この作品は、特注ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから確実に記録光単一ユニットを実行するメソッドを紹介します。
方法論記事
この作品は、特注ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから確実に記録光単一ユニットを実行するメソッドを紹介します。
それはどのように異なる神経科学における主要な関心事は種類のニューロンは、神経回路の動作します。光遺伝学の最近の進歩は、広範な脳領域における生体内の電気生理学的実験で神経のタイプの id を有効にしています。光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。しかし、脳の表面から深い脳の領域に刺激ライトを提供するは難しいですよく。特に、目がさめている動物からの録音の場合は、しばしば、脳表面の光透過性が低く、脳深部の領域に到達する光線への刺激は困難です。ここでは、オーダーメイド ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから光にスパイク応答を記録する方法をについて説明します。この方法で光は確実に脳深部領域における光と記録されたニューロンを刺激できるように記録ガラス電極を介して配信されます。このカスタムメイドの optrode システムはアクセス可能で、安価な材料で構成されています、組み立てやすい。
中枢神経系のニューロンは、異なる機能を持つさまざまな種類で構成されます。神経回路内のニューロンのこれらの異なったタイプの仕組みは、神経科学における主要な関心事の一つです。しかし、脳の多くの地域で解除されたいくつかの例外を除いて電気スパイク信号自体に明確な違いはありませんので、電気活動の生体内での録音で神経の種類を区別すること。光遺伝学の最近の進歩は画期的な1,2にしました。神経細胞の特定の種類の光に敏感なオプシン (例えばチャネルロドプシン 2) を表現するトランスジェニック動物を使用して、効率的に体内録音3,の神経の種類を区別するために可能になった4,5,6。これらの動物で光に敏感なオプシンとニューロンの電気録音中に軽い刺激を与えることによって興奮しているが、他のニューロンはないです。オプシン陽性ニューロン、したがって、簡単に区別される他のニューロン タイプ光への応答。
光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。非侵襲的な方法として光はしばしば脳の表面から送られます。しかし、それは脳組織を通過、ライトの強度が低下するため、脳の表面から深い脳の領域を刺激するは難しいです。特に、目がさめている動物からの録音の場合は、しばしば、脳表面の光透過性が低く、脳深部の領域に到達する光線への刺激は困難です。電気生理学的実験はしばしば麻酔下の動物の体の動きの録音にノイズが発生するため行われています。よく説明されています、しかし、麻酔は神経応答7,8,9,10を変更する知られています。したがって、麻酔の人工効果なし神経反応を研究するために目がさめている動物を使用する必要があります。麻酔下の動物実験とは異なり、電気生理学的記録は目を覚まし動物による実験で手術からの回復後実行されます。手術と録音の間隔中に組織の滲出液はしばしば脳表面に溜まるし、低脳表面の光透過性になります。
ここでは、オーダーメイド ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから単体録音を記録する手法について述べる。この方法で光は確実に脳深部領域における光と記録されたニューロンを刺激できるように記録ガラス電極を介して配信されます。このカスタムメイドの optrode システムはアクセス可能で、安価な材料で構成されています、組み立てやすい。
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すべてのプロシージャは、日本生理学会の動物ケア委員会の金沢医科大学の承認の原則に従って行われます。
1. ガラスの Optrode ホルダーの建設
注: ガラス optrode ホルダーを構築する商業電極ホルダーは使用 (図 1 a)。
2. 頭ポスト インストール
3. 馴化
4. 開
注: 順化後に開頭術は録音のための脳の領域で行われます。頭でポスト インストールとして、麻酔下で脳定位固定装置のフレームで、開頭術を行います。頭ポスト インストール後の操作手順は同じです。
5. 電気生理学的記録
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図 2先端径の影響とガラス ピペット ピペット (図 2 a・B) の先端に光パワーでの長さを調べた。光のパワーは、先端から 1 mm を配置光パワーメータで測定しました。先端サイズを変えた、フルの長さを変化させた場合、先端サイズは 2.5 μ m に設定されている場合、全長は 50 ± 2 mm に設定されました。ガラス ピペットのシャンクは、8 mm に設定されました。3-5 mW (平均 ± SD; から先端の光図 2 a: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20;図 2 b: 4.24 ± 0.31 mW、 n = 21)。ピペットの先端サイズ (図 2 a) はほとんど光のパワーとの相関 (R...
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光遺伝学神経科学における強力なツールとなっています。それは、特定の神経活動を操作すると同様、特定のニューロン タイプ体内を識別するために利用されています。各種神経の神経活動の解明は、神経回路メカニズムの理解を促進します。ここでは、目を覚まし ChR2 vgat ノックアウト マウスの IC でガラス電極を介して記録サイトに光を配布する方法を示しました。
説明した方法のいくつかの重要な手順があります。まず、ターゲット細胞オプシンの十分な特定の表現で動物を使用するための要件です。細胞外記録と光に対する反応を識別するには、オプシンの活性化がターゲット ニューロンのスパイクを連想させることが必要です。いくつかのトランスジェニック マウスの実験のための最低年齢があるかもしれないと、ニューロンの遺伝子発現レベルが若い動物14で低いです。さらに、いくつかの追加実験光刺激に対する応答のターゲット ニューロンの種類 (例えば、免疫組織化学) に固有の確認を実行する必要があります。ターゲット ニューロンは興奮性、応答の...
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著者が明らかに何もありません。
著者は、昇進の科学科研費補助金 JP16K11200 ・ 17 H 02223、会と金沢医科大学 S2016 8 C2017 3 研究グラントによって支えられました。写真を撮るに彼のサポートを Yuhichi クダを感謝いたします。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 電極ホルダー | 分子デバイス | 微 | 小電極増幅器用ピペットホルダー |
| セラミックスプリット嵌合スリーブ | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mmフェルール |
| 回路基板スペーサー | テイシン電機 | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0mm 長 |
| マウス用脳定位固定装置フレーム | 成重 | SR-6M-HT | マウス |
| 用脳定位固定装置マニピュレーター | 成重 | NA | 手動マニピュレーター |
| スーパーボンド | サンメディカル | M:204610557 | 歯科用接着剤 樹脂セメント |
| Form2 Formlabs | NA | 3Dプリンター | |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | 低毒性シリコーン接着剤 |
| ホウケイ酸ガラス毛細血管 | 成重 | GD-1.5 | OD 1.5 mm、ID 0.9 mm、長さ90.0mm |
| 光ファイバーパッチコード | ドーリックレンズ | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | モノ光ファイバーパッチコード、外径、2.5 mm、コア = 960 mm、クラッド = 1000 mm、NA = 0.63 |
| 接続型 LED | ドーリックレンズ | LEDC-1B_FC | 中心波長 = 465 nm、出力電力 = 45 mW (コア 960 mm 0.63 NA ) |
| LED ドライバー | ドーリックレンズ | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED ドライバー、最大出力 = 1000 mA |
| 電極プーラー | 成重 | PB-7 | 二段式ガラスマイクロピペットプーラー |
| ホウケイ酸ガラス毛細管 | 成重 | GD-1.5 | ホウケイ酸ガラス毛細管 外径 1.5mm・内径 0.9mm・長さ90.0mm |
| ジェンタシン | MSD | 株式会社 185711173 | 抗生物質軟膏 |
| テラマイシン-LA | ゾエティス | G 333 | オキシテトラサイクリン |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2マウス |
| マルチクランプ700B | 分子デバイス | 2500-0157 | 微小電極増幅器 |
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