大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

Summary

大人の皮膚組織からプライマリ ヒト角を効率的に分離するためのプロトコルをご紹介します。このメソッドは、自発的に皮膚細胞から表皮細胞を分離する接種培地で岩阻害剤の Y-27632 を使用して従来の手順を簡素化します。

Abstract

新鮮な皮膚組織とその拡大培養から分離されたプライマリ ヒト角は実験室の研究および臨床応用、広く使用されています。ヒト角化従来の分離方法は、低細胞回収率、減らされた細胞による成体組織から細胞を生成する効率的に証明されている 2 つの連続酵素消化手順生存率。我々 は最近、媒体の Rho キナーゼ阻害剤 Y-27632 を活用した皮膚組織中の人間の主な表皮の前駆細胞を分離する高度な方法を報告しました。従来のプロトコルと比較して、この新しいメソッドは、単純な簡単に、そして少ない時間のかかる、上皮幹細胞収量が増加し、その幹細胞の特性が向上します。さらに、新しい方法論は真皮から表皮の分離を必要としないし、したがって、異なったタイプの大人のティッシュからの細胞を隔離するために適しています。この新規分離培養手法は従来の方法の主な欠点を克服、高能室と臨床応用の両方表皮細胞の大量生産に適しています。ここでは、詳細に新しい手法について述べる。

Introduction

目標は、臨床応用の特に成体からプライマリ人間ケラチノ サイト (HKCs) を分離する簡単で効率的なプロトコルを開発することでした。皮膚表皮幹細胞、皮膚の基底層に局在を持って増殖し区別するため、皮膚^1,2,3,の機能を維持するケラチノ サイトを提供する可能性の高い⁴. HKCs 組織は皮膚組織工学と再生のために特に痛んだ肌の修復と遺伝子治療臨床応用^5,6広く皮膚から分離しました。HKC ベースのアプリケーションにとって重要な問題は、効率的に分離し、高い潜在的な体外^7,8で HKCs の大きな数字を展開することです。これらのメソッドは時々 時間がかかり、実行および低細胞収率と皮膚標本の種類によって限定されているなど、その他の制限に関して複雑なさまざまな研究グループは、幹のような HKCs の文化を生産する方法を開発しているが、⁹を使用します。例えば、皮膚組織中の HKCs を分離する従来の方法は、⁶真皮から表皮の分離と 2 段階の酵素消化を含まれます。そのメソッドは通常新生児の組織のためによく働くが、成体組織から細胞を分離するために使用するとき非常に困難します。

Y-27632、Rho 関連キナーゼ (ロック) の阻害剤は、表皮幹細胞の分離と植民地成長^10、11,12の効率を大きく向上する報告されています。以前の研究では、我々 は Y-27632 は表皮細胞のクローナルな増殖が容易になりますが、特異的接着分子¹³式を制御することによって皮膚細胞の収量が減少を発見しました。また、G の中、成長と一次表皮細胞の収量をサポートすると呼ばれる新しいエアコン接種媒体を確立しました。Y-27632 を G の中を組み合わせることによりこの手法自発的に表皮真皮分離^13,14のステップを除去する酵素の消化力の後表皮及び真皮細胞を区切ることができます。大人の皮膚組織から HKCs を分離するこの新しい方法の詳細な手順を述べる今以前の報告に基づき、.

Protocol

このプロトコルで使用される人間の組織は、金融機関の人間研究倫理委員会のガイドラインによると処理されている (NO.2015120401、日: 2015 年 5 月 12 日)。

1. 準備

1. 冷たいダルベッコの 10 mL と 50 mL のチューブの病院で整形手術から破棄収集新鮮な大人の腹部皮膚組織のイーグル培地 (DMEM)、変更されました。供試体は、細胞生存率を大きく影響せず 72 h まで 4 ° C で保存できます。
2. 下記のとおり、試薬、培地を準備します。
   1. (100 U/mL) ペニシリンとストレプトマイシン (100 mg/L) の 1 mL を 50 mL のリン酸緩衝液 (PBS) 洗濯ソリューションを準備するのに追加します。
   2. 酵素消化液の 2 つのセットを準備: (1) 当期 (DMEM で 2.5 mg/mL) の 50 mL を準備し、50 mL のタイプ I はコラゲナーゼ (DMEM で 2.5 mg/mL) 別に従来法;(2) 当期の混合物の 50 mL を準備し、コラゲナーゼをタイプ I (ディゾルブ 125 mg 当期粉末、125 mg の I 型コラゲナーゼ粉 DMEM の 50 mL の) 新しいメソッドの。
      注: すべての酵素のソリューション必要がありますフィルタ リング 0.22 μ m ストレーナー付けや at4 ° C を保持
   3. 両方のメソッドに対して消化ソリューションを準備: 0.05% トリプシンと 0.25% トリプシンに商業的に購入しました。10 mg/ml DNase 私私粉末の 5 mL の PBS、DNase の 50 mg を溶解することによりソリューション 0.22 μ m ストレーナーとフィルター、-20 ° C で保存
   4. 酵素の消化力を中和するために媒体の 500 mL を準備: 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン DMEM 培。
   5. 500 ml 接種培地 (成長因子を含む中、G の中と呼ばれる) の: 40 ng/mL の線維芽細胞成長因子 2 (FGF2) 20 ng/mL 上皮成長因子 (EGF)、40 μ g/mL fungizone 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM/F12 (3:1) 培地と2 %b27 を補足します。
   6. 100 mm 細胞培養を前処理料理型を含むコーティング マトリックスの 2 mL の私部屋の温度で 30 分のコラーゲン。

2. 従来の方法

1. 皮膚組織の前処理方法
   1. 皮膚組織の 1.5 cm²を取るし、それを洗って 1 x 10 の mL の PBS。30 の 70% エタノール 10 mL 洗い流し、s それを孵化と 10 ml の洗浄ソリューション (PBS 2% ペニシリンとストレプトマイシンを含む)、5 分の 2 倍。
      注: すべての洗浄は、層流フードの内部 100 mm 細胞培養皿で行われます。
   2. 100 mm 細胞培養ディッシュで皮下脂肪層を削除し、(重量はこのプロトコルでは 1 g) 皮膚組織を推し量る滅菌はさみで組織をトリミングします。
      注: 十分なトリミングは真皮から表皮の効率的な分離のため非常に重要です。黄色の脂肪層は、視覚的に簡単に区別できます。
   3. ダウン組織を別 100 mm 滅菌皿真皮側に転送、その後、皮膚組織をメス刃を使用して 3-4 mm 幅の短冊状にカットします。
      注: 脂肪層と真皮側が視覚的に認識されます簡単に。
   4. 100 mm ディッシュの皮膚組織に 2.5 mg/mL 当期溶液 10 mL を追加し、その後、4 ° C (20 h 以上) で一晩中皿をインキュベートします。
      注: 当期溶液の量は、組織の各グラムの消化のため当期溶液 10 mL を使用して計算できます。
2. 皮膚組織からの表皮の分離
   1. 2 日目、良いピンセットを使用して真皮から表皮をはがします。
      注: 表皮を剥がしにくい場合は、当期の消化が足りなかった、ティッシュの不十分なトリミングのため通常であります。この場合、組織より長い培養時間を必要があります。
   2. メス刃; を使用して組織液に細胞培養液 500 μ L で皮をむいた表皮をミンチします。10 mL を 50 mL チューブに 0.25% トリプシンとそれを再懸濁し、それの揺れで、37 ° c の水浴中 20 分を孵化させなさい。
3. コレクション、初代培養細胞の培養
   1. トリプシン活性を中和する中和液 (このプロトコルでは 10 mL) の等しい量を追加することによって。
   2. 20 x 上下ソリューションを 10 mL の血清ピペットでピペッティングによる表皮細胞を分離し、残存組織の残骸を削除する 100 μ m セル ストレーナー携帯ソリューションを渡します。
   3. ろ過の後 200 x gで 5 分で細胞液を遠心分離します。洗浄用中和培地で細胞ペレットを再懸濁します、その後、細胞ペレットを取得する 200 x gで再度遠心。
   4. 低カルシウム、無血清ケラチノ サイト媒体 (SFM) の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。このソリューション総細胞数をカウントし、コーティングのマトリックスで前処理した 100 mm 細胞培養皿に SFM の 10 mL で約 2 x 10 の⁶セルをプレートの 10 μ L を取る (を含むタイプ I コラーゲン)。
      注: コーティングは、従来の方法に必要なステップです。
   5. 培養培地ごとの 2 d を変更します。
      注: は前に、と培養液を変更した後、顕微鏡の下で細胞粘着をチェックします。
   6. 通路、細胞の約 80% に達すると合流。
      注: すべての培養皿はコーティング行列で前処理しました。

3 新しい方法

1. 皮膚組織の前処理方法
   1. 組織に従って上記 (ステップ 2.1) 従来の方法を収集します。
   2. 皮膚組織 1 を洗って 10 ml の PBS の x (重量はこのプロトコルでは 1 g 程度) 電子スケールで滅菌したプラスチック容器の重さと。
      注: このプロトコルに必要な組織の最小重量は 0.1 g 使用組織標本が小さすぎる場合、十分な細胞数を得ることが困難だからです。オペレーターの処理能力に依存する最終的にこのプロトコルのための組織の最大重量はありません。
   3. 鉗子を使用して、30 の 70% エタノール 10 mL で皮膚組織を洗浄する s。
   4. 2 組織をインキュベート洗浄ソリューション (2.1.1 の手順で準備)、5 分の各時間の 10 ml x。
      注: 上記すべての洗浄手順は、100 mm 細胞培養皿 (ティッシュ文化フード) の層流フードの内部で実行されます。
   5. 滅菌 100 mm セル ディッシュを別組織に転送します。
   6. メスのブレードを使用すると、すると、組織は組織スラリーに徹底的にミンチします。
   7. 濡れている組織を維持する 200 μ L の PBS 5 分ごとを追加します。
      注: は、手順 3.1.5 - 3.1.7 約 15 分かかります。上記のすべての手順は、部屋の温度で行われます。
2. 皮膚組織の消化
   1. 50 mL チューブに均質化組織ソリューションを転送します。皮膚組織のすべての 1 g の酵素の混合物の 10 mL を追加します。均質化組織に酵素を徹底的にミックスします。
   2. 1 h の 37 ° C の水浴の揺れとの混合物を孵化させなさい。
   3. 37 ° C の水浴中で 30 分間別消化混合物に 1/5 量 0.25% トリプシン (このプロトコルで 2.5 mL) を追加します。
   4. DNase を追加私ソリューション 1: 100 (v/v) 比率 (このプロトコルで 250 μ L) で酵素の混合し、室温で 5 分間インキュベートします。
3. コレクション、初代培養細胞の培養
   1. 1:1 の比率で中和中 12.5 mL を追加することによって消化力プロセスを停止します。約 20 x、10 mL の血清ピペットを使用してセルを分離するソリューションを上下にピペットします。
   2. ティッシュの残骸を削除する 100 μ m セル ストレーナー解離細胞をフィルターします。200 x gで 5 分間観察チューブの下部にペレットで上清を遠心します。
   3. 上澄みを廃棄し、200 x g細胞を収集するために 5 分間で 10 mL、中和中、遠心力で細胞ペレットをもう一度洗浄します。
   4. 10 mL 接種培地 (G ステップ 1.2.5 から媒体) の Y-27632 の 10 μ m で細胞ペレットを再懸濁します。
   5. 総セル数をカウントし、100 mm 細胞培養ディッシュに G の中の 10 mL で約 2 x 10 の⁶セルをプレートに溶液 10 μ L を取る。
      注: プリコートのステップは新しいメソッドに必要ななく、真皮層の除去は不要ですか。
   6. 3 d の後、接種培地を低カルシウム SFM 媒体に置き換えます。培養培地ごとの 2 d を変更します。
      注: は前に、と媒体を変更した後に細胞接着をチェックします。
   7. 通路、細胞の約 80% に達すると合流。
      注: 必要に応じて、2 分の 0.05% トリプシンで細胞を前処理し、表皮細胞をトリプシン前に皮膚細胞を汚染する PBS のセルを洗浄します。

4. 細胞の継

1. メディアを取り出して、洗浄、pbs セルと、(各 100 mm 皿) あたり 0.05% トリプシンの 2 mL を加えます。
2. 5 分のためのインキュベーター (5% CO₂と 37 ° C) のセルを孵化させなさい。
3. すべての細胞が培養皿から切り離されるかどうかを確認する顕微鏡を使用しているセルを確認します。
4. 10 %dmem の 8 mL を加えて酵素反応を中和し、15 mL チューブに細胞を収集し、FBS。
5. 200 x g細胞ペレットを取得する 5 分間の遠心分離機します。
6. ゆっくりと上澄みを除去、その後、SFM 培地 10 ml 細胞ペレットを再懸濁し、セルの数をカウントします。
7. 1 x 10 の⁶セルは、各セル 100 mm 皿に SFM の 10 mL でプレートします。
8. 媒体ごとの 2 d を変更します。

Results

(図 1 b) の従来の方法と新しい方法 (図 1 a) の回路図は図 1に示した。従来は、2 日目の手順を必要とする 2 段階の消化です。対照的に、新しいメソッドは、実行に約 3 時間かかりますワンステップ消化です。重要なは、ワンステップの新しいメソッドは接種培地に Y-27632 の存在に依存する同時に 2 つの集団 (表皮および真皮細胞) を取得できます。また、初期文化時間約 80% に到達する表皮細胞に、同じ数のセルは分離後接種した場合に合流で最低 3 日間より少なく従来の方法よりも通常かかります。

新しいメソッドは、コロニー形態で育つ他の主の表皮細胞を生成します。G の中で組織が接種された人間の皮膚から分離された HKCs Y-27632 を含みます。同じ数のセルは...

Discussion

培養主 HKCs は、3 年以上の診療所で傷を治療するために広く利用されているし、その時間以来常にタイムリーで効率的に臨床応用のための細胞の十分な数を取得することが重要です。したがって、実習では、真皮から表皮の分離を必要とする従来の分離法が難しく細胞と成体細胞を通過する低能力の低収量のためのこれらの要求を満たすために。ここでは、効率的に研究室と臨床応用の両方より適している前レポート^13,14、に基づいて成体組織から HKCs を取得するため開発した新しい手法について述べる.

新しい方法で最良の結果を達成するために次の重要な手順に注意を支払わなければなりません。まず、均質化の手順は重要な手順です。破砕不足は明らかに解離細胞の低収量で酵素消化の効率に影響を与えます。第二に、トリプシン消化手順は、; 30 分以上を服用してはいけませんそうでなければ、解離細胞の生存率が低下します。第三に、解離細胞を効率的に収集するには、ろ過用セル ストレーナーの細孔径が 100 μ m に...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess 全自動セルカウンター	Invitrogen Inc.	C10227	自動セルカウント
CO2インキュベーター	Thermo Scientific	51026333	細胞インキュベーション用
Sorvall ST 16R 遠心分離機	Thermo Scientific	75004380	細胞遠心分離機
恒温シェーカー	上海ボックスン	150036	ウォーターバス用
電子スケール	ハルビン中輝	1171193	組織計量用
細胞培養皿	エッペンドルフ	30702115	細胞培養用
50ml 遠心チューブ	KIRGEN	171003	細胞遠心分離用
セルストレーナー	コーニング社製	431792	細胞ろ過
リン酸緩衝液	Solarbio Life Science	P1020-500	洗浄液
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	中和培地の成分
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	表皮細胞培養培地
ペニシリン ストレプトマイシン	Thermo Scientific	15140-122	抗生物質
ウシ胎児血清	バイオロジカルインダストリー	04-001-1AC5	HKC
0.05%トリプシン		ライフ	テクノロジー25300-062
	北京ソーラーバイオサイエンス&技術	T1350-100	HKC解離
用 コーティングマトリックスキット	ライフテクノロジー	ズ R-011-K	コーティングマトリックス
用 ディスパーゼ	Gibco	17105-041	HKC分離
用 コラゲナーゼI型	ライフテクノロジー	ズ 17100-017	HKC分離用
デオキシリボヌクレアーゼI	シグマ	9003-98-9	HKC分離
用 F12栄養ミックス、ハム	ライフサイエンス	31765035	G-mediumの成分
B27サプリメント	ライフサイエンス	17504044	G-mediumの成長因子
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	G-mediumの成長因子
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK阻害剤
Fungizone	Gibco	15290026	G-medium
EGF組換えヒトタンパク質	の調製 Gibco	PHG0311	G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	細胞増殖および細胞毒性アッセイ
マウス抗ヒトサイトケラチン5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	HKCの
分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用ウサギ抗ヒトロリクリン	コーヴァンス	PRB-145p	HKCsの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用
マウス抗ヒトビメンチン	細胞シグナル伝達技術	3390	真皮線維芽細胞の免疫蛍光染色用
インテグリン&アルファ;6(GOH3)	サンタクルス	SC-19622	HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruzの	SC-2831	&αの陰性対照抗体;6-インテグリン フローサイトメトリー分析