ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1 を高発現、単純な組み合わせを使用して、ひと多能性幹細胞から最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するスケーラブルな方法をについて説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
機能的ひと多能性幹細胞由来心筋前駆細胞の大量および定義された中心領域の原点の心筋細胞の生成は、セルベースの心臓治療法や疾患モデリングの前提です。我々 は最近、Id 遺伝子が必要と脊椎動物の開発中に最初の心臓フィールドの前駆細胞を指定するのに十分なことを示しています。この分化プロトコルは、これらの知見を活用し、最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 前駆細胞を生成する強力な指定する手がかりとしてアクチビン A との組み合わせで Id1 の過剰発現を使用します。重要なは、結果前駆細胞のような心室心筋細胞 (〜 70-90%) を効率的に区別します。ここで我々 は 1) Id1 過剰発現 hPSCs を生成し、2) 前駆細胞について-L cryopreservable のような心室心筋細胞のスケーラブルな量を区別するための詳細な方法をについて説明します。
概要
ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の大規模な生産-派生心臓前駆細胞と心筋細胞は幹細胞ベースの治療1、病モデル2,3との迅速な評価の前提新規経路心筋分化4,の5,6と生理7,の8を規制します。,15が非常に効率的な前述した研究9,10、11,12,13,14の数hPSCs から心筋分化誘導方法、どれもが対処にもかかわらず左違いの重要な分子の同定の結果心筋細胞の心臓領域の原点 (最初ハート フィールド) と右の ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. Id1 ウイルス作製と感染症
- PCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR、pMD2.G、pCMVDR8.74 の共同株 Id1 過剰発現レンチ ウイルスを生成 (Addgene: プラスミッド #107735) HEK293T 細胞に。ウイルス粒子を収集、濾液、上清から浄化、北村らのように-80 ° C で保存(2003 年)19します。 また、pCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR をレンチ製造ベンダーに送信することによって商業 Id1 レンチ ウイルスを生産。
注意: は、レンチ ウイルスに関する安全規制および標準的な操作のプロトコルに従ってください。
注: 重要: 最適なウイルス価は少なくとも 10 をする必要があります 108 9 Transducing 単位/ml (TU/mL)。 - 感染前にコートのコーティング剤、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫細胞 (材料の表を参照) によって分泌されるゼラチンのタンパク質混合物通常の 50 μ l で 96 well プレートの 1 つの井戸を実行します。
- 1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA を追加することによって 6 ウェル プレートで育った多能性幹細胞の....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
HPSCs の生成Id1ライン
hPSCs は、Id1 過剰発現 (図 1A) を仲介するレンチ ウイルスに感染しています。HPSCId1が生成される遺伝子発現は qRT PCR (図 1B) によって定量化されます。GAPDHの 0.005 倍を超えるレベルでId1 mRNA を表現する hPSCId1線だけは差別化のために使わなければなりません。
hPSCsId1
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
正常な分化、密接に上記の指示に従うことを確認してください。さらに、ここで我々 は強く分化の結果に影響を与える重要なパラメーターを強調表示します。分化を開始する前に次の 3 つの形態学的パラメーターを観察する必要があります: hPSCsId1、高細胞密度および高い合流の幹の形態 (> 90%) 0 日目で文化。その点で最適な分化条件が単一セルとして解離メッキの hPSCsId1によって作成される最高と 2 〜 3 日のコース中に ~ 90% 合流する成長分子をクラスター化しっかりとフォームにそれらを許可します。逆に、hPSCId1文化ショー悪い細胞コロニー形態、植民地低圧縮と文化の中で分化の大部分の存在、成功について L CP 分化はほとんどありません。
メディア ボリューム アクチビン A の濃度は、重要なパラメーターについて L CP 分化とプレート形式に依存 (表 2参照)。最適アクチビン A の濃度に応じて異なる場合があります注 hPSC ラインを使用し、濃度の最適化が必要な場.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
我々 は役に立つ議論のコーラのラボのメンバーと原稿の重要なレビューをありがとうございます。本研究は、NIH/NIEHS R44ES023521-02 でサポートされていたし、CIRM DISC2-10110 博士コーラに付与します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ACTC1抗体 | Sigma | A7811 | |
| アクチビンA | 細胞技術 | Hu Recom アクチビンA | |
| 抗生物質 抗真菌薬(抗抗抗薬) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15240062 | |
| B27サプリメント | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 17504044 | |
| B27サプリメント w/o - インスリン | サーモフィッシャーサイエンティフィック サイオリティ | フィック A1895601 | |
| ビタミンA | モフィッシャーサイエンティフィック | 12587001 | |
| CDH5抗体 | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | 凍結保存試薬 |
| DMEM 高グルコース | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBSワット/Ca&Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt 膜電位キット | Thermo Fisher Scientific | F10488 | 光学的活動電位の取得については、McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca &Mg | コーニング | 21-040-CV | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | ||
| ピュロマイシン | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | 酵素フリー解離試薬 |
| RPMI 1640 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11875-093 | |
| TAGLN抗体 | Abcam | ab14106 | |
| チアゾビビン | 幹細胞技術 | 72254 | RHO/ROCK経路阻害剤 |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605 -010 | 1X 酵素含有解離試薬 |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (光学的活動電位取得については、McKeithan et al. 2017をご参照ください) |
参考文献
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
