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方法論記事

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

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⸱

DOI：

10.3791/57688

⸱

2018年6月19日

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1 を高発現、単純な組み合わせを使用して、ひと多能性幹細胞から最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するスケーラブルな方法をについて説明します。

要約

機能的ひと多能性幹細胞由来心筋前駆細胞の大量および定義された中心領域の原点の心筋細胞の生成は、セルベースの心臓治療法や疾患モデリングの前提です。我々 は最近、Id 遺伝子が必要と脊椎動物の開発中に最初の心臓フィールドの前駆細胞を指定するのに十分なことを示しています。この分化プロトコルは、これらの知見を活用し、最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 前駆細胞を生成する強力な指定する手がかりとしてアクチビン A との組み合わせで Id1 の過剰発現を使用します。重要なは、結果前駆細胞のような心室心筋細胞 (〜 70-90%) を効率的に区別します。ここで我々 は 1) Id1 過剰発現 hPSCs を生成し、2) 前駆細胞について-L cryopreservable のような心室心筋細胞のスケーラブルな量を区別するための詳細な方法をについて説明します。

概要

ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の大規模な生産-派生心臓前駆細胞と心筋細胞は幹細胞ベースの治療1、病モデル2,3との迅速な評価の前提新規経路心筋分化4,の5,6と生理7,の8を規制します。,15が非常に効率的な前述した研究9,10、11,12,13,14の数hPSCs から心筋分化誘導方法、どれもが対処にもかかわらず左違いの重要な分子の同定の結果心筋細胞の心臓領域の原点 (最初ハート フィールド) と右の (2 番目のハート フィールド)心室心筋細胞16と心フィールド固有の先天性心疾患の存在すなわち、左心低形成症候群17または不整脈原性右室異形成症18。したがって、心臓前駆細胞の生成と定義されたハート フィールド hPSCs 由来の心筋細胞は治療としての妥当性を高めるために必要になっていると疾患モデリング ツール。

このプロトコルは、Id1、最近同定された5最初ハート フィールドを指定するキュー アクチビン A との組み合わせでは必要であり、hPSCs での心臓を開始するための十分な学会の構成に依存します。特に、カニンガムら(2017)5を示して、Id1 誘起前駆細胞具体的表現 (HCN4、 TBX5) 最初のハート フィールドが 2 番目のないハート フィールド マーカー (SIX2、 ISL1) 心筋分化を遂げる。さらに、著者はまたしたトランスジェニック マウス胚の遺伝子 (Id1-4)、家族Idを欠けている開発最初心臓フィールド心臓前駆細胞より内側と後部の心臓前駆細胞 (間を形成することがなく、表示します。2 つ目のハート フィールド) はそれにより Id 蛋白質初めてハート フィールドの心臓生体内での開始に必須を示唆、まだ形成できます。便利な Id1 誘起前駆細胞凍結保存することができ、自発的に心室固有マーカー (IRX4, MYL2) 式を含め、心室のような特性を表示する心筋細胞に分化し、ような心室の活動電位。

ここで Id1 過剰 hPSCs から最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するシンプルかつスケーラブルな手法について述べる。このプロトコルの重要な機能は、便利な冷凍保存の手順を使用してその後心筋細胞生産から心臓前駆細胞生成を切り離すことです。要約すると、このプロトコルは (1) Id1 過剰発現の hPSCs を生成する、(2) hPSCs から急性肝不全-L 心臓前駆細胞を生成する、(3) 結果前駆細胞の凍結、(4) 再開について L 心臓前駆細胞の分化に必要な手順の詳細し、を生成高濃縮 (> 70-90%) のような心室心筋細胞を打ちます。

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プロトコル

1. Id1 ウイルス作製と感染症

  1. PCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR、pMD2.G、pCMVDR8.74 の共同株 Id1 過剰発現レンチ ウイルスを生成 (Addgene: プラスミッド #107735) HEK293T 細胞に。ウイルス粒子を収集、濾液、上清から浄化、北村らのように-80 ° C で保存(2003 年)19します。 また、pCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR をレンチ製造ベンダーに送信することによって商業 Id1 レンチ ウイルスを生産。
    注意: は、レンチ ウイルスに関する安全規制および標準的な操作のプロトコルに従ってください。
    注: 重要: 最適なウイルス価は少なくとも 10 をする必要があります 108 9 Transducing 単位/ml (TU/mL)。
  2. 感染前にコートのコーティング剤、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫細胞 (材料の表を参照) によって分泌されるゼラチンのタンパク質混合物通常の 50 μ l で 96 well プレートの 1 つの井戸を実行します。
  3. 1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA を追加することによって 6 ウェル プレートで育った多能性幹細胞の 1 つの井戸を切り離して考えます。
    注: 解離時間は 3-10 分から異なります。プレートの底から細胞の 80% 以上を取り外したら、次のステップに進みます。
  4. 滅菌ピペットで細胞を懸濁液を 15 mL プラスチック遠心管にまとめます。
  5. 5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。
  6. 遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。
  7. 上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。
  8. 幹細胞培地 1 ml を再停止します。
  9. ベンダーの指示に従って自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
  10. あたり 20,000 実行可能な細胞は幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤の 50 μ L でよく (96 ウェル プレート) をコーティング (表 1 と 2を参照)。
  11. 24 h 後セル添付ファイルを監視し、2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine ブロマイドを添加した 100 μ l 幹細胞メディアでメディアを交換して (表 1および2を参照)、レンチ ウイルス感染前に 1 h。
    注: の細胞は、プレートの底にしっかりと固定する必要があります。
  12. 氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。
  13. 3 μ L/ウェル精製レンチ ウイルスを追加 (ウイルス価は 10 の間にする必要があります8 ~ 109 TU/mL)、し、プレートを携帯文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO220% O2) に転送。
  14. 24 時間後のウイルス感染、感染した細胞に新鮮な幹細胞培地の 100 μ L を追加。
  15. 48 時間後にレンチ ウイルス感染、新鮮な幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L でメディアを含む置換ウイルス。
  16. 幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L で毎日メディアを更新します。
  17. 文化が 80% の confluency に達したら、Ca2 +と Mg2 + + 0.5 mM EDTA なし 200 μ L の PBS (96 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。
  18. 細胞懸濁液を遠心管にまとめます。
  19. 5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。
  20. 遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。
  21. 上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。
  22. 再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 1 ml を中断します。
  23. 12 ウェル プレートのコーティング (1 mL) のすべてのセルに転送します。
  24. 24 h 後幹細胞培地の 1 mL でよくと置換メディアに付着のためのモニターは 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine 臭化物、伝達の前に 1 つの h を補充しました。
  25. 氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。
  26. ウェル (12 ウェル プレート) あたり純化ウイルスの 5 μ L を追加します。
  27. 24 h 後レンチ ウイルス感染、1 ml の新鮮な幹細胞培地 3 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを含む置換ウイルス。
  28. 48 h レンチ ウイルス感染ウイルス含有 1 ml の新鮮な幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを交換してください。
  29. 文化が 80% の confluency に達したら、500 μ L の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA (12 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。
  30. 半分を転送 (250 μ L) コーティング剤の 1 つの井戸に細胞懸濁液のコーティング幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 mL を含む 6 ウェル プレート。
  31. その他の半分を使用 (250 μ L) RNA の抽出およびレンチウイルスベクターを介したId1表現のレベル、コーラらのようにを定めるために qRT PCR のサンプルの(2012 年)4。
    注: 重要な: Id1 mRNA 発現レベルよりも低い場合 (qRT PCR のプライマーの表 3を参照) GAPDH発現レベルの 0.005 倍、Id1 表現のレベルを超過するまで、上記のように感染プロセスを繰り返す、しきい値。

2. hPSCsId1メンテナンス

  1. 文化の hPSCsId1コーティング 6 ウェル プレートで、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。
  2. HPSCsId1が 80% の confluency に達したら、通路のベンダーのガイドラインに従う酵素無料解離試薬を用いた集計値 (1:6 分割比) と細胞、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。

3. 差別化の hPSCsId1の準備

  1. コーティング剤の井戸あたり 500 μ L で 12 ウェル プレートをコートします。
  2. 5-10 分チェック解離過程、毎分Id1に達する 90% の confluency hPSCs 1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +とよく当り 0.5 mM EDTA を追加することによって細胞を分離するとき、80% の細胞をプレートから解離する一度、次の手順に進みます。
  3. 細胞懸濁液を遠心管にまとめます。
  4. 5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。
  5. 遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。
  6. 上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。
  7. 再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 ml を中断します。
  8. 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
  9. 井戸幹細胞培地培養孵卵器に 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 μ G/ml ピューロマイシン転送プレートと補足の 1 mL あたりプレート 300,000 セルです。
  10. 幹細胞培 6 μ G/ml ピューロマイシン文化まで 90% の confluency 地 2 mL を毎日メディアを更新します。この時点で、心臓の分化を開始 (次の手順)。

4. hPSCsId1の最初のハート フィールドのような心臓前駆細胞 (CPs について L) への分化

  1. 12 ウェル プレート形式の幹細胞培地を 1.5 mL の誘導培 (表 1) に置き換えることによって開始分化 (0 日目) はアクチビンと補足 (100 ng/mL) (表 2の推奨されるボリュームとアクチビン A の濃度を参照してください。異なるプレート フォーマット)。
  2. (24 h 分化開始後) 1 日に 2 ml (/12 ウェル プレートのウェル) アクチビン A せず誘導メディアのメディアを交換します。
  3. 3 日目、アクチビン A なし (/12 ウェル プレートのウェル) 誘導メディアの 2 mL でメディアを置き換えます。
  4. 5 日目、凍結保存用について L CPs を収集 (次の手順)。
    注: 重要な: 凍結をお勧めこの時点で心臓前駆細胞の後心筋細胞生産とバイオバンク大きなバッチから世代を切り離すことが可能。メモ、または、5 日目について L CPs は、分化を続行し、手順 5.1-5.5 passFHF L の CPs を参照してくださいステップ 6.5 に差別化のために進みますたてコーティング プレートに渡すことができます。

5. 急性肝不全-L CPs の凍結保存

  1. 5 日目を含む井戸からすべてのメディアを吸引について L CPs とすぐに暖かい (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加 (材料の表を参照してください)。組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。
  2. 1 分後プレートをインキュベーターを左右に振る。
  3. 2 分 (合計時間) 後インキュベーターからプレートを削除し、10 %fbs メディアの 1 つの mL を追加します。
  4. 優しくピペットでのセルを上下プレートから細胞の剥離を容易にするために 5 mL をピペットで移しなさい。
  5. 3 分間 200 × g で遠心分離遠心チューブ、ペレット細胞を細胞懸濁液を収集します。
  6. 再凍結保存試薬の 2 mL の細胞ペレットを中断します。
  7. 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
  8. 凍結保存試薬を追加 (材料の表を参照) を目的濃度 (通常 5-10 x 106セル/mL) で細胞を凍結保存するための十分なボリュームで。
  9. 凍結保存バイアルにセルを転送し冷却装置 (1 ° C/分) でバイアルに、一晩-80 ° C のフリーザーで冷却装置を置きます。
  10. 24 h 後に、長期保存用液体窒素に凍結バイアルを転送します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

6. 急性肝不全-L CP のような心室心筋細胞分化

  1. ドライアイスの容器に液体窒素から 5 日目凍結について L CPs バイアルを転送します。
  2. 細胞懸濁液は、完全に解凍するまで 2 〜 3 分の 37 ° C の水浴のバイアルを配置します。
    注: 重要な: 解凍処理は一刻を争う。時間の過剰な量の細胞凍結保存メディアを公開する (すなわち、 10 分) 細胞生存率が低下します。
  3. 解凍バイアル数に応じて、15 または 50 の mL の遠心管にセルを転送します。
  4. 滴 (5 滴 30 秒ごと) に予め温めておいた (37 ° C) 心原性メディア (表 1) 携帯ソリューションを調剤します。1:3 凍結保存メディアまでこのプロセスを続行: 心原性メディア比に達する。この時点で、1:10 まで心原性メディアの添加率を高める凍結保存メディア: 心原性メディア比に達する。
    注: 重要な: 急速な浸透圧の変化が、解凍処理中に細胞死を増加したがって、心原性メディアの滴下前述のよう強くお勧めします。
  5. 細胞懸濁液とペレットを遠心分離機、遠心分離 (3 分 200 g x) によって。
  6. 上清を除去し、やさしく細胞ペレットを取り除くため遠心管をフリックします。
  7. 再 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した心原性のメディアでセルを中断します。
    注: セル実行可能性は、雪解けから解凍して、一般に変わることができる、> 65% 生存率が良いめっき効率を予測します。
  8. 希釈濃縮細胞懸濁液めっき用目的のセルの濃度を取得する 2 μ M ・ ロー/ロック経路の阻害剤を添加した心原性のメディア (異なるプレート形式の表 2を参照)。
    注: 重要な: 細胞はまばらすぎる播かれる場合心筋分化効率が低下することに注意してください。
  9. プレート上の種子のセル。
  10. 組織文化のインキュベーターに転送する前に 20 分のティッシュ文化フード プレートをしてください。
  11. 6 日目に分化、細胞接着を監視します。
    注: 心臓前駆細胞は分化の 5 日目に凍結しました。細胞を解凍後 24 h は分化の 6 日目になります。
    注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。
  12. 7 日にメディアの 50% を吸引し、新鮮な心原性メディアの等しい量に置き換えます。
    注: 心原性メディアにロー/ロック経路阻害剤の追加はこのポイントの後必要ありません。
  13. その他毎日心原性メディアでメディアの 50% を置き換えます。
  14. 11 日目と 13 日目の間に自発的な鼓動するメモが表示されます。
  15. 15 日に DAPI (核染色) と ACTC1 を用いた蛍光抗体法による心筋分化効率の定量化 (パン心臓マーカー)。

7. 渡す、のような心室心筋細胞のメンテナンス

注: 日 14-16 のような心室心筋細胞を自発的に契約の単分子膜を得られなければならない.この時点で、切り離して、再度文化を均質化し、セルがプレートからデタッチすることを防ぐために心筋細胞をプレートすることをお勧めします。

  1. 井戸からすべてのメディアを吸引し、迅速に予め温めておいた (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加します。
    メモ: 酵素を含む解離試薬ボリューム x 1 プレート形式によって異なりますが完全によく画面の下部をカバーする必要があります。
  2. 組織文化のインキュベーターにプレートを転送します。
  3. 軽く板側に剥離プロセスを加速するインキュベーター内 2 分ごとを振る。
  4. 5-15 分後にプレートの底から細胞の 80% 〜 100% を取り外したら、インキュベーターからプレートを取り外し、10 %fbs メディアの等しい量を追加することによって酵素含有解離試薬活性 x 1 を阻害します。
    注: このプロセスの 1 x 酵素を含む解離でインキュベーション時間もバッチごとに変わります。
  5. 細胞懸濁液を遠心管に収集します。
  6. 自動化された細胞カウンターを使用してカウントのピペットで移しなさい細胞と細胞懸濁液を混ぜます。
  7. 目的のセルの濃度に細胞懸濁液を希釈 (異なるプレート形式の表 2を参照) 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した保守メディアで。
  8. プレート上に心筋細胞を播種後セルを均等にして細胞は、組織文化のインキュベーターにプレートを転送する前に 10-20 分を添付します。
  9. 24 h 再メッキ後は、細胞接着と回復を監視します。
    注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。48-72 時間後再メッキ、心筋細胞は自発的な収縮を再開しなければなりません。
  10. 心筋細胞培養を維持するために保守メディアでその後の実験のような心室の心筋細胞が使用されるまで、その他の毎日メディアの 50% を置き換えます。

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結果

HPSCs の生成Id1ライン
hPSCs は、Id1 過剰発現 (図 1A) を仲介するレンチ ウイルスに感染しています。HPSCId1が生成される遺伝子発現は qRT PCR (図 1B) によって定量化されます。GAPDHの 0.005 倍を超えるレベルでId1 mRNA を表現する hPSCId1線だけは差別化のために使わなければなりません。

hPSCsId1

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ディスカッション

正常な分化、密接に上記の指示に従うことを確認してください。さらに、ここで我々 は強く分化の結果に影響を与える重要なパラメーターを強調表示します。分化を開始する前に次の 3 つの形態学的パラメーターを観察する必要があります: hPSCsId1、高細胞密度および高い合流の幹の形態 (> 90%) 0 日目で文化。その点で最適な分化条件が単一セルとして解離メッキの hPSCsId1によって作成される最高と 2 〜 3 日のコース中に ~ 90% 合流する成長分子をクラスター化しっかりとフォームにそれらを許可します。逆に、hPSCId1文化ショー悪い細胞コロニー形態、植民地低圧縮と文化の中で分化の大部分の存在、成功について L CP 分化はほとんどありません。

メディア ボリューム アクチビン A の濃度は、重要なパラメーターについて L CP 分化とプレート形式に依存 (表 2参照)。最適アクチビン A の濃度に応じて異なる場合があります注 hPSC ラインを使用し、濃度の最適化が必要な場...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は役に立つ議論のコーラのラボのメンバーと原稿の重要なレビューをありがとうございます。本研究は、NIH/NIEHS R44ES023521-02 でサポートされていたし、CIRM DISC2-10110 博士コーラに付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ACTC1抗体SigmaA7811
アクチビンA細胞技術Hu Recom アクチビンA
抗生物質 抗真菌薬(抗抗抗薬)サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062
B27サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィ17504044
B27サプリメント w/o - インスリンサーモフィッシャーサイエンティフィック サイオリティフィック A1895601
ビタミンAモフィッシャーサイエンティフィック12587001
CDH5抗体R&D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930凍結保存試薬
DMEM 高グルコースMediatech10-013-CV 
DPBSワット/Ca&MgCorning21-030-CV
EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック15575-038
FBSVWR89510-186
FluoVolt 膜電位キット  Thermo Fisher ScientificF10488光学的活動電位の取得については、McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, Growth Factor ReducedCorning356231Coating reagent
mTeSR1 media kitStem Cell Technologies5850
PBS w/o Ca &Mgコーニング21-040-CV
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco
ピュロマイシン Acros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872酵素フリー解離試薬
RPMI 1640サーモフィッシャーサイエンティフィック11875-093
TAGLN抗体Abcamab14106
チアゾビビン幹細胞技術72254RHO/ROCK経路阻害剤
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12605 -0101X 酵素含有解離試薬
Tyrodes solution mix packets  SigmaT2145-10X1L(光学的活動電位取得については、McKeithan et al. 2017をご参照ください)
幹ックサー

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