方法論記事

覚醒マウス ガラス Optrode を持つ神経型のオプトジェネティクス同定

DOI：

10.3791/57781

⸱

2018年6月28日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

この記事について

サマリー

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この作品は、特注ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから確実に記録光単一ユニットを実行するメソッドを紹介します。

要約

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それはどのように異なる神経科学における主要な関心事は種類のニューロンは、神経回路の動作します。光遺伝学の最近の進歩は、広範な脳領域における生体内の電気生理学的実験で神経のタイプの id を有効にしています。光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。しかし、脳の表面から深い脳の領域に刺激ライトを提供するは難しいですよく。特に、目がさめている動物からの録音の場合は、しばしば、脳表面の光透過性が低く、脳深部の領域に到達する光線への刺激は困難です。ここでは、オーダーメイド ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから光にスパイク応答を記録する方法をについて説明します。この方法で光は確実に脳深部領域における光と記録されたニューロンを刺激できるように記録ガラス電極を介して配信されます。このカスタムメイドの optrode システムはアクセス可能で、安価な材料で構成されています、組み立てやすい。

概要

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中枢神経系のニューロンは、異なる機能を持つさまざまな種類で構成されます。神経回路内のニューロンのこれらの異なったタイプの仕組みは、神経科学における主要な関心事の一つです。しかし、脳の多くの地域で解除されたいくつかの例外を除いて電気スパイク信号自体に明確な違いはありませんので、電気活動の生体内での録音で神経の種類を区別すること。光遺伝学の最近の進歩は画期的な1,2にしました。神経細胞の特定の種類の光に敏感なオプシン (例えばチャネルロドプシン 2) を表現するトランスジェニック動物を使用して、効率的に体内録音3,の神経の種類を区別するために可能になった4,5,6。これらの動物で光に敏感なオプシンとニューロンの電気録音中に軽い刺激を与えることによって興奮しているが、他のニューロンはないです。オプシン陽性ニューロン、したがって、簡単に区別される他のニューロン タイプ光への応答。

光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。非侵襲的な方法として光はしばし....

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プロトコル

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すべてのプロシージャは、日本生理学会の動物ケア委員会の金沢医科大学の承認の原則に従って行われます。

1. ガラスの Optrode ホルダーの建設

注: ガラス optrode ホルダーを構築する商業電極ホルダーは使用 (図 1 a)。

  1. ホルダーのバレルから圧力制御用鋼管を優しく引き出します。
  2. ドリル、ホルダーのバレルのピン シート側の穴を広げます。深さ 3 mm 直径 12 mm の穴を作る。
  3. (直径 3 mm、厚さ 0.5 mm、長さ 8 mm のステンレス製パイプを入れてください。図 1A2) 穴の中。
  4. セラミックの穴に合うスリーブ ⌀2.5 mm フェルール (図 1 a1) を分割を挿入します。
  5. エポキシ接着剤で L 字の留めに電極ホルダーのバレルを固定します。
  6. これをネジを有するマニピュレーターに添付して、留めの穴 (直径 3 mm) を作る。

2. 頭ポスト インストール

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結果

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図 2先端径の影響とガラス ピペット ピペット (図 2 a・B) の先端に光パワーでの長さを調べた。光のパワーは、先端から 1 mm を配置光パワーメータで測定しました。先端サイズを変えた、フルの長さを変化させた場合、先端サイズは 2.5 μ m に設定されている場合、全長は 50 ± 2 mm に設定されました。ガラス ピペットのシャンクは、8 mm に設定されました。3-5 mW (平均 ± SD; から先端の光図 2 a: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20;図 2 b: 4.24 ± 0.31 mW、 n = 21)。ピペットの先端サイズ (図 2 a) はほとんど光のパワーとの相関 (R.......

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ディスカッション

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光遺伝学神経科学における強力なツールとなっています。それは、特定の神経活動を操作すると同様、特定のニューロン タイプ体内を識別するために利用されています。各種神経の神経活動の解明は、神経回路メカニズムの理解を促進します。ここでは、目を覚まし ChR2 vgat ノックアウト マウスの IC でガラス電極を介して記録サイトに光を配布する方法を示しました。

説明した方法のいくつかの重要な手順があります。まず、ターゲット細胞オプシンの十分な特定の表現で動物を使用するための要件です。細胞外記録と光に対する反応を識別するには、オプシンの活性化がターゲット ニューロンのスパイクを連想させることが必要です。いくつかのトランスジェニック マウスの実験のための最低年齢があるかもしれないと、ニューロンの遺伝子発現レベルが若い動物14で低いです。さらに、いくつかの追加実験光刺激に対する応答のターゲット ニューロンの種類 (例えば、免疫組織化学) に固有の確認を実行する必要があります。ターゲット ニューロンは興奮性、応答の.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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著者は、昇進の科学科研費補助金 JP16K11200 ・ 17 H 02223、会と金沢医科大学 S2016 8 C2017 3 研究グラントによって支えられました。写真を撮るに彼のサポートを Yuhichi クダを感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
電極ホルダー分子デバイス微小電極増幅器用ピペットホルダー
セラミックスプリット嵌合スリーブThorlabsADAF1f2.5 mmフェルール
回路基板スペーサーテイシン電機SPA-320f8.0 mm, 20.0mm 長
マウス用脳定位固定装置フレーム成重SR-6M-HTマウス
用脳定位固定装置マニピュレーター成重NA手動マニピュレーター
スーパーボンドサンメディカルM:204610557歯科用接着剤 樹脂セメント
Form2 FormlabsNA3Dプリンター
Kwik-SilWPIKWIK-SIL低毒性シリコーン接着剤
ホウケイ酸ガラス毛細血管成重GD-1.5OD 1.5 mm、ID 0.9 mm、長さ90.0mm
光ファイバーパッチコードドーリックレンズMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5モノ光ファイバーパッチコード、外径、2.5 mm、コア = 960 mm、クラッド = 1000 mm、NA = 0.63
接続型 LEDドーリックレンズLEDC-1B_FC中心波長 = 465 nm、出力電力 = 45 mW (コア 960 mm 0.63 NA )
LED ドライバードーリックレンズLEDRV_1CH_10001 ch LED ドライバー、最大出力 = 1000 mA
電極プーラー成重PB-7二段式ガラスマイクロピペットプーラー
ホウケイ酸ガラス毛細管成重GD-1.5ホウケイ酸ガラス毛細管 外径 1.5mm・内径 0.9mm・長さ90.0mm
ジェンタシンMSD株式会社 185711173抗生物質軟膏
テラマイシン-LAゾエティスG 333オキシテトラサイクリン
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548VGAT-ChR2マウス
マルチクランプ700B分子デバイス2500-0157微小電極増幅器
(株)

参考文献

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  1. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  2. Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and....

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