ここでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の定量の正確さを許可するプロトコルを提案する.このプロトコルではミトコンドリア Dna の二次構造によって引き起こされるミトコンドリア Dna のメチル化レベルの過大評価を避けるために使用することができますバイオ情報解析パイプラインと相まって病原が付いている DNA の酵素消化をについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
DNA のメチル化の定量は、重亜硫酸塩の配列は、非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA のコンテキストでを変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用を使用して達成することができます。重亜硫酸塩の配列をすることができます (PCR を使用して) を対象とした全ゲノム上で実行やシトシンのメチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供します。特に二次構造の核およびミトコンドリア DNA の異なる性質を考えると、ミトコンドリア Dna のシトシンのメチル化を調査するための重亜硫酸塩の配列方法の adaptions が行われなければなりません。MtDNA の二次および第三構造は確かに不完全な変性の単一座礁させた DNA を重亜硫酸塩のアクセスの悪さのため偽陽性につながる成果物を配列する重亜硫酸塩につながることができます。ここでは、シトシンの正確な定量化にミトコンドリア Dna のメチル化レベルを許可する DNA の酵素消化による病原バイオ情報解析パイプラインと相まってプロトコルについて述べる。加えて、我々 は mtDNA に固有重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計のガイドラインを提供、望ましくない核ミトコンドリア セグメントをターゲットを避けるために (NUMTs) は、核ゲノムに挿入されました。
概要
ミトコンドリアのゲノムは約 16.5 キロ ベース (kb) の円形、二本鎖構造長い、重いと光の鎖を構成します。ミトコンドリアゲノムは母性継承、各セル内の複数のコピーに存在し、呼吸鎖複合体1の基本的なコンポーネントをエンコードします。同様に核ゲノムとは異なり、細菌のゲノムに、ミトコンドリアのゲノムは組織された多数の二次および第三構造などコイルとスーパーの構造2、アクセス困難なシーケンス処理中に表示することができます。実験3。
核内 DNA のメチル化、遺伝子発現の調節に特に多数のプロセスの役割を果たしている広範囲に研究エピジェネティックなマークです。哺乳類のゲノムの DNA のメチル化は deoxycytidines、主に CG ジヌクレオチド (CpG) のピリミジン環の 5 の位置に主に発生します。シトシンのメチル化は、DNA 塩基4体細胞と合計の ~ 1% のゲノムのすべての CpG の 70% で発見されます。DNA メチル化はまた公認会計士、CpT、クリック単価などの非 CpG のコンテキストに記載されているし、胚性幹細胞5,6,
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プロトコル
1 制限酵素処理
- 病原位置 14258 人間のミトコンドリア dna を切る制限の酵素と全人間 DNA を扱うことによってミトコンドリア Dna をリニア化します。
注: マウス DNA を以下のように同一の条件の下で制限酵素 BglII を使用します。 - それぞれのサンプルがミトコンドリア Dna メチル化は、評価に 1 つ 0.2 mL 反応管を準備、(蛍光分析による定量化) 次ミックス: 3 μ g ゲノム DNA を追加の 15 μ L バッファー 3、3 μ L 病原とを 150 μ L の水
- 37 ° C で 4 時間サーマルサイクラーにチューブを配置します。
2. 重亜硫酸塩の変換
- 病原治療 DNA 亜硫酸水素ナトリウム29を他の場所で説明されているように変換します。
- 各変換反応 20 μ L の容量で 200-500 ng 病原治療 DNA を使用します。DNA の回復は 50-70% であります。
- 10 μ L の溶出バッファーの重亜硫酸塩の変換された DNA を溶出します。
- 蛍光分析による単一座礁させた DNA を定量化します。
- 省略可能: プロトコルの残りを進む前に-20 ° C で DNA を重亜硫酸塩の変換を格納します。長期保存用....
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結果
ミトコンドリア Dna のメチル化を調査する場合に、このプロトコルの 2 つのステップが重要です。1) 二次構造と 2) ミトコンドリア DNA 特異プライマーの設計の開口部。
制限酵素病原 (図 1) ヒトのゲノム DNA を消化によってミトコンドリア DNA の構造は塩基位置 14,258 カットされ、二次構造が表示されます。
そのまま mtDNA 二次構造の重亜硫酸塩の変換の可能な障害は、mtDNA unconversion 率を過大評価する可能性が高いです。重亜硫酸塩の配列による mtDNA の unconversion レートを調べた、未消化し、ミトコンドリアのゲノムの 5 つの異なる地域でのヒトの骨格筋細胞から全 DNA を消化: 変位ループ (D-ループ)、t.......
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ディスカッション
ここでは、ミトコンドリア Dna のメチル化を尋問するとりわけ設計されている重亜硫酸塩シーケンス プロトコルを提供します。重亜硫酸塩の配列使用プロトコルの DNA との違いは NUMT シーケンスから偽陽性発生して事前の制限の酵素の消化手順とバイオ情報解析の活用にあります。
ミトコンドリア Dna メチル化を調査するとき、重亜硫酸塩の配列のアーティファクトを除去するためのプロトコルを提供しています。無病誤診につながる重亜硫酸塩の配列アイテムは、以前に報告された37でした。DNA, プロテイナーゼ K をされているアクセサリ蛋白質の不十分な除去は、37をについて説明します。不完全な変性または部分的な reannealing につながる不完全な変換の可能性がある37単一座礁させた DNA を重亜硫酸塩のアクセスを下げることによって。後アーティファクト mtDNA のプレイで二次構造がシトシンへのアクセスを損なうかもしれない。我々 の知る限り、ミ.......
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開示事項
著者は宣言する競合金融興味を持ってないです。
謝辞
ノボ ノルディスク基礎基本的な代謝研究センターは、ノボ ノルディスク財団から制限のない寄付によって部分的に資金を供給したコペンハーゲン大学で独立したセンターです。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BamHI | New England BioLabs | #R0136 | |
| EZ DNAメチル化-ライトニングキット | Zymo Research | #D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick ゲル抽出キット | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| 高感度DNAチップ | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit 高感度 dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq 試薬キット v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| 水酸化ナトリウム | Sigma | # S5881 | |
| サーマルサイクラー C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 リアルタイムPCR検出システム | Biorad | #1855195 | |
| Qubit 蛍光光度計 | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
参考文献
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A.
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再版と許可
