覚醒マウス ガラス Optrode を持つ神経型のオプトジェネティクス同定

サマリー

この作品は、特注ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから確実に記録光単一ユニットを実行するメソッドを紹介します。

要約

それはどのように異なる神経科学における主要な関心事は種類のニューロンは、神経回路の動作します。光遺伝学の最近の進歩は、広範な脳領域における生体内の電気生理学的実験で神経のタイプの id を有効にしています。光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。しかし、脳の表面から深い脳の領域に刺激ライトを提供するは難しいですよく。特に、目がさめている動物からの録音の場合は、しばしば、脳表面の光透過性が低く、脳深部の領域に到達する光線への刺激は困難です。ここでは、オーダーメイド ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから光にスパイク応答を記録する方法をについて説明します。この方法で光は確実に脳深部領域における光と記録されたニューロンを刺激できるように記録ガラス電極を介して配信されます。このカスタムメイドの optrode システムはアクセス可能で、安価な材料で構成されています、組み立てやすい。

概要

中枢神経系のニューロンは、異なる機能を持つさまざまな種類で構成されます。神経回路内のニューロンのこれらの異なったタイプの仕組みは、神経科学における主要な関心事の一つです。しかし、脳の多くの地域で解除されたいくつかの例外を除いて電気スパイク信号自体に明確な違いはありませんので、電気活動の生体内での録音で神経の種類を区別すること。光遺伝学の最近の進歩は画期的な^1,2にしました。神経細胞の特定の種類の光に敏感なオプシン (例えばチャネルロドプシン 2) を表現するトランスジェニック動物を使用して、効率的に体内録音^3,の神経の種類を区別するために可能になった^4,5,6。これらの動物で光に敏感なオプシンとニューロンの電気録音中に軽い刺激を与えることによって興奮しているが、他のニューロンはないです。オプシン陽性ニューロン、したがって、簡単に区別される他のニューロン タイプ光への応答。

光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。非侵襲的な方法として光はしばしば脳の表面から送られます。しかし、それは脳組織を通過、ライトの強度が低下するため、脳の表面から深い脳の領域を刺激するは難しいです。特に、目がさめている動物からの録音の場合は、しばしば、脳表面の光透過性が低く、脳深部の領域に到達する光線への刺激は困難です。電気生理学的実験はしばしば麻酔下の動物の体の動きの録音にノイズが発生するため行われています。よく説明されています、しかし、麻酔は神経応答^7,8,9,10を変更する知られています。したがって、麻酔の人工効果なし神経反応を研究するために目がさめている動物を使用する必要があります。麻酔下の動物実験とは異なり、電気生理学的記録は目を覚まし動物による実験で手術からの回復後実行されます。手術と録音の間隔中に組織の滲出液はしばしば脳表面に溜まるし、低脳表面の光透過性になります。

ここでは、オーダーメイド ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから単体録音を記録する手法について述べる。この方法で光は確実に脳深部領域における光と記録されたニューロンを刺激できるように記録ガラス電極を介して配信されます。このカスタムメイドの optrode システムはアクセス可能で、安価な材料で構成されています、組み立てやすい。

プロトコル

すべてのプロシージャは、日本生理学会の動物ケア委員会の金沢医科大学の承認の原則に従って行われます。

1. ガラスの Optrode ホルダーの建設

注: ガラス optrode ホルダーを構築する商業電極ホルダーは使用 (図 1 a)。

1. ホルダーのバレルから圧力制御用鋼管を優しく引き出します。
2. ドリル、ホルダーのバレルのピン シート側の穴を広げます。深さ 3 mm 直径 12 mm の穴を作る。
3. (直径 3 mm、厚さ 0.5 mm、長さ 8 mm のステンレス製パイプを入れてください。図 1A2) 穴の中。
4. セラミックの穴に合うスリーブ ⌀2.5 mm フェルール (図 1 a1) を分割を挿入します。
5. エポキシ接着剤で L 字の留めに電極ホルダーのバレルを固定します。
6. これをネジを有するマニピュレーターに添付して、留めの穴 (直径 3 mm) を作る。

2. 頭ポスト インストール

1. 回路基板スペーサー製特注ヘッド ポストを準備します。フライス カッター立方形に柱状の回路基板のスペーサーを作るし、2 頭の記事に (図 1 b) のこぎりで切ってください。フライス カッター ヘッドの記事の下部を平らにします。
2. 研究のための特定のニューロン タイプで光に敏感なオプシンを表現する遺伝子組換え動物を準備します。この作品は、抑制性ニューロンがチャネルロドプシン 2 (ChR2)¹¹を表現するトランスジェニック マウス (ChR2 vgat ノックアウト マウス) が使用されます。
3. 腹腔内投与によって 0.3 mg/kg のメデトミジン、ミダゾラム、4.0 mg/kg とブトルファノールの 5.0 mg/kg の混合物を持つ動物を麻酔します。動物に麻酔が完全にかかることを確認、摘心を末尾にその反応をテストします。
4. 脳定位固定装置フレーム加熱パッドの上にマウスを配置します。きれいな脳定位固定フレームと加熱パッド 70% アルコールで事前にします。一口バーの穴に歯を置き、軽く鼻クランプを締めます。耳バーを使用して頭の両側を修正します。頭は、耳バーで固定されて正しく、鼻クランプを締めます。眼軟膏を目に適用されます。
5. 小さなハサミで頭の皮膚を剃るし、グルコン酸クロルヘキシジンの綿棒を使って頭皮をきれい。手術前に手術器具と頭のオートクレーブ (121 ° C、15 分) にポストすべての殺菌をします。
6. 正中線に沿って頭皮をハサミで切って、脇に押し込みます。目 (約 20 mm) に頭の後ろから切開を行います。70% アルコールに浸した綿棒で骨膜を削除し、頭蓋骨を乾燥します。
7. マニピュレーターに頭ポストを取り付けます。マニピュレーターを使用して前の周りの頭蓋骨の上に平ら頭のポストを配置します。
8. モノマー (4 滴)、触媒 (1 滴)、事前に冷蔵庫で冷やして、小さな皿に歯科用セメントのポリマー (小サジ 1 杯) を混ぜます。前頭葉と頭蓋骨にヘッドの記事を修正する頭蓋骨の頭頂骨 (1 g) の下の歯科用セメントを置きます。
9. 歯科用セメントは、ハードになると、脳定位固定装置のフレームから、マウスを削除します。露出した皮膚に抗生物質軟膏を置きます。メデトミジン拮抗薬 (0.3 mg/kg) と抗生物質 (オキシテトラサイクリン; 20 の mg/kg) を挿入します。配置およびそれが目を覚ますまでケージの熱パッドの上でマウスを監視し、住宅ケージに戻る。
10. いくつかの濃縮デバイスの個々 の住宅檻の中の動物の家。動物紙毎日ケージをきれいに保ち、感染を防ぐために寝具を変更します。動物は、不快感の兆候を示して かどうかを注意深く監視します。のどの痛みが疑われる場合は、リドカイン、傷に適用されます。管理メロキシカムとカルプロフェン一度 48 h 両方頭ポスト インストールと開頭手術後のすべての 24 h。NSAID が適切でない場合、リドカインをさらに与えることができます。

3. 馴化

1. (最小) の 2 日後、麻酔からの回復は、録音室で頭固定状態に動物を順応させます。少なくとも 5 日間馴化セッションを実行します。
2. 順化セッション中に特注クランプに固定ヘッドのポスト記録室に動物を配置します。運動を制限するために、セッション中に 3 D プリンターを使用して製のカバー オーダーメイド ガレージの半分管 (図 1) が付いているボディ。
   注: 1 日に順化セッションは 5 分長いをする必要があります。それは、毎日増加した 10、20、40、60 分に日間、2、3、4、および 5、それぞれ。
3. 各セッションの終わりに、動物食糧報酬を与えます。動物の闘争、順化中も常に、セッションを停止します。

4. 開

注: 順化後に開頭術は録音のための脳の領域で行われます。頭でポスト インストールとして、麻酔下で脳定位固定装置のフレームで、開頭術を行います。頭ポスト インストール後の操作手順は同じです。

1. 開頭手術前にクロルヘキシジン ・ グルコン酸と 70% アルコールと綿棒で頭蓋骨をきれいに。
2. 慎重に記録サイトに歯科用のドリルで頭蓋骨をこすり。骨が十分に薄くなったら、メスの先端でカット、それを取り外します。
3. 頭蓋骨を強化するために公開されている地域歯科用セメントを置きます。
4. 歯科用セメントは、ハードになった後は、シリコーン接着剤で露出した脳領域をカバーします。2.8 の手順で説明した手術後の手順です。

5. 電気生理学的記録

1. 電気生理学的記録を実行する前に開頭手術後少なくとも 1 日回復する動物を許可します。それはときに記録が開始順化セッション中に行われた同じ方法で録音室に動物を配置します。
2. ガラス ピペット ホウケイ酸ガラス管を作る (外径 1.5 mm、ID を = = 0.9 mm、長さ 90.0 mm) 電極引き手を引いた。その先端径は 2-3 μ m と、彼ら 10 mM PBS で満ちているとき、彼らの抵抗は 4-6 MΩ。電極の長さは 40 – 50 mm です。いくつかの録音で 2 %neurobiotin は 10 mM PBS に追加されます。
3. ガラス ピペットをカスタムメイド optrode ホルダーに取り付けます。
4. ガラス ピペットに Ag Cl コーティング シルバー ワイヤ (直径 0.2 mm) を置きます。ピンを介して薄膜被覆電線に銀線を接続します。録音アンプのパッチアンプ用アダプターにピンを接続します。
5. 光ファイバー パッチコードを接続 (コア = 960 μ m クラッド = 1,000 μ m、NA = 0.63) ジルコニア フェルールと (OD = 2.5 mm) optrode ホルダーのスリーブを交配分割します。フェルールの先端ガラス ピペットの背面に接触するまで、袖にパッチ ケーブルを押し込みます。パッチ コード提供光 (波長 = 465 nm) LED から。LED の光は、シングル チャネル LED ドライバーによって制御されます。
6. 直上にシリコーン粘着剤を削除します。入れて温めた生理食塩水 (38 ° C) 脳表面の記録セッション中に乾燥を防ぐために定期的に脳の表面。必要な場合は、鋭いピンセットで硬膜を削除します。
7. マニピュレーターと脳組織にガラス電極を挿入します。挿入されたときは、電極抵抗を監視します。抵抗は電極の先端が破損する場合がありますので予想以上に低い場合、電極を取り付けます。関心の深さで検索し、2 に 5 μ m のステップでの深さを調整することによって 1 つの単位のスパイクを分離します。
8. 単一のユニットを分離後、LED ライトを提供、光刺激への応答を観察します。
9. 細胞の種類の同定後神経活動を記録します。2-3 h の録音を実行します。記録を (最大 2 日間) の連続した日に行った場合は、シリコーン接着剤で開頭手術をカバーしてください。録音を終了すると、動物が犠牲になると、ヘッドの記事を取得し、アセトン洗浄し、再利用に入れてください。

結果

図 2先端径の影響とガラス ピペット ピペット (図 2 a・B) の先端に光パワーでの長さを調べた。光のパワーは、先端から 1 mm を配置光パワーメータで測定しました。先端サイズを変えた、フルの長さを変化させた場合、先端サイズは 2.5 μ m に設定されている場合、全長は 50 ± 2 mm に設定されました。ガラス ピペットのシャンクは、8 mm に設定されました。3-5 mW (平均 ± SD; から先端の光図 2 a: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20;図 2 b: 4.24 ± 0.31 mW、 n = 21)。ピペットの先端サイズ (図 2 a) はほとんど光のパワーとの相関 (R...

ディスカッション

光遺伝学神経科学における強力なツールとなっています。それは、特定の神経活動を操作すると同様、特定のニューロン タイプ体内を識別するために利用されています。各種神経の神経活動の解明は、神経回路メカニズムの理解を促進します。ここでは、目を覚まし ChR2 vgat ノックアウト マウスの IC でガラス電極を介して記録サイトに光を配布する方法を示しました。

説明した方法のいくつかの重要な手順があります。まず、ターゲット細胞オプシンの十分な特定の表現で動物を使用するための要件です。細胞外記録と光に対する反応を識別するには、オプシンの活性化がターゲット ニューロンのスパイクを連想させることが必要です。いくつかのトランスジェニック マウスの実験のための最低年齢があるかもしれないと、ニューロンの遺伝子発現レベルが若い動物¹⁴で低いです。さらに、いくつかの追加実験光刺激に対する応答のターゲット ニューロンの種類 (例えば、免疫組織化学) に固有の確認を実行する必要があります。ターゲット ニューロンは興奮性、応答の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
電極ホルダー	分子デバイス	微	小電極増幅器用ピペットホルダー
セラミックスプリット嵌合スリーブ	Thorlabs	ADAF1	f2.5 mmフェルール
回路基板スペーサー	テイシン電機	SPA-320	f8.0 mm, 20.0mm 長
マウス用脳定位固定装置フレーム	成重	SR-6M-HT	マウス
用脳定位固定装置マニピュレーター	成重	NA	手動マニピュレーター
スーパーボンド	サンメディカル	M:204610557	歯科用接着剤 樹脂セメント
Form2 Formlabs		NA	3Dプリンター
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	低毒性シリコーン接着剤
ホウケイ酸ガラス毛細血管	成重	GD-1.5	OD 1.5 mm、ID 0.9 mm、長さ90.0mm
光ファイバーパッチコード	ドーリックレンズ	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	モノ光ファイバーパッチコード、外径、2.5 mm、コア = 960 mm、クラッド = 1000 mm、NA = 0.63
接続型 LED	ドーリックレンズ	LEDC-1B_FC	中心波長 = 465 nm、出力電力 = 45 mW (コア 960 mm 0.63 NA )
LED ドライバー	ドーリックレンズ	LEDRV_1CH_1000	1 ch LED ドライバー、最大出力 = 1000 mA
電極プーラー	成重	PB-7	二段式ガラスマイクロピペットプーラー
ホウケイ酸ガラス毛細管	成重	GD-1.5	ホウケイ酸ガラス毛細管 外径 1.5mm・内径 0.9mm・長さ90.0mm
ジェンタシン	MSD	株式会社 185711173	抗生物質軟膏
テラマイシン-LA	ゾエティス	G 333	オキシテトラサイクリン
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J	Jackson Labs	#14548	VGAT-ChR2マウス
マルチクランプ700B	分子デバイス	2500-0157	微小電極増幅器