ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization を視覚化する方法を示します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
規制の蛋白質蛋白質の相互作用は多くのシグナル伝達イベントの基本理念と、このようなイベントの検出はそのような経路の編成方法と動作を理解する上で重要な要素。細胞のタンパク質-タンパク質相互作用を検出する多くの方法がありますが、比較的少数は内因性のタンパク質間相互作用を検出する使用できます。そのようなメソッドは、近接結紮アッセイ (PLA) には、その使用をお勧めするいくつか利点があります。タンパク質-タンパク質相互作用解析の他の一般的な方法と比較して、PLA は、比較的高い感度と特異性、最小限の細胞操作と、本明細書に記載されているプロトコルに実行できます、ターゲット固有の唯一の 2 つが必要です。種に由来する抗体 (e.g, マウスおよびウサギから) と 1 つの特殊な試薬: 共有リンク特定のオリゴヌクレオチドは、二次抗体のセット、互いの近くになったときに作成、。in situ PCR やローリング サークル増幅の増幅プラットフォーム。このプレゼンテーションでは、固定細胞における MST1 と MST2 近接の変化を視覚化する PLA 手法を適用する方法を示します。本稿で説明する手法は、細胞のシグナル伝達研究の分析に特に当てはまります。
概要
MST1/カバ シグナリングパスの中断は、発達障害や発癌1に接続されています。哺乳類で MST2 と MST1 キナーゼをアクティブ化 (リン酸化) MOB1 と LATS1/2、後者の場合、廃止し、転写コアクチベーターはい関連タンパク質 (ヤップ)2を不活性化します。アクティブ (ペプタイド) 形式でヤップは発癌性活動は、細胞増殖の遺伝子のトランスクリプションを高める逆に、ヤップはカバ経路による不活化、細胞増殖の抑制し、アポトーシス促進3。体内では、MST1 と MST2 アクティブな homodimers として主に存在しますが、発癌刺激 MST1/MST2 ヘテロのレベルを増やすことができます、このようなヘテロ非アクティブ4。ただし、MST1/MST2 heterodimerization の規制方法の不十分な理解ままです。両方ホモ ・ ヘテロが仲介経由MST1 の C ターミナル コイルド コイル領域と相互 MST2 サラ ドメイン5として知られています。を使用して、その場でPLA は人間シュワン細胞 (HSC) と人間の萌芽期の腎臓の細胞 (HEK 293) に MST1/MST2 ヘテロの存在を示すこの資料で説明します。PLA は、他のタンパク質・....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. 溶液の調製
- 固定液の準備: 1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)。10 mL の 16% の 2.5 mL を取る PFA 7.5 mL の 1x PBS を追加。
の危険性:PFA は、低用量で発がん性があります。ガスや皮膚への接触は危険です。-20 ° C にてストア - 透過ソリューションを準備: 0.1 %1 × PBS でトリトン X-100。溶液 100 mL、100 mL の 1x PBS にトリトン X-100 の 100 μ L を追加します。常温 (RT) を格納します。
- 1 x TBST 洗浄バッファーを準備します。。1 L 用 10 x TBS 100 mL、dH2O, 890 mL と 10 mL の Tween 20 (10%) を取る。
- キットによって提供されたブロッキング液を準備します。また、1 x PBS 溶液 2 %bsa を使用します。
- キットによって提供された抗体希釈液を準備します。また、1 x PBS 溶液 1 %bsa を使用します。
2. 細胞のめっき
注:本研究で我々 は不死化ヒト シュワン細胞 (iHSC) と人間の萌芽期の腎臓 293 の細胞 (....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
HEK 293 の iHSC MST1 と MST2 の相互作用をテストするのに PLA の試金を使用しました。セルが固定、グリセリン、および PLA プロトコル (図 1) によるとその場で増幅後、種々 の抗体で染色します。MST1/MST2 heterodimerization のレベルを文書化するには、細胞は MST1 MST2 抗体 (図 1 a、1 C、1 G) で染色しました。肯定的な制御としてまた、ERK を使用し、特典の抗体と細胞に近接する予想されるアクティブ化 ERK (図 1 bおよび1 階)。MST1 と MST2 に欠けているセルは PLA 信号 (図 1) を示さない。細胞の 2 つの抗体の 1 つだけのステンド グラスは、同.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
(14-16) 培養細胞での実験を実行する非常に便利だし、サンプルの顕微鏡分析中にすべての時間を変更する必要はありません、この実験用チャンバー スライド ガラスを使用すると便利だとわかった。抗体との交差汚染のリスクの増大など、いくつかの合併症が発生します。したがって、各ウェルを洗浄することをお勧め、実験の期間の増加にもかかわらずの Coplin jar を使用する代わりに個別に。さらに、シリコン挿入の除去、繊細な仕事であり、注意と忍耐で行う必要があります。細心の技術とも挿入を除去した後少量のシリコンの残骸を見ることが可能ことがあります。このため、1 つ削除する必要があるシリコン挿入綿密、あまり外しシリコーンは顕微鏡の中に共焦点距離を変えることができるよう必要に応じて、黒人を使用しています。顕微鏡下で細胞を見つけるためにシリコン カバーの取り外し後井戸の境界線として線を描画することもできます。
非交差反応性一次抗体それぞれが、ヘテロダイマーの 1 つだけメンバーを認識することが不可欠です (例えば、 MST1 抗体必要がありますも認識 MST2 と逆
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
最適化と特定のマリア ラドゥとガリーナ Semenova で、このプロトコルの検証に貢献する検査室全体のチャーノフに感謝いたします。また、フォックスチェイスがんセンターの細胞イメージング施設のアンドレイ エフィーモフを感謝いたします。この作品は、JC に NIH (R01 CA148805) からの助成金によって支えられました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| チャンバースライド | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well、スライド |
| ガラス PLA プローブ Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | 1x ブロッキング溶液、1x 抗体希釈剤 |
| PLA プローブ Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | 1x ブロッキング溶液、1x 抗体希釈液 |
| バッファー、Flurescence | Sigma-Aldrich | を含むDUO82049 | Wash Buffer AおよびWash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | 細胞シグナル伝達 | 5726s | pERK抗体 |
| MST2抗体 | 細胞シグナル伝達 | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 |
| 抗体 16%パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡科学 | 15710 | PBS中のPFAに希釈して溶液を固定する |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | 透過化溶液 |
| 共焦点顕微鏡 | Leica TCS SP8, 63x | ImageJ ソフトウェアによる画像解析 |
参考文献
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
