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方法論記事

培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

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⸱

DOI：

10.3791/57699

⸱

2018年7月4日

 ,  , 
1Center for Microbial Ecology and Technology (CMET), Ghent University

この記事について

サマリー

腸宿主微生物間相互作用は、合成経口コミュニティ、体外消化消化、および小腸上皮のモデルを組み合わせる手法を使用して評価されました。病原体と複数種バイオ フィルム細胞浸潤を評価したり、プロバイオティクス製剤の生存性をテストするために合わせることができる方法を提案します。

要約

ホストと細菌叢との間の相互作用を長い間認識されており、記載されています。口の中は、常駐細菌が発生し、外因性の細菌によって植民地化を防ぐことができます、消化管の他のセクションに似ています。確かに、600 種以上の細菌が口腔内にあるし、単一の個人はいつでも異なる 100 前後を運ぶことができます。口腔内細菌は、居住者の微生物のコミュニティおよび支持の成長そして存続の内で統合になって口腔生態系における様々 なニッチを遵守する能力を有する.しかし、腸内細菌のバランスを乱すに嚥下時に腸に細菌の流れが提案されています。実際には、 pの経口投与は回腸内細菌叢の細菌の組成をシフトしました。生存とシミュレートされた胃腸管内輸送条件を受ける口腔内細菌の生存率を明らかにするのに自然な口腔生態系の簡略表示として合成コミュニティを使用しました。14 種は選択体外唾液、胃、および腸の消化プロセスを受けるおよび腸粘膜上皮をシミュレートするカコ 2 と MTX HT29 細胞を含む細胞のマルチコンパートメント モデルを提示しました。このモデルは、腸肝循環に関与する細胞に飲み込んだ細菌の影響を解明するため提供しています。合成のコミュニティを使用して、制御性と再現性のことができます。したがって、この方法論は、病原体の生存率と関連付けられている炎症変化、プロバイオティック混合物の植民地化の能力を評価するために合わせることができる、最終的には、潜在的な細菌に広範囲 presystemic の循環に影響を与えます。

概要

人間は、細菌細胞の1と同じ数であると同居します。したがって、それは人間のマイクロバイの包括的な理解を得ることが重要重要なは。こうして様々 な細菌やそれらの別の場所でバイオ フィルムを含むいくつかの小さい生息地に分かれていることで口腔内はユニークな環境です。オープンなエコシステムをされて、口の中にいくつかの種は、一時的な訪問者にあります。ただし、特定の微生物を誕生とフォーム編成バイオ2後はすぐに植民地化します。これらは上記の歯肉溝、歯肉縁下の隙間、舌、粘膜表面と歯科補綴、充填3歯の表面で発見されます。細菌はフロックと歯管の内腔の浮遊性細胞壊死の歯髄組織と混合または流体相の中断として存在できます。

アクティブな連続的な宿主細胞と常駐微生物叢4間クロストークがあります。内および種の細菌間で通信し、他の細菌がこれらの主な植民にアタッチしながら、自然の植民の小さい割合だけが組織に付着することが。例えば、微生物間のセル セルの結合、口腔バイオ フィルム、二次植民に統合し、相互作用する微生物電池4の複雑なネットワークの構築にとって重要です。約唾サンプルの細菌の集合体の 70% は正体不明のバクテロイデス門、 Veillonella sp. Prevotellaの sp連鎖球菌sp.についての sp によって形成されます。F. nucleatumは、ポケット内のバイオ フィルムと歯周炎5に関与しているp、t. へとTannerella レンギョウ、後半の植民と集計中間植民です。さらに、連鎖球菌可鍛鋳鉄 s. 血統とs. gordonii歯3を植民地化ことを好む中粘膜と歯科の生息地を占めています。したがって、s. 血統にある下の切歯と犬歯、上部前歯6に放線菌 naeslundiiが見つかったとき。

さらに、先住民マイクロバイは2人の健康を維持する上で役割を果たしています。免疫教育、病原体の膨張を防止する常駐微生物叢が参加しています。この植民地化の抵抗は、サーフェスにアタッチするのに適応しより効率的な成長のための利用可能な栄養素の代謝でのネイティブの細菌をより良い可能性があるために発生します。プロバイオティクス菌株は消化管の通過を生き残るため、アクティブのまま、消化管の上部の場所から飲み込んだ土着菌の永続性が完全に記載されていません。したがって、シミュレートされた胃腸管内輸送条件に人工コミュニティ、口腔生態系の代表を受けます。細菌の細胞の生存率は、腸上皮に似たマルチコンパートメント モデルを使用して評価されました。現在腸シミュレータは、内腔の微生物コミュニティ7の解析の観点から適切な再現性を提供しています。ただし、細菌の付着やホスト微生物間相互作用別に対処、微生物と細胞を組み合わせて、8に挑戦します。対照的に、腸内のインターフェイスで報告されるイベントの成功植民地化の潜在的な機械論的説明を提供するフレームワークを提案する.確かに、このモデル ホスト表面上の微生物の影響を評価する、共同で腸の静的モデルを使用できます。

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プロトコル

1. 系統文化条件と

注: 合成経口コミュニティ系統一般的経口マイクロバイ3に存在によって作曲されました。

  1. アメリカのタイプ文化コレクション (ATCC) から次の菌株を取得:アグリゲイティバクター ・ アクチノミセテムコミタンス(ATCC 43718)、フゾバクテリウム nucleatum (ATCC 10953)による菌(33277) Prevotella intermedia (ATCC 25611) (ATCC 25175)ミュータンス連鎖球菌、連鎖球菌・ sobrinus (ATCC 33478)、放線菌 naeslundii (ATCC 51655)、 連鎖球菌 gordonii (ATCC 49818)、放線菌の細菌(ATCC 15987)、および連鎖球菌可鍛鋳鉄(ATCC 49456)。
  2. ライプニッツ研究所実装 DSMZ ドイツ コレクションの微生物および細胞培養 (DSM 2007 年)、BCCM/LMG 細菌コレクション (LMG 14657) から連鎖球菌血統からVeillonella parvulaを取得および使用連鎖球菌レンサひずみトーベ R9、および連鎖球菌口腔単純性疱疹10。

2. 開発の口腔マイクロバイ多種間コミュニティ代表

注: は、口腔内細菌培養腸上皮への潜在的な接着能力をシミュレートする合成コミュニティを生成します。ヘルナンデス サナブリアらで説明するように 5 μ g/mL ヘミン、1 μ g/mL メナジオン 5% 無菌脱フィブリン馬の血液と補われる血液寒天版の細菌を成長します。(2017)11します。 簡単に言うと。

  1. 1 メートル naoh 水溶液 2 mL でヘミンの 100 mg を溶解、オートクレーブ蒸留水 100 mL を加えます。暗いコンテナーに格納します。0.22 μ m のフィルターを通過中に追加する前に滅菌します。
  2. 96% のエタノール 20 mL にメナジオンの 100 mg を溶解します。0.22 μ m のフィルターを通過中に追加する前に滅菌します。
  3. 血液寒天培地の 1 L を準備 (材料表参照) 製造元の指示、オートクレーブによると。馬の血液とサプリメントを追加する前にクールダウンをさせます。混ぜ、プレートを注ぐ。
  4. 以前に報告された12として変更された脳心臓注入 (BHI) スープを準備します。オートクレーブ後ヘミンの 5 μ g/mL と 1 μ g/mL メナジオンを追加します。
  5. ハンゲイト管中の 9 mL を分注し、ゴム栓、アルミ キャップを閉じます。N2/CO2 (90%/10%) チューブをフラッシュします。
  6. 注射器で嫌気性培地 1 mL を取得し、1.5 mL 遠心チューブに配置します。各菌種のシングル コロニーをピックアップ、媒体で再懸濁します、嫌気性修正 BHI に転送。S. 以上の結果、24 時間培養する必要がありますを除いて、37 ° C で 48 時間孵化させなさい。
  7. 必要な場合は、合成のコミュニティを組み立て前に文化の純度を確認してください。簡単に言えば。
    1. ヘルナンデス サナブリアらのように液体文化から DNA を抽出します。(2010 年)13プライマーを用いた 16S rRNA 遺伝子を増幅する 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) と 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT)、次のプログラム: 95 ° c、5 分、1 分の 95 ° C の 30 サイクル 55 ° C 1 分 1.5 分の 72 ° C に続いて最後の拡張手順72 ° C で 5 分の
    2. 商業的に PCR の製品の浄化キット (材料の表を参照してください)、製造元の指示に従います。
    3. 10 μ L の容量の 0.5 μ L を含む精製製品のシーケンス反応を実行染料 (材料の表を参照)、M13f のプライマー (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)、2.0 μ x 配列バッファー、5 と 20 の 3.2 pmol テンプレートの ng を使用して、商業シーケンス システム キット (材料の表を参照してください)。
      注: この手順を商業的に実行しました。
    4. 最も近い知られている分類群を決定し、RDP 分類オンライン ツール (http://rdp.cme.msu.edu/) と、シナを使用して、元のひずみのシーケンスと比較するすべてのシーケンス (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) で BLAST 検索を実行します。調整サービス (https://www.arb-silva.de/aligner/)。
  8. ヘルナンデス サナブリアらで述べるように、フローサイトメトリー、SYBR グリーン/Propidium ヨウ化染色を使って、インキュベーションの終わりに細胞数を測定します。(2017)11. 105セル mL-1文化を希釈、BHI を変更を使用します。
  9. 剤嫌気性 BHI の 75 mL に 1 mL を追加し、固定相 (6 h) までインキュベートします。以下、各希薄のひずみと嫌気条件下でミックスの 0.75 mL を収集します。
  10. すべての文化が混合されている、一度、縮図の 1 mL を取り出して、BHI の 75 mL に追加。10% 未満の合成のコミュニティを孵化させなさい CO210% H2, 80% N2 48 時間 37 ° C、200 rpm (材料の表を参照してください)。
  11. 2.8 のように細胞の密度を測定します。前に細胞のモデルには、コミュニティを提示します。量的なリアルタイム PCR、プライマーを使用して、アニーリング温度スロムカらの表 1 に群落の組成が行われる(2017)10します。 さらに、初期メンバー現在の13,14の情報を提供するために 16S rRNA 遺伝子増幅配列を使用します。いずれかの身元確認のプロトコルに転写してタンパク質、細菌を示すテンプレートとして cDNA を使用し、系統の有無を明らかにするテンプレートとして DNA を使用します。

3. 一般的な細胞培養方法

注: 細胞培養の一般的な側面は、著者を参照してマスターとステイシー (2007)15。ヨーロッパ コレクションの認証された培養細胞 (カコ 2 ECACC 86010202 と HT29 MTX E12 ECACC 12040401、保健のイギリス, イギリス) から使用される細胞株を取得します。細胞培養用試薬を購入することができます (材料の表を参照)、特に明記しない限り。

  1. メンテナンスとカコ 2 と MTX HT29 細胞株の継
    注: カコ 2 と MTX HT29 細胞は補われた DMEM 培地 (表 1) を含む 25 cm2培養フラスコで日常的に育ちます。60-70% の合流点に達すると、細胞がトリプシンします。
    1. フラスコから細胞培養培地を削除します。/Mg Ca ++++なし 5 mL の PBS で 2 回洗浄します。
    2. トリプシンと 0.22 g/L エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 0.5 mg/L 溶液 2 mL を追加します。フラスコを軽く動かすことによってトリプシン溶液を配布します。1.5 mL のトリプシン溶液を外し、10 分の 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。
    3. 細胞がフラスコ表面から切り離されたかどうか、顕微鏡下でチェックしてください。必要な場合、さらに 5 分間インキュベートします。
    4. トリプシンを不活化するフラスコに補われたセル培地 5 mL を追加します。上下均一な単一細胞懸濁液を得るにピペットで移しなさい。
    5. すぐに、細胞懸濁液の分注 50 μ L を取るし、caco-2 細胞の割合が 1:1 (v/v) または 1:5 v/v HT29 MTX の滅菌の 0.4% トリパン ブルー溶液を混ぜます。カウントの商工会議所にピペッティングしてロード ミックス (材料の表を参照してください)。
    6. 顕微鏡下で実行可能な細胞 (白い明るい細胞) をカウント (製造元の指示を参照してください)。
    7. カコ 2 と HT29 MTX、それぞれシード 4 x 105セル/cm2と 1 × 104セル/cm2の密度で新しいフラスコ。
      注: (1) caco-2 細胞を区別するため、密度に達するタイトな接合を形成します。Trypsinization 前に、以上 confluency を避けるために非常に重要です。フラスコで細胞の異常増殖 trypsinization および/または細胞塊後細胞の剥離でエラーが発生することができます。(2) HT29 MTX 細胞は、粘液産生が高い代謝活性16セル。これらの機能が原因での細胞培養媒体の高速酸性細胞高密度の場合は特に。(表 1) 7 と 7.2 の pH を維持するために細胞培養培地に HEPES バッファーを追加できます。PH が低下すると、メディアがすることができますと、50% 未満と合流、交換です。しかし、もし合流 > 50%、細胞培養を分割する必要があります。

4. 腸宿主微生物インターフェイスをシミュレートする細胞のマルチコンパートメント モデルのアセンブリ

注: は、ダブル室井 (直径 24 mm、細孔サイズ 0.4 μ m; 参照テーブルの材料) で培養を完了します。

  1. 根尖部コンパートメントと基部に 2 mL に完全な細胞の培養基の 1.5 mL を追加します。中古播種時に細胞懸濁液の均一な分布を取得する 20-30 分間インキュベートします。
  2. セクション 3 で説明したカコ 2 と HT29 MTX の細胞培養を trypsinize します。Trypsinization 手順は、群生せず、単一細胞懸濁液中の両方の細胞の均一な分布を達成するために正確に実行する必要があります。
  3. 3.1.8 で説明されているように実行可能なセルをカウントします。
  4. 6.5 × 104セル/cm2カコ 2/HT29 MTX 細胞の 90/10 の割合で細胞密度を調整します。
  5. 細胞懸濁液の均質化、カコ 2 と MTX HT29 細胞量に応じたを補われた細胞の培養基であらかじめ滅菌コンテナーに追加します。商工会議所の頂側から吸引で前培養メディアを削除します。
  6. 優しく、ピペッティングにより細胞懸濁液をミックスし、1.5 mL を商工会議所挿入の頂のコンパートメントに転送します。播種手順には、細胞が堆積する傾向があるセル中断の一定の均質化が必要です。ユーザーと作業速度の経験によって 1-3 井戸を調剤後細胞懸濁液を混合する必要があります。
  7. 優しく前後プレートを移動し、左右から、右 (5-10 回) も取得する井戸で細胞の広がり。インキュベーターに移し、プレートの動きを繰り返します。
  8. 樹状突起と基底区画補われた DMEM に 2 日ごとの更新 15 日カコ 2/HT29 MTX 細胞の共培養を維持します。この時間後の細胞培養媒体は補われた DMEM 抗生物質/抗真菌ソリューションなしに変更できます。
  9. 媒体 2 日ごとの更新で播種後 20-21 日までシステムを維持します。
  10. 電気抵抗を用いたアッセイを開始する前に上皮バリアの整合性を測定 (材料の表を参照)、製造業者の指示に従います。
    1. TEER 機器が完全に充電を確認 (> 24 h) 測定を開始する前に。
    2. 電源とプラスチック製オートクレーブ バッグ カバーから TEER 装置を外します。電極を紹介し、メーターの入力ポートに差し込みます袋に穴をあけます。70% エタノール/水 (v/v) 流れのキャビネットに TEER 機器を導入する前にスプレーしてください。
    3. 電極を消毒するには、15 s. リンスに予め温めておいた細胞培養媒体における電極の乾燥空気に 15 分許可 70% エタノール/水 (v/v) 溶液に電極先端を浸します。
    4. インキュベーター外細胞を取るし、セルをフロー キャビネット内部室温に来るようにします。
    5. メーターが充電器から切断されたことを確認します。オームと電源スイッチを上にモード スイッチを設定します。
    6. 挿入の短いヒントと井戸から長く先端電極を浸すことによって細胞の抵抗を測定します。90 ° の角度で電極を保つため、板を挿入します。

5. 細菌の生存以下の体外消化管輸送条件

注: 準備模擬消化 Minekusらのプロトコルに従う流体(2014)17、後述の変更。純水とすべての希釈液を準備します。フィルターは 0.22 μ m のフィルターを通して、すべてのソリューションを殺菌し、無菌条件下で消化手順を実行します。

  1. 経口消化。
    1. 細菌群集の 3 mL を 50 mL の滅菌チューブに、シミュレートされた唾液 (SSF) (でモル L-1) を含む 3 mL を混ぜて: KCl、15.1;KH2PO43.7;NaHCO36.8;MgCl2(H2O)60.5 (NH4) CO30.06;HCl、1.1;CaCl2(H2O)20.75。ひと唾液タイプ IX A と SSF にブタの胃型 II から 2 グラム/L のムチンから α-アミラーゼの 75 U/mL を追加します。
    2. 37 ° C と 100 rpm での 2 分間混合物を孵化させなさい。DNA の抽出の流れの cytometry の定量化 (S1) 2 mL サンプルを収集します。
  2. 胃の消化力:
    1. (モル L-1) 入っているシミュレートされた胃液 (SGF) の 4 つの mL を追加: KCl、6.9;KH2PO40.9。NaHCO325;塩化ナトリウム 472億;MgCl2(H2O)60.1 (NH4) CO3、0.5 です。HCl、15.6;CaCl2(H2O)20.075。さらに、SGF には 2 g/L ブタの胃型 II からムチンにはが含まれています。
    2. PH を測定し、必要に応じて 1 M 塩酸で pH 3 に調整します。37 ° C と 100 rpm で孵化させなさい。2 mL サンプル (S2) を収集します。
  3. 小腸の消化力:
    1. (でモル L-1) を含む人工腸液 (SIF) の 4 つの mL を追加: KCl、6.8;KH2PO40.8;NaHCO385;塩化ナトリウム、38.4;MgCl2(H2O)60.33;HCl、8.4;CaCl2(H2O)20.3;消化管。
    2. 必要に応じて 1 M NaOH で pH 7 に調整します。37 ° C と 100 rpm で孵化させなさい。2 mL サンプル (S3) を収集します。

6. 細菌の植民地化能力以下の体外消化管輸送条件

  1. 小腸の消化、2,650 × gで 10 分の 2 mL を遠心します。
  2. 上澄みを除去し、抗生物質や抗真菌薬なし補足 DMEM の 5 mL の細菌のペレットをミックスします。
  3. 流れの cytometer を使用してそのまま/ダメージを受けた細胞を定量化を汚し、(参照材料表)、ヘルナンデス サナブリアet al.による記述で(2017)11。
  4. 抗生物質と抗真菌薬なし補足 DMEM で希釈することによって 105実行可能なセル/ml の細胞密度を調整します。
  5. Transwell システムの頂の培地を取り除き、細菌懸濁液 1.5 mL を加えます。細胞共培養系 (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) 一般的な細胞培養条件下で 2 時間。
    注: この時間を 48 h に必要とされる実験的プロトコルに応じて拡張できます。汚染を避けるためにルーチンの細胞維持に使用される別のインキュベーターで共培養を維持できます。
  6. 4.11 で説明されているように上皮バリアの整合性を評価するためのインキュベーション後 TEER 値を測定します。
  7. インキュベーション時間を完了すると、根尖部のメディアを削除し、さらなる分析 (S4) の 0.5 mL を収集します。乳酸脱水素酵素 (LDH) アッセイによる細胞生存率の評価のためメディアのサブサンプルを使用できます (材料の表を参照)、製造業者の指示に従います。
  8. HBSS (NAC バッファー) HT29 MTX による粘液の可溶化および付着細菌を回復するに 10 mM N-アセチルシステインの 0.5 mL を追加します。攪拌下の 1 h の 37 ° C で版を孵化させなさい (135 rpm は、材料表を参照してください)。
  9. 微量遠心チューブ (S5) に NAC HBSS を回復し、2 回 1 ml の DPBS セルを洗浄します。
  10. 0.5 %0.5 mL を加えるトリトン X-100 (w/v)、単分子膜上にピペッティングにより細胞を混乱させる、1 分速度は洗剤で細菌の細胞の損傷を避けるために重要な液体と渦を回復します。
  11. 2,650 x gで 5 分間細胞を遠心し、上清 (S6) とペレット (S7) を分離します。

7. サンプル分析

注: は、収集されたサンプル (S1 S7) 細菌の生存率を評価して次の模擬消化管消化、腸の細胞に潜在的な接着を分析します。

  1. 細菌の生存率: 0.45 μ m を 2 回サンプル S1 S5 を渡すとライブ/死細胞染色を用いた細菌の細胞を定量化し、フローサイトメトリー、ステップ 2.811で示される。
  2. 潜在的な接着: S1 S6 のシリアル希薄 (-8-1) の準備し血液寒天培地に 10 μ L を連勝、BHI プレートを変更します。24-48 h. プレート原液 S7 の同じボリュームの嫌気条件下 37 ° C で孵化させなさい。
    1. 付着細菌の分類学的同定:
      1. 文化ループと個々 のコロニーをピックアップし、ヌクレアーゼ フリー水の 10 μ L をそれぞれ再懸濁します。この懸濁液の 4 μ L を収集し、プライマーと 2.7.1 で説明する条件を使用して 16 s rRNA 遺伝子の pcr のテンプレートとして使用します。
      2. 2.7.3, と 2.7.4 に記載されている手順を使用して、シーケンスの検証プロトコルを次のシーケンスを実行します。
  3. 合計の DNA の抽出、qPCR 定量化および 16S rRNA 増幅シーケンス、RNA の抽出、必要に応じてプロファイリング トランスクリプトームなど下流の分析をさらに。
    注: サンプリング直後後流れの cytometry の定量化を行った。グリセリン膜細胞のコントロールとして 70 ° C、3 分にさらされるサンプルは使用されました。バック グラウンド ノイズは、消化液や細菌なし細胞培養モデルから得られたサンプルのフローサイトメトリーによる測定によって評価しました。すべてのサンプルは、3 通で測定しました。

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結果

このプロトコルは、生存とシミュレートされた胃腸管内輸送条件を受ける口腔内細菌の生存率の解明に適したモデルの生成に します。個々 の緊張からそのままなセルのカウントは約 108細胞 mL-1前合成のコミュニティでは、コミュニティ (確立中に実行可能なセルの 90% 以上含まれている多種間の縮図の作成図 1Aおよび1 b)。細菌の生存率ライブ/死者の定量化に基づく、各消化手順 (図 2) 後減少します。これは、生理的条件下で発生する、小腸消化液中に含まれる胆汁酸塩の胃の通過中に酸性の pH の結果をすることができます。In vitroとin vivoの両方消化消化を通過中に生存環境の変動に依存するかもしれません (例えば、 対供給絶食条件)、あるいは細菌保護プロセス (胞子形成...

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ディスカッション

口腔マイクロバイは、最近いくつか著者20,21によって報告された人間の健康の重要な要素です。前の調査結果は、大量の細菌を含む唾液の摂取が免疫のプライミングのためメインのサイトの 1 つである小腸の微生物の生態系に影響を与えることができますをお勧めします。ホスト上の微生物のコンポーネントの影響を解明して腸の上皮と粘液分泌細胞によって表されるホスト インターフェイスで静的な上部消化管消化モデルの組み合わせです。

In vitroモデルは、機構研究を実施し、背景知識を減らすため、意図を達成するための研究を行う研究生体内でより効率的より良いターゲットの基本的なツールです。このため、純度、生存率、および合成微生物コミュニティを確立する前に無菌共生栽培の最適な成長を確保する重要です。生存率と分析にバイアスを避けるために、細胞培養への暴露前に細菌群集組成の評価をお勧めします。破損した細菌の数が多い可能性があります接着を妨げるし、さらに細胞モデル...

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開示事項

著者がある何も開示するには

謝辞

作者は感謝してマルタ カラタユ アロヨ (FWO ポスドク ・ フェローシップ 12N2815N) フランダース研究財団から財政支援を認めます。エマ ・ ヘルナンデス サナブリアはフランダースの技術革新と起業家精神 (Agentschap フォール Innovatie ドア Wetenschap en テク、IWT) でサポートされている研究員。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
STRAINS<
em>Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture CollectionATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture CollectionATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type CultureコレクションATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture CollectionATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture CollectionATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture CollectionATCC 33478
Actinomycesviscosus American Type Culture CollectionATCC 15987<
em>Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis >American Type Culture CollectionATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria CollectionLMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell CulturesDSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture CollectionATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cellsEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures86010202
HT29-MTX cellsEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures12040401
試薬および消耗品
脳心臓注入(BHI)ブロスOxoidCM1135
血液寒天OxoidCM0055血液寒天培地
MenadioneSigmaM9429
HeminSigmaH9039
5% 滅菌除細動馬血液E&O LaboratoriesLtd,P030
InnuPREP PCRpure KitAnalytik Jena845-KS-5010250PCR purification kit
Big DyeApplied Biosystems4337454Dye for sequencing
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kitApplied Biosystems4337456
SYBR グリーン IInvitrogenS7585
ヨウ化プロピジウムInvitrogenP1304MP
T25 培養フラスコ コーティングされていない、細胞培養処理済み、通気済み、滅菌済みVWR734-2311
トリプシン-EDTA 溶液Sigma-AldrichT3924-100ML
トリパンブルー溶液
0.4%、液体、滅菌ろ過済み		Sigma-AldrichT8154 
PBSGibco14190250
DMEM 細胞培養培地、GlutaMAX および PyruvateLife テクノロジー31966-047
Corning Transwell ポリエステル膜細胞培養インサートSigma-AldrichCLS3450-24EA
Mucin from ブタ胃 II型  Sigma-AldrichM2378
不活化ウシ胎児血清Greiner Bio One758093
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062
Triton X 100 for molecular biologySigma-AldrichT8787 
カルシウムを含まないDPBS、マグネシウムGibco14190-250
Pierce LDH Cytotoxicity Assay KitThermo Fisher Scientific88953
Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 & micro;mCorning Costar Corp3450
Nuclease-free waterServa Electrophoresis28539010
EQUIPMENT
Neubauer 計数室 CarlRothT729.1
BD Accuri C6 Flow cytometerBD Biosciences653118
PowerLyzer 24 ホモジナイザーMoBio13155
T100 サーマルサイクラーBioRad186-1096
フラッシュシステムカスタムメイド-
InnOva 4080 インキュベーター シェーカーニューブランズウィック サイエンティフィック8261-30-10072.10
Memmert CO2 インキュベーターMemmert GmbH & Co.ICO150med
ミリセルERS (電気抵抗システム)EMD Millipore, Merck KGaAMERS00002
Millipore Milli-Q academic, ultra pure water systemMillipore, Merck KGaA-Shaker
(ROCKER 3D basic)IKA40000006.10用シェーカー
2

参考文献

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533(2016).
  2. Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
  3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
  4. Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
  5. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
  6. Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
  7. Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
  8. Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133(2014).
  9. Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
  10. Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
  11. Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235(2017).
  12. Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
  13. Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340(2018).
  14. Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
  15. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
  16. Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
  17. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
  18. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
  19. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
  20. Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
  21. Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
  22. Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307(2015).
  23. Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
  24. Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
  25. Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
  26. Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
  27. Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
  28. Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).

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