転送します。
    13. 接種後 5 d で病気の症状を記録します。~ 6 cm の長さの罹病イネ/麦ブレードを調べます。評価基準は、国際稲研究所 (IRRI) のいもち病抵抗性のスコアリング システムによると。いもち病抵抗性のスコアリング システムの詳細は、表 1のとおりです。
    14. 写真の菌の感染を評価する葉。感染は、3.6 cm2あたりの病変の数によって評価されました。

2. 接種菌糸体キューブまたはイネいもち病菌の分生胞子懸濁液液滴が負傷しました。

  1. 3 戸建米/麦の葉の主な静脈の 2 ~ 3 cm 長い傷をこすり解剖針を使用して、葉を透過しないように注意してください。
  2. つまようじにスクレイプの葉を置いて、0.02% (v/v) 液滴の層を形成する葉のトゥイーン 20 ソリューションをスプレーします。
  3. 太田プレートから各イネいもち病菌菌株 (野生型、変異体、補体のひずみ、またはその他の試験菌) の 0.5 × 0.5 cm 菌糸プラグをカットします。
  4. 菌糸のプラグを入れてや負傷者に胞子懸濁液の 25 μ L 滴葉および 25 ° c 3-8 d のため湿気の多い室内で葉を孵化させなさい。
  5. 5-7 d 後接種で病変を調べます。調査方法は、噴霧接種法のためだったと同じです (1.3.13 の手順を参照してください)。
  6. ~ 6 cm の長さの罹病イネ/麦ブレードを調べるし、菌の感染を評価するそれらを撮影します。感染は、3.6 cm2あたりの病変の数によって評価されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

技術全体のワークフローは、図 1に示すです。14 日齢の影響を受けやすいイネ幼植物の植物感染アッセイを行った (イネcv CO 39) 7 日齢の影響を受けやすいオオムギ葉または (H. オカダンゴムシcv 黄金の約束)7,8,9。イネ葉の感染症のためにテストするため Com1 削除変異株のイネいもち病菌の野生型株 P131 胞子懸濁液 (1.0 x 105胞子/mL) が準備し、14-日齢の影響受けやすいの葉鞘に吹き付けて、5 d10湿室に保管された、CO 39 苗。P131 接種 CO 39 葉いもち病、典型的な堅牢な病変表示が、Com1 接種葉感染の明らかな欠陥を示した、完全な感染症 (

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

植物病抵抗性遺伝子は、真菌病原体1,12を含む病原体による感染症の予防に不可欠な役割を果たします。いもち病は、病原体の人口構造の性質を理解して植物抵抗性遺伝子4を識別するためにモデルとして使用されています。したがって、病抵抗性遺伝子型と連続的に栽培することができます病気に強い植物を識別するために大規模な農業の植物の主な品種の非病原性遺伝子型を調べる必要があります。さらに、フィールド病原体の非病原性遺伝子型の利点は、抵抗性遺伝子型の異なるホスト品種12,13の合理的な流通をしなければなりません。しかし、現在の接種方法は一般的抵抗性と病原体同定14,15,16,

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、北京農業大学 (YQ201603) の特別な科学研究プロジェクトと北京教育委員会 (KM201610020005) の科学的なプロジェクトによって支持されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
濾紙GE Healthcareブランド(スウェーデン)  
50mLチューブコーニング(アメルシア)430290
遠心分離機エッペンドルフ(アメルシア)5804R
培養皿サーモフィッシャー(アメルシア)150326
0.5-5mLピペットエッペンドルフ 
100-1000uL ピペットエッペンドル4920000083
真空ポンプライボルトD25B
解剖針FST26000-35
インキュベーターMEMMERTPYX313
接種リンググライナー バイオ ワン731175
103113874920000105フ

参考文献

  1. Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
  2. Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401(2009).
  3. Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
  4. Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
  5. Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
  6. Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
  7. Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
  8. Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
  9. Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
  10. Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
  11. Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430(2016).
  12. Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
  13. Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
  14. Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
  15. Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
  16. Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
  17. Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
  18. Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

噴霧接種分生子懸濁液菌糸プラグ離脱籾葉病原型スクリーニングいもち病植物病原体相互作用
植物感染試験: スプレーと傷を介した植物病原体イネいもち病菌接種
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。