マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅

サマリー

この作品は、マイクロ流体の液滴ベース プラットフォームの作製とポリアクリルアミド微粒子微粒子に PCR の拡大のためのアプリケーションのメソッドを提供します。微粒子 PCR 法は、DNA 二重鎖を分離することがなく単一座礁させた DNA 産物を得ることが可能になります。

要約

マイクロ流体の液滴ベースは、コントロールのサイズと得られた微粒子の形態を提供するマイクロ流路における均一微粒子の信頼性の高い生産を有効にします。Acrydite DNA プローブを用いた共微粒子を試作されました。非対称 PCR、exonuclease 消化、ストレプトアビジン コートした磁気ビーズの分離などさまざまな方法を使用して、単一座礁させた DNA を合成できます。ただし、これらのメソッドは効率的に大量の高純度 ssDNA を使用できません。ここでは、ssDNA 可能効率的に増幅および PCR の反作用の管からピペットで単に dsDNA から分離する方法を詳述した微小球 PCR のプロトコルについて述べる。SsDNA の増幅は、DNA マイクロ アレイと DNA SELEX (指数強化による ligands の組織的進化) プロセスのための潜在的な試薬として適用できます。

概要

一本鎖 DNA (ssDNA) は、DNA ハイブリダイゼーション^1,2のための特有の性質による分子認識要素 (MRE) として広く考えられています。SsDNA 合成システムの開発は、DNA マイクロ アレイ³oligotherapeutics、診断、および補完的な相互作用^4、5の統合分子センシングなどの生物学的につながることができます。

日には、マイクロ ポリマー粒子実証されている正常にマイクロ流体デバイスを用いたします。いくつかのマイクロ流体技術は、マイクロ環境^6、7の連続的な流れの非常に均一な微粒子を製造するための強力なように証明されています。

李らの研究では⁸液滴を用いたマイクロ流体システムを含まない共重合性の oligo 微小球と一本鎖 Dna の増幅のマイクロ合成が報告されました。マイクロ流体プラットフォームは、PDMS (ポリジメチルシロキサン) の 2 つの層から構成されます: 微小球とフラット部分下を生成するためのマイクロ チャネル ネットワークの上部。これら 3 種類の PDMS 流路から成っている: 1) 液滴生成のためのチャネル、2) 2 つの溶液を混ぜるため蛇紋岩のチャネル、3) 微小凝固用逐次重合のチャネル中心の流れ。2 流れを単一 PDMS 路に導入すると、流れが狭いオリフィス構造を強制できます。チャネル形状、流量、粘度など流動挙動のサイズと、微粒子の形態に影響を与えます。したがって、液体主流はマイクロ monospheres^9,10に分けることができます。

ここでは、詳細な微小球-PCR のプロトコルは ssDNA の増幅に提供されます。まず、液滴を用いたマイクロ流体デバイスの設計プロセスを説明します。その後、どのポリアクリルアミドの微粒子が補完的な方法でランダム DNA テンプレートの機能ことができる方法を説明します。最後に、一本鎖 Dna を増幅するため微小球 PCR のプロトコルが表示されます。

プロトコル

1. PDMS マイクロ流体システムの作製

1. ベース樹脂と触媒 10:1 の体積比で混合して液体の PDMS プレポリマーの 20 mL を準備します。微小流体ネットワークの上の部分のシリコン ・ ウエハに準備された SU 8 金型に液体 PDMS の 10 mL を注ぐ。底の平たい部分の金型構造を持たないシリコンウェハ上液体 PDMS の同じ量を注ぐ。
   注: 微小流体ネットワークは CAD プログラムの設計、典型的なフォトリソグラフィ プロセス (見なさい補足数字) を使用してマスターを作製するためにフォトマスクに変換されます。このマスターは、シリコン基板¹¹のネガ型フォトレジスト SU 8 型で構成されます。
2. ホット プレートと 75 ° C、30 分間の治療で液体の PDMS プレポリマーでコーティングされた 2 つのシリコンウェハーを配置します。
   1. 手動で SU 8 型から硬化した PDMS 層をはがします。マクロの流体サンプル ミクロン スケールの流路に接続するレプリケートされた微小流体ネットワークの油ポートに穴パンチング ツール ラウンド 1.5 mm 径に合わせます。手動で貫通穴をパンチします。
   2. 3 回の 2 つのソリューションと出口ポートの形成プロセスを抜き、これを繰り返します。
3. 上と下 PDMS レイヤー サンプルごとに数秒の手持ちコロナ treater¹²を使用しての両方の親水性表面処理を行います。
   1. PDMS-PDMS 接合プロセスのホット プレートを使用して 30 分の 2 つのプラズマ処理による PDMS 層と 90 ° C で熱をスタックします。接着・漏れ試験試作したデバイスのため 3 つの入口ポートにシリンジ ポンプを使って加圧水を供給します。

2. ポリアクリルアミド オリゴ微粒子の生産

1. ビーズ混合物の表 1で詳しく説明を準備します。
2. 渦と簡単に遠心分離機標準 ssDNA acrydite ラベル プローブ (Ap, 100 μ M) と acrylamide:bis (19:1) 原液。
3. ソリューションを準備私ソリューション、ssDNA (acrydite プローブ) の 10 μ L、5 x TBE のバッファー (1.1 M トリス; 900 mM ホウ酸; 25 mM EDTA) の 10 μ L、5 μ L 水の bis 40% アクリルアミドの 25 μ L を混合することによって。ソリューション II を過硫酸アンモニウム 20% の 50 μ l を準備します。
4. 準備 2 注射器は個別に私とソリューション II、液でいっぱいやマイクロ流体プラットフォームにソリューション フローを導入するポンプにそれらをマウントします。0.4% と混合鉱物油を準備、微粒子の表面凝固 TEMED。
   注: TEMED は遊離基の安定剤としてよく知られています。フリーラジカルは、アクリルアミドの重合を触発するために過硫酸アンモニウム (AP) と高分子の形成の率を加速できます。
5. 4 ml の連続的な流れを生成する鉱物油の瓶を埋めます。
6. マイクロ流体貯蔵所としてガラスの瓶のキャップの 2 つのポートに 2 つの管を挿入: 空気圧縮機とマイクロ チャネル ネットワークへ圧油を供給するため流体ポートからガラス瓶の中に圧縮空気を適用するための空気圧ポートガラスのボトルから。ガラス瓶とマイクロ流体デバイスに油ポートの間のチューブを接続します。
   1. マイクロ流体デバイス内の 2 つのソリューションのポートにシリンジ ポンプから 2 つのソリューションを供給するためにチューブを接続します。ビーカーに生成された微小球を転送するために出口にチューブを挿入します。
7. 0.4 - 0.7 mL/h の調整圧縮空気圧レギュレータ (82 116 kPa) を使用して圧縮機にシリンジ ポンプの流量を設定します。ホット プレートのガラス ビーカーで磁気スターラー バーの回転速度 (500 rpm) を設定します。シリンジ ポンプを動作し、電磁弁¹³のオン/オフのコントロールを使用してガラス瓶の中に外部コンプレッサーによる圧縮空気を供給します。
8. デジタル顕微鏡を用いたフロー中心の幾何学における微粒子の形成およびガラス ビーカーで生成された微粒子の凝固を観察します。
   注: ソリューションおよび鉱物油流の圧の流量に依存する、微粒子のサイズと生産の速度(表 2).

3. ポリアクリルアミド オリゴ マイクロスフィアの実行カウントします。

1. 検定定量化のためガラス検定にポリアクリルアミド オリゴ マイクロスフィアと場所水溶液の小さな量 (約 100 μ L) を取るし、ゆっくり数える商工会議所の井戸を微粒子懸濁液を埋めます。
   注: 詳細については、http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer を参照してください。
2. 顕微鏡と手集計カウンターを使用すると、16 の正方形の 1 つのセットは、マイクロスフィアを数えること。検定を商工会議所の次のセットに移動し、16 コーナーのすべての 4 つのセットはカウントまでカウントを実行します。
3. 平均微粒子数を決定、オリジナル ビーズ懸濁液中の微粒子数を計算します。
4. 微小球の 100 μ L を 1.5 mL 遠心チューブに転送します。穏やかな (400 x g) 遠心分離、ピペットで上澄みを削除します。

4. ポリアクリルアミド Oligomicrosphere の表面に DNA ハイブリダイゼーションを行う

注: 同じ DNA プローブ 5'-NH₂-5'-acrytide の変更ではなくグループは私のソリューションに追加されますが、並行して Ap を含む微小球のテストします。DNA の交配の結果は図 2のとおりです。Cy3 標識の相補的なオリゴヌクレオチド プローブ (cAp) ソリューションは、暗い部屋に置くべき。

1. Cy3 キャップ 1xTE バッファーの 100 μ L を使用してを再懸濁します (TE バッファー: 10 mM トリスと 1 μ m の EDTA、pH 8.0) 最終濃度 100 μ M を達成するために。たとえば、TE バッファーとアルミ箔で覆われている微量遠心チューブへの転送の 100 mL のキャップの 1 pmol を再懸濁します。
   注: 鎖シーケンスは、表 3を参照してください。
2. Ap 共微粒子を含む滅菌 1.5 mL 遠心チューブに Cy3 キャップの 100 μ M を追加します。
3. チューブを数回タップをミックスし、1 h、暗所に室温で孵化させなさい。
4. 上澄みを廃棄し、ピペッティングを残留バッファーを削除します。
5. TE バッファーの 500 μ L で 3 回を洗い流してください。
6. 遠心チューブをやさしくタッピングによる微小球を再懸濁します。4.4 のステップを繰り返します。
7. スライド ガラス (75 mm × 50 mm) とイメージングの前にアルミ箔でカバーに微小球を配置します。

5 一本鎖 Dna を増幅するため非対称的な PCR

1. 分析する一本鎖 Dna を増幅するためには、非対称の PCR 試薬ミックスを準備します。表 4氷の上で試薬を解凍します。氷の上の Taq のポリメラーゼ酵素 (50 U/μ L) を保持しないが、むしろ必要になるまでの-20 ° C で保存します。
2. 優しく渦すべて試薬 10 10,000 x g でチューブを簡単に遠心分離機と s。
3. 説明したようにすべての試薬を組み合わせて表 4.
4. たちにサンプルを置き、次の条件下で非対称的な PCR を開始: 25 サイクル (95 ° C、30 s、52 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s)、85 ° C、5 分、4 ° C で保持

6. 一本鎖 Dna を増幅するための微小球 PCR

注意: この節では、PCR の反作用の管の一本鎖 Dna を増幅するためのプロトコルを説明します。微小球 PCR の反作用は、50 μ L 反応体積ので行われました。表 5に一本鎖 Dna を増幅するために使用する詳細なシーケンスのとおりです。この場合、微粒子の表面に Ap は、相互に補完するランダム DNA テンプレートをアニールすることができます。これは相補的 dna (アンチセンス dna、図 3) を生産するための非常に重要なステップです。拡張 DNA は、微粒子 pcr のテンプレートとして使用されます。

1. 微小球 PCR 試薬ミックスを準備します。表 6 ; 氷の上で試薬を解凍します。しかし、氷の Taq のポリメラーゼの酵素を保持しません。必要になるまでの-20 ° C で保管してください。
2. 優しく渦すべて試薬 10 10,000 x g でチューブを簡単に遠心分離機と s。
3. 顕微鏡による簡易約 〜 25 球を取得します。
   注: 1 つの反作用の管球の数は、40 倍の倍率で光学顕微鏡を使用して計算されます。約 25 ~ 微粒子、微粒子に PCR の拡大のため使用されます。詳細な情報は、手順 3 では。
4. 説明したようにすべての試薬を組み合わせて表 6.
5. たちにサンプルを置き、次の条件下で非対称的な PCR を開始: 25 サイクル (95 ° C、30 s、52 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s)、85 ° C、5 分、4 ° C で保持
6. 次の増幅ローディングバッファー x 6 の 8 μ L を追加し、各サンプルの 15 μ L を 2% アガロースゲルに読み込みます。次に、1 で 35 分間 100 V で電気泳動を実行 x TAE (pH 8.2 40 mM 1 mM EDTA トリス酢酸トリス-酢酸-EDTA) バッファー。

7. 共焦点顕微鏡による買収

注: 共焦点の顕微鏡下微小球 DNA プローブの交配の結果が作成されます。ImageJ を用いた画像解析が実行されます。

1. ホルダーに顕微鏡のステージにハイブリダイズした微粒子を修正します。
2. (ヘリウム ネオン レーザー, 543 nm ライン) のレーザーを選択し、レーザー制御でそれをオンにします。
3. 顕微鏡制御で対物レンズを選択します。
4. Cy3 およびチャネルを構成コントロールの目的のフィルターを選択します。
5. 実験を開始し、サンプルを確認します。表 7は、共焦点顕微鏡の設定をまとめたものです。

結果

作製した高分子液滴を用いたマイクロ流体プラットフォームは、2 つの PDMS 層 (図 1 a) から構成されます。マイクロ チャネル ネットワークの 3 種類の微粒子を生成するため使用される: 1) フロー中心の幾何学図 1b2) 私とソリューション II、混合溶液の蛇紋岩チャネル 3) 微粒子の重合チャネルで示すように、凝固。すべてのチャンネルの高さは 60 μ m だった。混合し、重合のチャネル長は 74.35 ミリメートルと 94.45 mm であった。2 流体流れと鉱物油の流れの 1 つのマイクロ チャネルの幅は 100 μ m、200 μ m であった。微粒子形成用オリフィス構造は、50 μ m の長さの 25 μ m 幅だった。ディフューザー構造の角度が 37 ° です。鉱物油の連続的なフローの研究室での空気圧コントロール システムとソリューション フロー (図 1 c) の 2 ...

ディスカッション

DsDNA の汚染物質は、ssDNA 増幅における主要な問題です。従来の非対称 PCR 増幅¹⁵dsDNA 増幅を最小限に抑えることは難しいままです。また、ssDNA を生成するための技術的な改善は、サンプル スループットの効率を高めるために私たちを有効にしている、ssDNA の分離はまだ不完全な精製収率、高コストのため問題となります。

非対称的な PCR は ssDNA を操作するときに使用される最も挑戦的な方法のひとつです。このメソッドは、等しくない量 (例えば20:1 の比率) ssDNA の大きな量を生成するためにプライマーを適用されます。ただし、ssDNA をもたらすすべての増幅反応を最適化する非常に困難です。したがって、合力⁴から副産物 (dsDNA) を回避する必要があります。

追加の分離手順なし ssDNA を生成するために acrydite 共重合法に基づく DNA プローブをあてるポリアクリルア...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
液体ポリジメチルシロキサン、PDMS	ダウコーニング株式会社	Sylgard 184	チップ
40% アクリルアミドの成分:bis 溶液 (19:1)	バイオ・ラッド	1610140	共重合可能なオリゴマイクロスフェアの成分
過硫酸アンモニウム、APS	Sigma Aldrich	A3678	アクリルアミドの硬化剤:bis 溶液
N,N,N′,N′-テトラメチルエチレンジアミン、TEMED	Sigma Aldrich	T9281	過硫酸アンモニウムの触媒
鉱油	シグマアルドリッチ	M5904	表1。解決策III.マイクロスフェア試薬
Cy3の成分は、相補的オリゴヌクレオチドプローブを標識し、	Bioneer	を合成しました	。配列情報
ssDNAアクリダイト標識プローブ	Bioneer	を合成しました	。解決策 I. マイクロスフィア試薬の成分
Tris	Biosesang	T1016	TE緩衝液、pH緩衝液
EDTA	シグマアルドリッチ	EDS	の成分、イオン除去(Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA増幅
共焦点顕微鏡	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere
surface Light Microscope	ニコンインスツルメン	日食 80i	マイクロスフィアの数を計算する
T100 サーマルサイクラー	バイオ・ラッド	1861096	ssDNA 増幅
ハンドヘルド コロナ トリーター	エレクトロテクニック	BD-20AC 実験室 コロナ トリーター	親水性 表面処理
ホットプレート	液体	PDMS	HI-1000
			溶液Iと溶液IIの均一な流れ
コンプレッサー	Kohands	KC-250A	溶液III
の流量制御 Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	マイクロスフェアの数を計算