ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
細胞遊走創傷治癒や、がんなどの健康の多くの側面に影響する重要なプロセスであり、したがって、移行を研究する手法を開発するため非常に重要。スクラッチのアッセイは、その低コストと簡単な手順のため反プロ移行のプロパティを持つ化合物をテストする最も一般的な体外メソッドをずっと。ただし、アッセイのしばしば報告されている問題は傷の端の間で細胞の積み重ねであります。さらに、測定からデータを取得する異なる露出の画像取られなければならない期間にわたって同じ場所で移行の動きを比較します。傷の閉鎖を説明する別の解析プログラムを使用ことができますが、彼らは、労働集約的、不正確なと温度変化の力サイクル。本研究では、テスト移行効果、例えば人間と牛ラクトフェリンの天然の蛋白質およびその N 末端ペプチド ラクトフェリシン上皮細胞線 HaCaT 最適化手法を示す.重要な最適化は、洗浄し、エッジに沿って細胞の前述の蓄積を排除、PBS のスクラッチです。これは、ケラチノ サイトの細胞間の接続に影響を及ぼすことが示されている陽イオンの除去によって説明できます。移行の true 検出するように、マイトマイシン C、DNA 合成阻害剤の前処理は、プロトコルに追加されました。最後に、再現性を向上し、時間をかけて傷の同一断面の解析しながら自動光学カメラ、過度の温度サイクルを排除するスクラッチ閉鎖分析で、肉体労働を示します。
概要
移行は、いくつかの生理学的な側面に影響を与える重要なプロセスです。創傷治癒の移行は皮膚の再上皮の再生を促進します。慢性の傷などのヒーリング以外の傷で日和見細菌が傷口の感染症を引き起こすし、傷口が細菌の成長とバイオ1,2の形成に最適です。バイオ フィルムは、私たちの現代社会3に対する最大の脅威の一つである抵抗力がある細菌の開発の原因の一つです。創傷治癒の免疫細胞は、バイオ フィルムを突き通すことができません。癌、癌細胞の移行は固形腫瘍4,5患者の死亡の主な原因である転移の要となる一歩です。したがって、移行を検討することができることが重要です。
スクラッチの試金はそれは安価で簡単に線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞ライン6,7などの付着性のセルラインに実行できますので、細胞遊走をテストによく使用されます。今日、傷8を実行するためにいくつかの方法が存在して、さまざまな材料が使用される報告されている、つまようじ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
実験のセットアップは倫理的、法的制限を持たず、ロスキレ大学との合意を行った。実験のセットアップの概要については、図 1と図 2の光学カメラの機構の見ることができます。
1. 準備
- ベンチ ・実験の開始前に 70% のエタノールとすべての設備をクリーニングして滅菌の層流ベンチですべての手順を実行します。
- セルの最適な条件を確保する 5% CO2と 37 ° C で従来のインキュベーターで光学カメラを配置します。
- 10 %fbs と 1 x 抗生物質 (ペニシリンとストレプトマイシン) T75 フラスコ DMEM メディア HaCaT 細胞を成長します。
- 1 mL 1 x トリプシンを使用して、セルをデタッチし、サブ細胞の層の上にそれを分散させることによってすべての 3-4 日を育成します。使用する前に部屋の温度に予熱しておく。
2. HaCaT の単分子膜を生成する細胞の 48 ウェル マイクロ プレート
- パスツール ピペット T75 フラスコからメディアを削除します。
- 5 mL × 1 滅菌 PBS を T75 フラスコに追加することによってフラスコ内....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
HaCaT はケラチノ サイト細胞ライン、皮膚の最も豊富なセル型の 1 つです。傷が発生すると、皮膚細胞は増殖し、傷のベッド (図 3) 傷を閉じるために移行を開始します。両方のプロセスは、したがって、適切な治療のため非常に重要です。
光学カメラは、リアルタイムでの両方のプロセスに従うことができます。移行のシステムは 3 つのデータのセットを与える: セルに領域、ギャップ幅およびギャップ領域が覆われています。ラクトフェリンやラクトフェリシン EGF で処理する傷を監視、光学顕微鏡により時間をかけてこれらの 3 つのパラメーターを監視できます。48 時間培養後、EGF は 95% (図 3 a) 無処理の 38% 閉鎖に比べると、傷の閉鎖をもたらした遵守します。ラクトフェリンやラクトフェリシンの異なるバージョンは、親のタンパク質よりもよ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
開発、創傷治癒、免疫学、癌研究の移行の重要性は移行を検討するいくつかの異なる方法をもたらした。移行は、展開の式またはセルによるギャップの閉鎖することができます。ほとんどの場合傷の閉鎖はテスト細胞単層を成長し、特定のフォーム8細胞を成長させるよりもスクラッチに簡単です。我々 の研究は、テクニックはマスターに簡単・低コスト マニュアル掻くため最適化されたメソッドを示します。DNA 合成阻害剤マイトマイシン C、公開メソッド18、およびスループットの高い研究を可能にする光学カメラの使用と比較してスクラッチを最適化するために余分な洗浄を導入しました。
スクラッチの in vitroアッセイは井戸の底に正しくバインドする付着性のセルの行を必要とし、傷を介して移行を検出、増殖が抑制される必要があります。これらの 2 つの機能は、アッセイのため不可欠です。真の移行を検出するには、いくつかのアプローチは14DMSO、または様々 な阻害剤<.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
独立した研究・技術・生産、デンマーク議会許可 #4005-00029
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | 光学カメラ | |
| UniExplorer ソフトウェア | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT 細胞 | Bispebjerg | ||
| Hospital DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | |
| Mg+ and Ca2+ | |||
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | 抗生物質 |
| トリプシン (10x) | Sigma | T3924 | |
| マイトマイシン C | Tocris | 3258 | 増殖を阻害する |
| マイクロタイタープレート | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| インキュベーター | パナソニック | 37°C、5%CO2 | |
| 血球計算盤 | アシストT | ürk (0.1 mm) | |
| ピペットボーイ | Accu-Jet pro |
参考文献
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
- da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
