ここでは、一連の誘発のためのプロトコルおよび培養細胞の細胞老化の検証について述べる。私たちはさまざまな老化を誘発する刺激に焦点を当てるし、一般的な老化関連マーカーの定量化を記述します。私たちはモデルとして線維芽細胞を使用して技術的な詳細を提供するが、プロトコルは、さまざまな携帯電話モデルに合わせることができます。
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この記事について
サマリー
要約
細胞の老化は、さまざまな有害な刺激への応答でアクティブに永久的な細胞周期の停止の状態です。細胞の老化の活性化は、腫瘍の抑制、組織改造と高齢化を含むさまざまな病態生理学的条件の特徴です。生体内で細胞老化の誘導はまだよく特徴付けられます。ただし、 ex vivo細胞老化を促進する刺激の数を使用できます。その中で、最も一般的な老化誘導が複製枯渇、電離放射線し非電離放射線、遺伝毒性薬、酸化ストレスと demethylating とエージェントをアセチル化します。ここでは、これらの刺激を使用して老化に線維芽細胞を誘導する方法で詳細な指示いたします。このプロトコルは、簡単に、初代培養細胞やがん細胞を含む細胞の種類ごとに適応できます。老化誘導の検証するための異なる方法についても述べる。特に、我々 はライソゾーム酵素老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β gal) 細胞周期の表現のレベル 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) 取り込みアッセイを用いた DNA 合成率の活性の測定に焦点を当てるp16 の阻害剤と p21 と表情やメンバーの Senescence-Associated 分泌形質 (SASP) の分泌。最後に、私達は例の結果を提供し、これらのプロトコルのアプリケーションをさらに議論。
概要
1961 年、ヘイフリック、ムーアヘッドは、文化の主要な線維芽細胞が連続通路1の後の増殖の可能性を失うことを報告します。このプロセスは、各細胞分裂後シーケンシャル テロメア短縮が原因です。テロメア批判的に短い長さに達する、増殖の不可逆的な停止を活性化する DNA 損傷応答 (DDR) によって認識されます-複製老化としても定義されています。複製老化細胞のマイトジェンとアポトーシス シグナル2,3の両方に依存しないレンダリングする永久的な細胞周期の停止の状態を誘導するために知られている多くの刺激の 1 つされて。老化プログラムは通常高リソソーム活動、ミトコンドリア、核変化、クロマチン再編成、小胞体ストレス、DNA の損傷と老化関連を含む追加の機能によって特徴付けられる分泌型表現型 (SASP)3,4。老化細胞体に複数の機能がある: 開発、創傷治癒およびがん抑制2。同様に、彼らは高齢化と、逆説的に、腫瘍の進行5で重要な役割を再生する知られています。老化の負の値、および部分的に矛盾した効果は、SASP6頻繁に原因です....
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プロトコル
1. 一般準備
- D10 メディアを準備します。10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM 培地 Glutamax を補う (最終濃度: 100 U/mL)。
- 滅菌 PBS を準備します。製造元の指示に従って水の錠剤を溶解します。オートクレーブで滅菌します。
- 1 x トリプシンを準備します。トリプシン Versene EDTA/10 の 5 mL の希釈 1:10 45 mL の滅菌 PBS で x。
注: プロトコルを通して我々 使用に近い培養条件、生理学的な主線維芽細胞のための条件。これは、「標準」20 %o ではなく通常やったが、 5% O2 37 ° C、5% CO2で細胞を我々 孵化させなさいことを意味2. - 層流フード、白衣、手袋を使用して無菌状態ですべてのサンプルを処理します。20% O2 (部屋条件) で処理されている間だけ細胞を保ちます。
2. 老化の誘導
- 複製老化
- 細胞またはそれら接触する任意の材料を処理する間 (pipets、フラスコ、メディア、等) は、層流フード、白衣、手袋を使用して無菌条件の下で動作します。20% O
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結果
SA β gal 染色老化線維芽細胞の濃縮
Β-ガラクトシダーゼ (β gal) すべての細胞で発現していること、最適な pH 4.025,26のライソゾーム酵素であります。ただし、老化、中にリソソームのサイズが大きく、その結果、老化細胞蓄積 β gal。この酵素の増加量は、最適 pH 6.025,27もその活性を検出することが可能。図 1 aは、老化の主な線維芽細胞と増殖の SA β gal 染色の代表的なイメージを示しています。セルには、拡大と不規則な細胞体も見てください。前述のように、こと個々 の細胞を区別するは難しい、共同 DAPI 染色容易に可視化と細胞 (.......
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ディスカッション
ここで説明したプロトコル最適化した一次線維芽細胞、特に BJ と WI-38 細胞。複製老化、電離放射線、ドキソルビシンのためのプロトコルは (HCA2 および IMR90) 線維芽細胞と他の細胞型 (すなわち新生児メラノサイトとケラチノ サイトまたは iPSC 由来心筋細胞) の他のタイプに正常に適用されています。本研究室では。ただし、その他の細胞のタイプのための適応は、シード細胞、メソッドおよびプラスチック サポートにアタッチ/デタッチの細胞を助ける化学物質の番号や毒性を避けるために治療の投与量などいくつかの詳細を調整することによって最適化できます。
主線維芽細胞の使用もポーズの課題の数です。老化細胞が通常増殖より、デタッチするのには難しく、trypsinization をより敏感またはデタッチ メソッド、デタッチ後生存率のものよりわずかに低いことを意味の他のタイプが多い増殖細胞。さまざまな老化誘導方法に適切なコントロールの選択は困難です。例えば、ドキソルビシンなど薬物による治療、車両と短い治療お勧め: ドキソルビシン処理細胞の対照サンプルの場合 24 時間 PBS に続いてす.......
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謝辞
実りある議論のため管理者にラボと Thijmen ヴァン Vliet と紫外線による老化のプロトコルのデータを共有するためのメンバーに感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| ウシ胎児血清 | Hyclone | SV30160.03 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S; 10,000 U/ml) | ロンザ | DE17-602E | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| ヌクレアーゼフリー水 (DEPC処理なし) | Ambion | AM9937 | |
| T75フラスコ | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml 微量遠心チューブ | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL遠心分離管 | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6ウェルプレート | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24ウェルプレート | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm丸型カバースリップ | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV放射室 | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| ドキソルビシン二塩酸塩 | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| 酸化水素溶液 | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2'-デオキシシチジン | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| 酪酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-&β;-D-ガラクトピラノシド) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| クエン酸一水和物 | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| 二塩基性リン酸ナトリウム | Acros organics | 7782-85-6 | |
| フェロシアン化カリウム | フィッシャーサイエンティフィ | 14459-95-1 | |
| フェリシアン化カリウム | フィッシャーサイエンティフィック | 13746-66-2 | |
| 塩化ナトリウム | メルクミリポア | 7647-14-5 | |
| 塩化マグネシウム | フィッシャーケミカルズ | 7791-18-6 | |
| 25% グルタルアルデヒド | ッシャーサイエンティフィ | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% ホルムアルデヒド (w/v) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 28908 | |
| EdU (5-エチニル-2'-デオキシウリジン) | Lumiprobe | 10540 | |
| スルホ-シアニン3アジド (スルホ-Cy3-アジド) | Lumiprobe | D1330 | |
| アスコルビン酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| 硫酸銅(II) 五水和物 (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics 215682500 | ||
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | ロシュ | 4729749001 | |
| ライトサイクラー 480 シーリング フォイル | ロシュ | 4729757001 | |
| センシファストプローブ Lo-ROXキット | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL プローブライブラリ | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting スライド | Bio-Rad | 145-0017 | |
| ドライインキュベーター | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| ジメチルホルムアミド | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | ||
| #PM992 ピンセット | |||
| ニードル |
参考文献
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J.
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