2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Summary

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。

Abstract

細胞はタンパク質、代謝、核酸などの生体分子間の相互作用によって規制されています。タンパク質間相互作用 (PPI) の調査に目新しさはなく、内因性のタンパク質代謝相互作用 (PMI) を特徴付けることを目指して実験的アプローチはむしろ最近開発を構成します。ここで、PPI と選択、餌と呼ばれるタンパクの PMI の同時解析を可能にするプロトコルを提案する.我々 のプロトコルを最適化しましたシロイヌナズナ細胞文化し、親和性の浄化 (AP) を組み合わせた質量分析法 (MS)-基づくタンパク質と代謝産物の検出。一言で言えば、親和性タグに融合餌蛋白を発現するトランスジェニックのシロイヌナズナ ラインの最初ネイティブ細胞抽出物を取得する服従分離します。抗タグ抗体を使用して、餌の蛋白質のタンパク質と代謝産物のパートナーをプルダウンします。ワンステップ メチルtertを用いたアフィニ ティー精製錯体を抽出-ブチル エーテル (MTBE)/メタノール/水法。ながら代謝を極または疎水性相に分離、ペレットの蛋白質を見つけることができます。代謝産物やタンパク質は、超高性能液体クロマトグラフィー質量分析法 (高精度 MS または高精度・ MS/MS) によって分析しています。空のベクトル (EV) 制御線は、偽陽性を除外する使用されます。プロトコルの主な利点は、近く生理的条件 (細胞ライセート) で並行してターゲット蛋白質のタンパク質と代謝産物のパートナーの同定が可能です。提案手法は簡単です高速で、植物細胞培養以外の生物学的システムに簡単に適応することができます。

Introduction

方法はここで説明近く体内細胞ライセート条件で選択の蛋白質の代謝産物やタンパク質のパートナーの同定を目指す。それは、今日特徴付けられるより多くより多くの代謝物が規制の重要な機能の¹であることが推測されています。代謝生物学的スイッチ、活動、機能、および/またはその受容体タンパク質^2,3,4のローカリゼーションを変更として使用できます。過去 10 年間で識別 PMI体内のまたは近い-生体内での条件でを有効にするいくつかの画期的な方法が開発⁵をされています。使用可能なアプローチは、2 つのグループに分類できます。最初のグループは構成蛋白質パートナーをトラップするために知られている代謝物餌で始まる技術です。親和性クロマトグラフィー⁶、薬物親和性応答ターゲット安定性アッセイ⁷、化学療法プロテオミクス⁸、⁹をプロファイリング熱プロテオームなどの方法。2 番目のグループは、小分子リガンド^10,11を識別するために知られていた蛋白質で始まる 1 つのメソッドで構成されています。

MS ベース リピドと相まって AP が酵母¹².タンパク質脂質複合体の分析に使用されました。開始点として、著者はエルゴステ ロールの生合成に関与する 21 の酵素を表現する酵母を使用、タンデム親和性の浄化 (蛇口) タグに融合した 103 キナーゼ。酵素の 70% と、キナーゼの 20% は、複雑なタンパク質-脂質相互作用ネットワークに光を流して別の疎水性配位子をバインドする発見されました。

以前は、我々 は、同様に脂質を極性、半極性化合物もに結合したまま細胞ライセート¹³から分離されたタンパク質複合体を示すことができます。我々 は ap 通信を最適化することを決めたこれらの調査結果に基づいて、メソッドは植物細胞と親水性化合物¹⁴の^10、11以前公開します。この目的のため、バン リーネら2010 年工場 PPI 研究¹⁵で正常に使用によって記述されたタップ ベクトルを使用しました。トランスジェニックは行を取得するために必要な時間を短縮、シロイヌナズナ細胞培養しました。我々 採用ワンステップ メチルtert-ブチル エーテル、(MTBE)/メタノール/水抽出法、単一のタンパク質 (ペレット)、脂質 (有機相)、および親水性代謝産物 (水相)¹⁶の評価を許可します。親和性の浄化実験。EV の制御線は、偽陽性、単独でのタグに結合する蛋白質などを除外する導入されました。タグ付け (5) の 3 つのコンセプトの証明としてヌクレオシド二リン酸キナーゼ (NDPK1-NDPK3) シロイヌナズナのゲノムに存在します。その他の所見の中で我々 は NDPK1 がグルタチオンSと対話することを示すことができます-トランスフェラーゼとグルタチオン。したがって我々 は NDPK1 は glutathionylation¹⁴に服従することを証明できます。

要するに、提案するプロトコルはタンパク質間およびタンパク質-低分子間相互作用ネットワークの特性評価に重要なツールで、既存方法と比べて大きな進歩を構成します。

Protocol

遺伝子組換えシロイヌナズナ細胞培養は並ぶ、クローン作成、変換、選択、および成長の条件などの準備は、¹⁷で見つけることができます。EV の制御線が偽陽性を補正するため推奨されているに注意してください。実験の前に西部のしみの分析は、例えばタンデム親和性タグの G タンパク質部分に対する IgG 抗体を用いて餌蛋白の過剰発現を確認します。植物細胞培養材料から成長媒体を分離することが重要です。

1. 実験前に植物細胞材料を準備します。

1. 金利¹⁸のタンパク質を過剰発現 PSB L aセルライン文化を育てます。
   1. 4.43 g/L MSMO 混合 30 グラム/L のショ糖を含んでいる MSMO 媒体を準備します。1 M コで 5.7 をバッファーの pH およびオートクレーブ ソリューションを調整します。実験前に 0.5 mg/L α-ナフタレン酢酸、0.05 mg/L カイネチン 50 μ g/mL カナマイシンと媒体を補足します。
   2. MSMO 中穏やかな攪拌 (130 rpm) と軌道プラットフォーム シェーカーに 100 mL フラスコ 50 mL に培養細胞形質転換体を養います。20 の ° C および光強度での培養室で細胞成長 80 μmol m^-2の^-1に等しい。
   3. 新鮮なメディア 7 日ごとに 1:10 の希釈にサブカルチャーのセルです。
2. フィルターとしてナイロン メッシュを使用した真空ポンプと組み合わせてガラス漏斗を使用して対数増殖期の細胞を収集します。アルミ箔で潜入をラップし、液体窒素で凍結します。
   注意: 液体窒素は非常に寒い。不適切な処理はやけどを引き起こすことができます。適切な保護具を着用、手袋、保護眼鏡と白衣に絶縁熱を含みます。

2 プロトコル] をタップします。

注: 次の手順は、前田ら2014年¹¹とヴァン ・ リーネら2011年¹⁷から適応されます。

1. 収穫および冷凍プラント ミキサー ミル (20 Hz で 2 分) または乳鉢と乳棒を使用して微粉末を取得する文化物質の細胞をホモジナイズしてください。サンプルあたりの地盤材料 (総蛋白の約 90 mg に相当) の分注 3 g。液体窒素中古冷蔵装置を使用して、この手順でサンプルの融解は避けてください。
   注: AP プロシージャの先頭に –80 ° C で 50 mL のチューブの地面工場原料のストア。
2. 3 ml の氷冷換散バッファーの液体窒素冷却モルタルでサンプルをカップ刻んだ (0.025 M トリス-HCl pH 7.5; 0.5 M 塩化ナトリウム; 1.5 mM MgCl₂; 0.5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 希薄商業プロテアーゼ阻害剤のカクテル 100 1 mMPMSF) 素材の解凍まで。一度サンプルを分解すると、すぐに次のステップに進みます。
   注: 換散バッファー フレッシュを準備します。この段階で空白のサンプルをご紹介します。MS 検出で問題が発生することができます彼らと洗剤は推薦されません。
3. 2 mL の遠心管に 20,817 x g で 4 ° C で 10 分間遠心する材料を分ける細胞の残骸を削除するにはクリア 15 mL コニカル遠心管中のライセートの 3 mL を収集します。
4. 遠心分離のステップ中に IgG セファローズ 4 b ビーズを平衡します。サンプルあたりビーズの 100 μ L 分注 1 mL の溶解バッファーで洗っ。渦にビーズとフラッシュ スピンを再懸濁します。換散バッファーを破棄の手順を 2 回繰り返します。換散バッファーの 400 μ L でビーズを再懸濁します。
5. 集められた植物のライセートにビーズを追加し、4 ° C で 1 時間の回転ホイール上の混合物を孵化させなさい
6. 注射器に混合物を転送は、スピン列とフィルター細孔サイズ 35 μ m ライセートを渡す適用圧力とルアーロック キャップを介して結合。添付の複合体とビーズ ライセートを経るがフィルターのままになります。
   注: 必要に応じて、真空マニホールド システムを使用します。ビーズを害するように穏やかな圧力を適用することを確認します。
7. 最初は 10 ml の洗浄液のビーズを洗浄 (0.025 M トリス-HCl pH 7.5; 0.5 M の NaCl)、1 mL の溶出バッファーした後、(10 mM トリス-HCl pH 7.5; 150 mM の NaCl; 0.5 ミリメートルの EDTA が 1000 倍希釈の E64 と 1 mM PMSF)。列または真空マニホールド システムに接続されている注射器を使用して洗浄を行います。
   注: とき真空マニホールド システムを使用して必ずビーズを害するように穏やかな圧力を適用します。
8. 400 とビーズをインキュベート μ L 50 U のタバコの改良版を含む溶出バッファーの etch プロテアーゼ ウイルス (AcTEV)。16 ° C で 30 分間 1,000 rpm でテーブル シェーカーを使用します。
   注: は、下部の溶出バッファーを追加する列を閉じるにプラグインを使用してください。
9. 列に酵素の余分な部分 (50 U) を追加し、上記の条件、同じの下で次の 30 分のための混合物を孵化させなさい。
10. (1 分、20,817 x g) 遠心分離または真空マニホールドのいずれか 2 mL 遠心チューブに溶出液を収集します。複合体の残りを削除するには、200 μ L の溶出バッファーを使用して追加溶出のステップを紹介します。
    注: 保存-20 ° C または –80 ° C でサンプルまたはすぐにタンパク質と代謝物抽出の手順に進みます。氷の上の凍結サンプルを解凍します。

3 西部のしみの分析

1. 餌の存在を確認するには、収集された溶出液中のタンパク質は-SDS-PAGE および西部のしみの分析を実行するのに蛋白質-代謝物を含む溶出液の 10 μ L を使用します。興味の蛋白質を識別するためにストレプトアビジン結合蛋白質 (レバレッジ) バン リーネら2011¹⁷に記載されていると、残りの TEV プロテアーゼ切断後タップ タグの一部に対して一次抗体をマウスを使用します。次に、HRP と相まってセカンダリ ヤギ抗マウス抗体を使用します。

4. 代謝物および蛋白質の抽出

注: このプロトコルは、Giavalisco et al. 2011¹⁶から適応されます。

注: この手順以降から高精度-MS-グレードのソリューションを使用します。

1. メチルtertの 1 mL を追加-ブチル エーテル (MTBE)/メタノール/水の収集した溶出液に溶剤 (3:1:1) と逆解析によるサンプルをミックスします。溶媒は抽出工程の前に-20 ° C に冷却されることを確認します。
   注意: MTBE、メタノールは、有害な物質です。ヒューム フードの下での抽出手順を実行し、適切な個人用保護具、手袋などを着用します。
2. 0.4 mL のメタノール: 水 1:3 ソリューションを各サンプルに追加し、逆解析によるサンプルの内容をミックスします。
   注: メタノール: 水溶液との混合物の摂取は相分離の結果します。上部の段階には脂質が含まれています、下相極性、半極性代謝物および蛋白質は、ペレットで見つけることができます。
3. 相を分離し室内温度で 2 分間 20,817 x g でサンプルを遠心分離機、脂質測定 (このプロトコルでは行われていない) の上部の段階を収集 1 mL 容量と手動の液体ハンドリング ピペットを使用して。
4. 逆解析による 0.2 mL のメタノールとミックスを追加します。
5. RT で 2 分間 20,817 x g でサンプルを遠心し、代謝物測定 (極性、半極性化合物) の極の相を収集します。蛋白ペレットを脅かさないよう、管の下部に液相の約 50 μ L をまま。
6. 代謝物測定のための乾燥の収集されたサンプルは、遠心エバポレーターで一晩します。蒸発器から 30-60 分後にサンプルを削除することによって蛋白質ペレットを過乾燥は避けてください。
   注: 保存-20 ° C または –80 ° C でのサンプルまたはタンパク質のクロマトグラフィー-タンデム質量分析のための準備に進んですぐに。

5. プロテオーム解析のためのサンプルの準備

注: この手順はオルセンらから適応2004¹⁹とトリプシン/Lys-C ミックスの技術マニュアル (材料の表を参照してください)。

1. サンプルの酵素消化を実行します。
   注意: 酵素消化中に溶剤を使用し、サンプルの脱塩が有害であります。ヒューム フードの下で動作し、適切な個人用保護具、手袋などを着用します。
   1. 作りたての変性バッファー (40 mM 重炭酸アンモニウム 2 M チオ尿素/6 M 尿素、pH 8 を含む) の 30 μ L で蛋白ペレットを溶解します。優れたタンパク質溶解度を達成するために 15 分間超音波処理のステップを実行します。ペレットが溶解するまで手順を繰り返します。
   2. 20,817 x g 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心し、上清を新しい微量遠心チューブに転送します。
   3. ブラッドフォード蛋白質の試金を使用して蛋白質の濃度を決定します。
   4. さらなる分析、分注蛋白質の 100 μ g に相当する数量と変性バッファーで 46 μ L までサンプルを埋めます。
   5. 作りたての低減バッファー (50 mM DTT は H₂O に溶解) のサンプル 2 μ L を追加し、室温で 30 分間インキュベートします。
   6. 作りたてのアルキル化バッファー (150 mM ヨードアセトアミド 40 mM 重炭酸アンモニウム バッファーに溶解) の 2 μ L のサンプルを扱うし、室温で 20 分間暗闇の中で混合物を孵化させなさい。
   7. 40 mM 重炭酸アンモニウム緩衝の 30 μ L のサンプルを希釈し、LysC/トリプシン ミックスの 20 μ L を追加します。
   8. 37 ° C で 4 時間培養後 40 mM 重炭酸アンモニウム緩衝の 300 μ L のサンプルを希釈します。
   9. 37 ° C で一晩インキュベートを続行します。
   10. 10% トリフルオロ酢酸 (TFA) pH < 2 を取得するための約 20 μ L のサンプルを酸性化します。PH のストリップを使用して pH を確認してください。
       メモ:-20 ° C でサンプルを保存、次の手順に進みます。
2. 消化された蛋白質の塩分を除きます。
   注: は、好ましくは、真空マニホールド システムを使用します。列の過剰乾燥は避けてください。
   1. C18 SPE カラムを洗浄 (材料の表を参照) 1 ml 100% のメタノールとし、1 ml の 0.1% を含む 80% アセトニ トリル (ACN) の TFA は、水で希釈しました。こことさらにタンパク質脱塩使用の手順は、プロセスをスピードアップするため真空マニホールド システム。列の過剰乾燥は避けてください。
   2. コラムを平衡させ、水で希釈した TFA 0.1 %1 mL で 2 回洗浄することにより。
   3. 列にサンプルをロードします。0.1 %tfa の転送ソリューション列に 200 μ L 追加でリンス チューブ。列をソリューションを実行します。
   4. 1 mL 0.1% で 2 回コラムを洗浄 TFA。
3. 60% の 800 μ L を持つ列から脱塩ペプチドの溶出 ACN、TFA 溶液に対する 0.1%。遠心蒸化器、蒸発器から 30-60 分後にサンプルを削除することで蛋白分画の過乾燥を避けのフラクションを乾燥させます。
   注: 保存-20 ° C または –80 ° C でのサンプルやすぐに次のステップに進みます。以降の手順で氷のサンプルを保ちます。

6. 測定は高精度-MS/MS を使用して蛋白質のサンプルを準備しました。

注: プロテオーム、メタボローム測定前にフィルター (0.2 μ m 孔サイズ) とドガの 1 h の真空ポンプを使用してバッファーをすべて。

1. バッファー C (3 %v/v ACN、0.1% (v/v) ぎ酸) を使用しての 50 μ L で 2 mL 遠心チューブに格納されている乾燥再懸濁しますペプチド ペレット 200 μ L の容量を持つ手動液体ハンドリング ピペット。35 kHz 超音波周波数超音波照射超音波のお風呂に 15 分のサンプル
   注意: ACN およびギ酸は、有害な物質です。ヒューム フードの下で動作し、適切な個人用保護具、手袋などを着用します。
2. 20,817 x g 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心分離し、上澄みの 20 μ L をガラス瓶に転送します。
3. C18 逆相カラムを使用して別の消化ペプチド液体クロマトグラフィーと質量分析計を用いた質量スペクトルを取得します。
   1. 3 μ L 300-nl/min の流量を使用してサンプルの列に区切ります。移動相 C および D (63 %v/v ACN, 0.1% (v/v) ぎ酸) バッファーを使用 3% からランプ グラデーションを形成 15% に ACN ACN 20 分以上と 30% にし、次の 10 分以上 ACN。
      注: は、-20 ° C または –80 ° C までの数ヶ月でサンプルの残りの部分を格納します。プロテオーム測定前に氷のサンプルを再冷凍します。
   2. 10 分の 60% を使用して汚染物質を洗い流す ACN 次サンプルの測定の前にバッファー C の 5 μ L でコラムを平衡させ。
   3. 70,000 で解像度のセット、3 e⁶イオンの AGC ターゲット、最大射出時間 100 ms データ依存型 MS/MS 法および 300 から 1600 に至るまで m/z を使用して質量スペクトルを得る。17,500 の解像度、1e⁵AGC ターゲット、最大射出時間 100 ms 1.6 m/z と m/z 200 から 2000年に至るまでの分離ウィンドウと 20% のアンダーフィル比で 15 MS/MS スキャンの最大値を取得します。Apex トリガー (6-20 秒)、15 s と 1、> 5 の除外に料金設定の動的除外を有効にします。

7. プロテオーム データの処理

1. Http://www.uniprot.org/ から最新のシロイヌナズナを用いたプロテオーム データベースをダウンロードし、汚染物質データベースが含まれます。液体クロマトグラフィー-質量から得られたデータの分析を使用して有効にすると既定の設定を使用して統合されたアンドロメダ ペプチド検索エンジン MaxQuant LFQ 正規化^20,21,22を実行します。表 S1で使用されるパラメーターについて詳細な情報を見つけます。
2. 「タンパク質 groups.txt"出力ファイルをを開きます。さらに分析のために少なくとも 2 つのユニークなペプチドで識別された蛋白質グループのフィルターします。潜在的な汚染物質やシロイヌナズナタンパク質 (Fasta ヘッダー列で ARATH) データベース内に存在するためフィルターが MaxQuant によって定義される蛋白質のグループを削除します。
3. タンパク質濃縮サンプル間の重要性をテストするため正規化 LFQ 強度を使用し、複数比較補正 (例えばBenjamini

8. 高精度-MS を使用して極性の相を含むサンプルの測定。

1. 再懸濁します水のステップ 4.5 で 200 μ L から極性の相を乾燥し、超音波照射 5 分サンプル。
2. 20,817 x g 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心し、上清をガラス瓶に転送します。
   注: は、-20 ° C または –80 ° C で数ヶ月まででサンプルの残りの部分を格納します。メタボローム測定前に氷のサンプルを再冷凍します。
3. 高精度 C18 逆相カラムに結合を使用して分離手順を実行し、MS で質量スペクトルを取得します。
   1. イオン化モード (正と負) ごとの注入量サンプルの列 2 μ L に読み込み、400 μ L/分の流量を使用して画分を分離します。代謝産物の測定に必要なグラデーションを作成する次のように移動相溶液を調製: (0.1% ギ酸 H₂O) をバッファーし、バッファー B (ACN の 0.1% ギ酸)。
   2. 400 μ L/分以下の勾配で別の代謝: バッファー、バッファーのバッファー、バッファー バッファー A、30% から 15 分線形グラデーションの 30% に A の 60% から 13 分線形グラデーションの 60% に A の 99% から 11 分線形グラデーションの 1 分 99% バッファー 1% にバッファー A の 16 分の濃度が 99 %3 分の列 A. 再平衡バッファーの 99% にバッファー A の 1% からの線形グラデーションを使用する 17 分から始まって次の試料の測定前に A をバッファリングするまで 1% 濃度を保持します。
   3. 質量範囲をカバーするマススペクトルを取得 100 と 1500 の間 25,000 m/z の解像度設定し、読み込み 1e⁶100 さん AGC の設定対象に制限時間、キャピラリー電圧 3 kv シースとガス流れと補助ガス値 60 と 20、それぞれ。キャピラリー温度を 250 ° C およびスキマー電圧 25 v に設定します。

9. メタボロミクス データの処理

1. プロセスは、両方のイオン化モードから得られるクロマト グラムを収集しました。質量電荷比 (m/z)、保持時間 (RT) と商業ソフトウェアなどの関連するピークの強度を抽出するソフトウェアを使用して (材料の表を参照してください) または代替²⁴。
   1. .Exe ファイルをダブルクリックして処理ソフトウェアを起動します。
   2. 新しいワークフローを作成、活動「ファイルから読み込み」を検索し、、このアクティビティ「ドラッグ アンド ドロップ」空白のワークフロー領域に移動します。アクティビティに [マウスの右ボタンを押し、アクティビティの設定を開きます。
      1. 「一般」設定を含むタブで「名」フィールドの実験の名を設定次に「選択ファイルとフォルダー」をクリックしてと生クロマト グラムをマーク。
      2. 「詳細設定」設定を含むタブで「プロファイル データ カットオフ」0 強度に設定します。「適用」と"OK"をクリックします。
   3. 検索し、「データが掃引」アクティビティを追加します。アクティビティに [マウスの右ボタンを押し、アクティビティの設定を開きます。
      1. 「一般」設定を含むタブ、「重心データ」と「MS/MS データ」をマークします。選択パネルで「すべて」を選択することによってすべての MS/MS データを削除します。
   4. 検索し、「クロマト グラム化学ノイズ減算」アクティビティを追加します。アクティビティに [マウスの右ボタンを押し、アクティビティの設定を開きます。
      1. 「一般」設定を含むタブで"クロマト グラムのスムージング"をマークしスキャンを"3"と「移動平均」に「見積もり」数を設定します。51 スキャン、50% 減算「法」と 750 強度「しきい値」に「位」に「RT ウィンドウ」を設定します。
      2. 「詳細設定」設定を含むタブ、「RT 構造の除去」をマークし、5 スキャン RT の「長さ」を設定します。
      3. 「高度な」の設定を含むタブでマーク"m/z 構造の除去"と"最小 m/z の長さ"を 3 ポイントに設定します。
   5. 検索して、アクティビティ「クロマト グラム RT 整列」を追加します。アクティビティに [マウスの右ボタンを押し、アクティビティの設定を開きます。
      1. 「一般」設定を含むタブで 0.5 分「ペアワイズ線形ベース ツリー」に「配置方式」と「RT 検索間隔」を設定します。
      2. 「詳細設定」設定を含むタブで、既定のパラメーターを使用します。
   6. 検索して、アクティビティのグループを「クロマト グラム」の活動「ピーク検出」を追加。アクティビティに [マウスの右ボタンを押し、アクティビティの設定を開きます。
      1. 「一般」設定を含むタブで 0.09 分、0.03 分、5 ポイント」最大のマージの距離"と"マージ戦略"「センター」"最小ピーク サイズ""総和ウィンドウ"を設定します。「ピーク RT 分裂」のボックスは「ギャップ/ピーク比」を 50% に設定します。
      2. 「詳細設定」設定を含むタブで「窓のスムージング」を 5 点、80% に「洗練されたしきい値」と「一貫性のしきい値」1 に設定します。70% で設定された「強度しきい値」と「強度加重」として「計算センター」を設定します。
   7. 検索して、アクティビティの「クロマト グラム」グループの「同位体クラスター」アクティビティを追加。アクティビティに [マウスの右ボタンを押し、アクティビティの設定を開きます。
      1. 「一般」設定を含むタブで 5 ppm に 0.015 分して「m/z 許容値」「RT 許容」を設定します。
      2. タブで「封筒入」の設定を含む"形状制限なし」と「イオン化」としての「法」と設定"プロトン (肯定的なモード) の「脱プロトン化」(否定的なモード) のため。「最小および最大充電」の 1 と 4 をそれぞれ設定します。
      3. 「詳細設定」設定を含むタブで、既定のパラメーターを使用します。
   8. 検索して、アクティビティ「シングルトン フィルター」を追加。
   9. データ処理の結果をエクスポートするには、を検索し、「エクスポート」一連のアクティビティでアクティビティ「アナリスト」を追加します。
      1. 「一般」設定を含むタブで、「クラスター」と「観測」「合計強度」として「型」を設定。「カスタム ターゲット」を選択し、エクスポート ファイルのディレクトリを指定します。
      2. 「詳細設定」設定を含むタブで、既定のパラメーターを使用します。
2. 質量を用いて社内参照化合物データベースの注釈を付けます。
   1. 1 つまたは複数の MS グレード参照化合物高精度さんを使用する同じ LC MS 参照化合物と共同興味の蛋白質を精製した代謝産物の分析法を分析します。
      注: この研究では、ほぼ 300 のジペプチドのセットは分析し、参照化合物ライブラリとして使用します。
   2. 分析を使用してに関連付けられている特定の m/z と RT のクロマト グラムの raw ファイルと検索を開く (を材料表参照) ソフトウェア測定参照化合物 (『 ユーザーズ ガイド 』 を参照してください)。
      メモ: 二次代謝産物は、イオンの種類で異なります。[M-H] イオン M + 22.989218 m 18.033823、M + 1.007276 M-1.007276 と等しい質量の捜すことによって付加体の共通の存在を確認 [M + H] [M + NH₄] と [M+na]、それぞれ。
   3. クロマト グラムと特定のイオンのための検索の処理後に得られる「アナリスト」ファイルをエクスポートして開く使用スプレッドシート質量。RT の実験と RT 参照化合物の単位質量の機能を比較します。M/z の 0.005 Da と右 0.1 分の偏差を許可します。
3. 代謝物濃縮サンプル (興味対 EV コントロールの発現タンパク質の行) の間の特定のタンパク質を精製した共同性をテストするため複数続く 2 非対スチューデントの t 検定を使用してピーク値を比較します。比較補正 (例えばBenjamini & ホフベルク虚偽の発見率補正ボンフェローニ補正)。

Results

元の研究では、3 つのシロイヌナズナNDPK 遺伝子が構成 35S プロモーター¹⁴ (図 1) の制御の下で PSB L 細胞懸濁培養における過剰発現。タンデム親和性のタグは餌の蛋白質のカルボキシまたはアミノ ターミナル端に融解する.アフィニ ティー精製錯体は、MTBE/メタノール/水抽出¹⁶に服従しました。アフィニティ引っ張ったタンパク質と低分子化合物は、MS (テーブル S2 と S3) を使用して識別されました。

偽陽性を修正するには、空白のサンプルは研究室の消耗品と化学物質から低分子汚染物質を除外する使用されました。さらに、代謝産物やタンパク質親和性タグのいずれかにバインドするだけで樹脂はいた EV 制御線を使用して、占めています。真陽性、2 非対スチューデントの t 検定と Benjamini & ホフベルク虚偽の発見率を取得するには、補正を代謝産物 (表 S4) とタンパク質 (テーブル S5) 大幅 NDPKs AP の濃縮を識別するために適用しました。EV の制御線と比較して実験 (NDPKs と N- と C 末端タグ付き) (FDR < 0.1)。前の仕事で、タンパク質と低分子のインターアクターの線引きに不在/プレゼンス基準を使用我々 に注意してください。

代表的な結果は、ジペプチド、我々 のグループで研究小分子レギュレータの新規クラスの代謝産物データ フォーカスしながら NDPK1、ために与えられます。プロテオーム解析では、NDPK1 の 26 と推定される蛋白質パートナーを明らかにしました。さらにフィルター NDPK1 として同じ細胞レベル下コンパートメントの共局在蛋白質 (細胞質)、13 と推定されるタンパク質インターアクターにリストを絞り込みます。識別された蛋白質の間でされたグルタチオンS-トランスフェラーゼ、2 つ伸長因子、チューブリン、aconitate ニトリルヒドラターゼ。4 つのジペプチド ヴァル ・ ルー、イル Glu ルー-イル、イルを NDPK1 とペー具体的共同溶出するメタボローム解析が明らかに (図 2)。すべての 4 つのジペプチドの N 末端、共有結合特異性を示唆している疎水性残基を共有することに注意してください。

我々 既知のタンパク質とタンパク質代謝物の複合体のために、照会された 13 は蛋白質、ステッチ データベース²⁵ (図 3) に対して 4 つのジペプチドを検出しました。いくつかの観測を作ることができる: (i) NDPK1 以前報告されたインターアクターのどれも。(ii) APX1 オーソログがアルデヒド脱水素酵素家族メンバー ALDH7B4、翻訳開始因子 FBR12 遺伝子 AT2G40290 別の翻訳開始因子としながらやり取りする報告されました。(iii) 特定のジペプチドはない蛋白質パートナーを報告しています。共同溶出ジペプチドが取得した植物蛋白質を関連付けられている以前に報告されたないです。しかし、彼らは他の生物に重要な役割を果たして: ルー-イル、例えば、ひと細胞ライン²⁶神経栄養因子活性化の効果があります。実験では、システムの正確なトポロジを識別できないことに注意してください。たとえば、ジペプチドは NDPK1 と直接対話することがありますが、よく共同浄化された蛋白質のいずれかに関連している可能性があります。

一緒に取られて、私達の結果表示設立の手順、質量分析法と AP を用いたタンパク質間およびタンパク質-低分子インターアクターの同定を容易にし、についての広汎な情報の作成を支援します標的タンパク質のインタラクトーム。

図 1。AP MS ワークフローの方式です。(A)植物細胞培養からネイティブ可溶性画分の調製。(B)次の手順の AP。列にサンプルをロードした後 (ポイ) タップ タグ融合タンパク質は、アガロース ビーズに固定化した抗体にバインドします。列の洗浄は、非連結のタンパク質と代謝産物の除去を促進します。AcTEV 胸の谷間を実行した後ポイ タンパク質代謝物の複合体に溶出されます。(C)分離複合体の半定量的な分析に続いてタンパク質と代謝産物の割合。この図の一部は、Luzarowski et al. 2017¹⁴から再現します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2。具体的には共同 NDPK1 と溶出性ジペプチド。ヴァル ・ ルー (A)、イル Glu (B)、ルー-イル(C)、およびイル Phe (D) AP の実験で測定した 4 つのジペプチドの平均強度をプロットしました。すべての 4 つのジペプチド EV コントロールと比較して NDPK1 サンプルの重要な濃縮を表示する (アスタリスクは FDR を表す < 0.1)。誤差範囲を表す六つの測定の標準誤差 (N-3 複製と C 末端の 3 タグ付きタンパク質)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。前のみを考慮したステッチ データベースに対してクエリを実行共同 NDPK1 と溶出性すべての分子の相互作用ネットワーク実験およびデータベース証拠 (自信 > 0.2).高い信頼は相互作用の高い可能性を示し、堆積のデータに基づいて計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

テーブル S1。MaxQuant は出力テーブル"parameters.txt"です。テーブルには識別と定量化、として使用するデータベースについての情報のためのしきい値が含まれています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

テーブル S2。MaxQuant からの情報出力テーブル"proteinGroups.txt"。テーブルには、すべての識別された蛋白質のグループの強度とユニークなペプチドとスコアの数などの追加情報の一覧が含まれています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

テーブル S3。代謝物の分析を含む出力ファイル。テーブルには特定 m/z、RT および強度によって特徴付けられるすべての識別された質量の機能の一覧が含まれます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

表 S4。ジペプチドは餌として使用された NDPK1、NDPK2 または NDPK3 AP サンプルで発見しました。ジペプチド空白のサンプルで現在がリストから除外されました。各 NDPK の 2 つの独立した行 (タグ付きの N 末端または C 領域のいずれかで) は、3 通で実行されました。学生のt-テスト、 pの補正をさらに-Benjamini を使用しての値 & ホフベルク メソッドを用いて NDPKs の大幅充実した入力/終端] パートナーを決定 (FDR < 0.1)。与えられた ΔRT は参照化合物の質量は、Metlin²⁷モノアイソに関連して Δppm に関連して計算します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

テーブル S5。共同 NDPK1 で精製したタンパク質。各 NDPK の 2 つの独立した行 (N 末端または C 領域のいずれかのタグ付き) の 3 通で実行されました。学生のt-テスト、 pの補正をさらに-Benjamini を使用しての値 & ホフベルク メソッドを用いて NDPKs の大幅充実した入力/終端] パートナーを決定 (FDR < 0.1)。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

Discussion

提案するプロトコルは、ターゲット蛋白質の PP と午後の複合体の並列識別を許します。最終結果へのクローン作成から実験は 8 〜 12 週間ほどで完了ことができます。完全な AP は、我々 のプロトコルを半ばスループット解析に適したレンダリング 12 に 24 サンプルのセットの約 4-6 時間かかります。

にもかかわらず全体的に簡単です、プロトコルには、いくつかの重要な手順があります。(入力蛋白質のアフィニティ ビーズ i) 十分な量は、代謝物の検出のダイナミック レンジに到達する重要です。したがって、効率的なセル換散ですプロシージャの重要なステップです。悪い蛋白質収量は、材料または次善の換散バッファー/材料比率の不十分な粉砕の結果をすることができます。(使用試薬が MS 向けであること、ii) 注意をすべき。彼らは MS 検出に干渉としては、強い洗剤、グリセリン、または塩の過剰を避けるべき。(iii) アガロース ビーズ過剰乾燥の手順を洗う時にする必要がありますいないと真空マニホールドを使用する場合は、ビーズを破壊する複雑な安定性に影響しないように低速流率を適用することが重要です。

提案するプロトコルをいくつかの重要な可能な修正がある: (i) 構成の CaMV35S プロモーターを使用して、餌の蛋白質の量を最大化します。過剰発現、非常に便利ですが、細胞の恒常性²⁸に深刻な影響を与えることができるし、生理学的関連性の低い相互作用の形成に 。ネイティブのプロモーター、機能喪失バック グラウンドで可能な限りが真の生物学的インターアクターを取得するための優れたと見なされますを使用して付けられた蛋白質の表現。植物細胞培養で通常は表される蛋白質のため工場の背景が関連するインターアクターを識別するために必要な証明するかもしれない。(ii) 膜タンパク質を使用する場合、換散バッファーは MS 互換洗剤を補充する必要があります。(iii) 2 番目の親和性の浄化のステップの導入は真陽性率に偽陽性を改善できるし、EV コントロール²⁹のための必要性を排除します。2 つの独立したプロテアーゼ切断サイト新規タンデム タグは、面倒で時間のかかる作業である前田ら2014¹¹追加サイズ排除クロマトグラフィー ステップに魅力的な代替手段を提示します。

AP の最も重大な欠点は、偽陽性の率が高いです。理由はたくさんあります。構成の過剰発現は、すでに言及されました。生理学的関連性の低い相互作用の別のソース分離細胞小器官を扱うを除き蛋白質および別の細胞内コンパートメントからの代謝物質の混合物を含む全体セル lysates の準備です。内局は、true インターアクターのフィルターに使用する必要があります。それにもかかわらず、不明確な結合蛋白質とアガロース樹脂の間起因する偽陽性の大半。はじめに 2 番目の精製ステップの前述のように、問題に最適なソリューションを提供しています、しかし時間とスループットを犠牲にして来る。さらに、プロトコルが長くなるにつれて弱い相互作用が失われることがあります。AP のもう一つの注意点は、包括的な情報を提供しています、インタラクトームについてターゲット蛋白質のにもかかわらず餌タンパク質の直接的および間接的なターゲット間の区別は不可能であります。ターゲットを絞った分子アプローチが相互作用を確認するため必要です。

MS ベース メタボロミクスと相まって AP を用いて酵母¹².の蛋白質複合体の研究私たち以前観察¹³同様に脂質を極性、半極性化合物に結合したまま細胞溶解液から分離されたタンパク質複合体とともに、この仕事は、提案するプロトコルの概念的な基礎を提供しました。私達のプロトコルは 3 つのユニークなポイントによって特徴付けられる: (i) 対照的に、酵母に働く¹²AP は疎水性がまた親水性のタンパク質だけでなく有機配位子を取得するのに適しているを示します。(ii) 3 つの抽出のプロトコルを用いて、単一の AP を使用して餌タンパク質のタンパク質と代謝産物のインターアクターを勉強できます。(iii) は植物細胞にプロトコールを適用しました。

今後の取り組みは、2 つの独立したプロテアーゼ切断サイトで新規タンデム タグの作成について説明します。我々 はまた植物ホルモンなど低豊富小さい分子にプロトコルの適合性を探索したいと思います。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ムラシゲとスクーグ 有機物が最小限の基礎塩	Sigma-Aldrich	M6899
1-ナフチル酢酸	Sigma-Aldrich	N1641
キネチン溶液	Sigma-Aldrich	K3253
トリスベース	Sigma-Aldrich	10708976001
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
MgCl2	カール・ロス	2189.1
EDTA	シグマ・アルドリッチ	3609
NaF	シグマ・アルドリッチ	S6776
DTT	シグマ・アルドリッチ	D0632
PMSF	シグマ・アルドリッチ	P7626
E-64 プロテアーゼ阻害剤	シグマ・アルドリッチ	E3132
プロテアーゼ阻害剤 カクテル	シグマ・アルドリッチ	P9599
Na3VO4	Sigma-Aldrich	S6508
AcTEV Protease	Thermo Fischer Scientific	12575015
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.2
TEMED	Carl Roth	2367.3
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fischer Scientific	26616
SBP Tag 抗体 (SB19-C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-101595
ヤギ抗マウス IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Bradford 試薬	Sigma-Aldrich	B6916
トリプシン/Lys-C ミックス、質量分析グレード	プロメガ	V5071
素	Σ-Aldrich	U5128
オ尿素	Σ-Aldrich	T8656
重炭酸アンモニウム	Σ-Aldrich	9830
ドアセトアミドΣ-Aldrich		I1149
MTBE	138906		Biosolve
	Biosolve	136806
Water	Biosolve	232106
Acetonitrile	Biosolve	12006
トリフルオロ酢酸	202341		Biosolve
	Biosolve	69141
Unimax 2010 プラットフォーム シェーカー	ハイドル	5421002000
ナイロン メッシュ (線径 34 & マイクロ;M、厚さ55 & マイクロ;M、オープンエリア14%)	Prosepa	カスタムオーダー
ガラス漏斗、47 mm、300 ml	Restek	KT953751-0000
ボトルトップ500 mL 0,2 & マイクロ;M Pes St	VWR International GmbH	514-0340
ミキサーミル MM 400	Retsch GmbH	207450001
IgG セファロース 6 ファストフロー	GE ヘルスケア ライフサイエンス	17-0969-02
Mobicol "Classic"" フィルターなしの2つの異なるスクリューキャップ	MoBiTec GmbH	M1002
フィルター(小)35&マイクロ;M孔径、Mobicol M 1002、M1003、M1050 &M1053	MoBiTec GmbH	M513515
可変速チューブローテーター SB 3	カール・ロス	Y550.1
ローテーター用ロータリーディッシュ SB 3	カール・ロス	Y555.1
レスプレップ 24ポートSPEマニホールド	Restek	26080
Finisterre C18/17% SPE カラム 100mg / 1ml	テクノクロマ	TR-F034000
オートサンプラー バイアルクラ	ウス・トロットクロマトグラフィー-Zubehör	40 11 01 740
Acclaim PepMap 100 C18 LC カラム	Thermo Fischer Scientific	164534
EASY-nLC 1000 液体クロマトグラフ	Thermo Fischer Scientific	LC120
Q Exactive Plus ハイブリッド四重極-Orbitrap 質量分析計	Thermo Fischer Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Acquity UPLC システム	ウォーターズ	カスタムオーダー
ACQUITY UPLC HSS C18 カラム、100A、1.8 µM、2.1 mM X 100 mM、1/pkg	ウォーターズ
水溶液用ハイパワー超音波洗浄槽	バンデリン	RK 31
Genedata Expressionist	Genedata	NaN
Xcalibur Software	Thermo Fischer Scientific	NaN
MaxQuant	NaN	NaN