Method Article

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR ポリメラーゼ連鎖反応による定量化のため。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ Rna (Mirna) は、post-transcriptionally 細胞の遺伝子発現を調節する小さな Rna のクラスです。3' 非翻訳領域 (UTR) にバインドする Mirna ターゲット蛋白質翻訳を阻害したり、いくつかのインスタンスで mRNA 分解を引き起こす mRNA。3' UTR マイクロ Rna の 5' 端に 2-8 塩基種子による mRNA ターゲットの miRNA のバインディング。細胞の制御分子としての Mirna の役割が確立している機能的関連性でターゲット Mrna の同定課題のままです。Bioinformatic ツールは miRNA のバインドの潜在的なターゲットとして 3' UTR Mrna の内のシーケンスを予測するために採用されています。これらのツールは、機能的な役割を予測する試みの近縁種の中でこのような配列の進化的保存を決定するため利用されています。ただし、これらの計算方法は、しばしば偽陽性の結果を生成、miRNA と mRNA の正規の相互作用を予測する制限されます。したがって、マイクロ Rna、mRNA ターゲットへの直接結合を測定実験の手順、機能的相互作用を確立する必要。本報告では、細胞の miRNA のミール 125b と 3' UTR PARP 1 mRNA の直接相互作用を検証するため機密性の高いメソッドをについて説明します。合成ビオチン miRNA を模倣された哺乳類細胞にトランスフェクション細胞ライセート ミルナ ・ mRNA 複合体ストレプトアビジン コートした磁気ビーズをおろされたプロトコルを詳しく説明します。最後に、ターゲットは qPCR ベースの戦略を使用してプル ダウン核酸複合体の mRNA の定量化を行った。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ Rna (Mirna) は小さなタンパク質式1を負に制御する rna。マイクロ Rna の前駆体は、ゲノム、遺伝子間領域と蛋白質のコーディングの遺伝子2,3のイントロン内にある最も頻繁の多くの地域でクラスターに存在します。Mirna の miRNA エンコーディングから pri miRNAs の転写を含む遺伝子4。Pri miRNAs はシーケンシャル処理、核最初単一の孤立した成熟 Mirna4,5を生成する細胞質にしを受けます。その後、成熟 Mirna が RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に組み込まれている: ターゲット認識4,5のための蛋白質のアルゴノート家族のメンバーを含むポリコームタンパク蛋白・ RNA 複合体 6,7。RISC の複合体の成熟 Mirna は主に 3' UTR ターゲット Mrna8,9,10のバインド、時折、コーディングおよび mRNA の10、11 の 5' UTR 領域にバインドすることも.MRNA に miRNA のバインディングはシーケンス結果翻訳サイレンシング12,13,14といくつかのケースの mRNA の不安定化の15です。単一のマイクロ Rna は多くの Mrna をターゲットできます、のでこれらの規制の分子細胞のほとんどすべてのプロセスに関与しているし、様々 な病気の条件16,17,18に関与しています。

Mirna が細胞経路を調整する方法の詳細な理解には、ターゲット Mrna の同定が必要です。複数のバイオインフォマティクスのプラットフォームは、推定 miRNA:mRNA 相互作用19,20を予測します。これらの予測は、miRNA の 2-8 塩基種子とターゲット mRNA4,21内補足シーケンスの完璧なワトソン Crick 基本組み合わせに依存します。さらに、これらのツールを miRNA:mRNA 二重の二次構造を生成、この分子間相互作用の熱力学的パラメーターを計算およびターゲットの機能的関連性を高めるために種にわたって結合部位の保全を表示予測。残念ながら、これらのツールも非常に高率 (~ 27-70%)15,22偽肯定的な目標を予測の制限があります。最も重要なは、これらのインシリコプラットフォームは彼らのターゲットの23の miRNAs の非正規の相互作用を認識に失敗します。したがって、そのような予測分析はしばしば機能的関連性の高いターゲットを検証するための実験方法と組み合わせて.

複数のアプローチは、miRNA:mRNA 相互作用の実験的検証に開発されています。MiRNA の模倣を使用して遺伝子実験、スポンジとセルの miRNAs のレベルを変更する阻害剤ターゲット遺伝子発現24,25,26の規制影響について手がかりを提供します。さらに、記者ターゲット mRNA および miRNA mimics の 3' UTR 領域を含むクローンとの共トランスフェクションによるアッセイまたはセルに阻害剤は、miRNAs26の調節機能の証拠を提供します。これらのメソッドは、Mirna による遺伝子発現の転写後調節を研究することが重要ですが、miRNA の細胞レベルにおける変化のトランスフェクション効率と pleotropic 効果がこれらの遺伝的アプローチ23の主要な制限 26。したがって、miRNA とターゲット間の直接相互作用を調査する補完的な生化学的手法は Mirna の細胞機能を理解するために用いられます。

MiRNA とターゲット間の直接対話を勉強する 1 つの広く使われている方法は、複雑な27,28,29,30 内 mRNA ターゲットの検出によって続いて RISC の複合体の免疫沈降.最近では、RISC トラップ法の改良はまた miRNA ターゲットを識別するために利用されました。それはターゲット mRNA の精製と RISC マイクロ Rna mRNA 中間体内のターゲットの安定化が高まります。ただし、これらの methodsface は、通常、分離細胞コンパートメント31,32の RNA、RNA 結合タンパク質の非特異的相互作用の固有の挑戦。さらに、これらの試金は RISC 複雑な33の免疫沈降の AGO2 タンパク質の存在に依存しています。AGO2 は効率的な miRNA:mRNA の相互作用を仲介するだけのアルゴノートではない、他の argonautes の排除は偏った結果34に 。したがって、mRNA に miRNA の直接結合を勉強する代替戦略が必要です。

本報告で我々 は miRNA とターゲット間の直接対話をプロービングのためのワンステップ アプローチ手の込んだ mRNA。まず、3' ロックされているビオチン化核酸 (LNA) miRNA 模倣は哺乳類細胞に導入しました。その後、細胞ライセートの複雑な miRNA:mRNA は、ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズを用いたがキャプチャされます。その補完の miRNA にバインドされている mRNA ターゲットは、qPCR を使用して定量化されます。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3'-ビオチン化マイクロ Rna のトランスフェクション

注: 滅菌層流フードの内部次の手順に従います。

  1. シード 4 x 105–5 × 105 HEK 293 t 細胞あたり 2 mL でよくダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) [DMEM 10% ウシ胎児血清 (FBS) とペン連鎖球菌性抗生物質 x 1] を完了します。37 ° C、5% CO2一晩で設定インキュベーターで培養します。
  2. 次の日は、健康と光学顕微鏡の下でめっきされたセルの付着を確認します。
    注: 細胞が付着し、次のステップに進む前に適切な形態を達成したことを確認します。HEK 293 t 細胞は通常 18-24 h の transfection のため準備ができているポストめっき。
  3. 1.7 mL の滅菌および microfuge の管で最小限の必須メディアを 200 μ l 添加のビオチン標識 miRNA の 75 picomoles を希釈します。このミックスを別 1.7 mL および microfuge 管含むリポソーム ベースのトランスフェクション試薬 (8 μ L/ウェル) 最小限の重要なメディアの 200 μ L で希釈に転送します。ミックスを徹底的にでもやさしく、ピペッティングとトランスフェクション複合体の形成を許可する室温で 20-25 分間インキュベートします。
  4. 穏やかなピペッティングして 6 よく培養プレートから古いメディアを削除し、作りたての完全な DMEM (ペン連鎖球菌性抗生物質 x 1) なしの 1.6 mL の各ウェルを補充します。
  5. (1.3) から drop-wise よく校正ピペットを使用して 6 ウェル プレートで細胞にトランスフェクション錯体を追加します。板全体の均一な分布を確実に錯体を追加しながら優しくプレートを旋回します。
    注: この手順は、高効率遺伝子導入を実現するため非常に重要ですし、注意と忍耐で実行する必要があります。
  6. 少なくとも 36 h の 37 ° C および 5% の CO2の細胞を培養します。

2. 準備ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズ-私

  1. ボルテックスによって、ストレプトアビジンの磁気ビーズを徹底的に再懸濁します。(サンプルごと) ビーズ懸濁液 30 μ L を 2 mL ヌクレアーゼ フリーおよび microfuge の管に転送します。
  2. 2 分の磁気ビーズ区切りスタンド (「マグネット」以下) にビーズ懸濁液を含んでいる管を配置します。ビーズがマグネットに接触してチューブの側面に描かれていることを確認した後、マイクロ ピペットを使用して上清を慎重に取り外します。
  3. ビーズにビーズ洗浄バッファー (10 mM Tris Cl pH 7.5、0.5 ミリメートルの EDTA、1 M 塩化ナトリウム) の 100 μ L を追加します。磁石からチューブを削除します。15 の渦、ビーズを洗浄する室温で s。
  4. 2 分のための磁石にビーズを含むチューブを置き、慎重に削除、上澄みを廃棄します。
  5. 3 つの洗浄の合計は 2.3 と 2.4 の手順を繰り返します。最終的な洗浄ステップの後に、磁石からチューブを削除します。
  6. ビーズにソリューション (0.1 M NaOH、0.05 M 塩化ナトリウム) を解放 RNase の 100 μ L を追加、15 のボルテックスでよく混ぜる、s と 5 分場所 2 分のための磁石にビーズを含む管、室温でインキュベートし、慎重に削除、上澄みを廃棄します。
  7. 3 回の合計 2.6 手順を繰り返します。
  8. ビーズ、渦 15 s にビーズ巻き上がりソリューション (0.5 M NaCl) を追加し、5 分は 2 分のための磁石に再懸濁のビーズを置き、上澄みを慎重に削除のために、室温でインキュベートします。
  9. ビーズにブロッキング液 (1 μ g/2 μ g/μ L 酵母 tRNA μ L BSA) ビーズの 200 μ L を追加します。ミックス 15 の穏やかなボルテックスによって室温で s。16 h (オーバー ナイト) 多管回転子の 4 ° C で孵化させなさい。

3. セル Lysates の準備

  1. 層流フードの内部の無菌細胞スクレーパーを使用して穏やかスクレーピングによって transfected HEK 293 t 細胞を採取し、滅菌 2 mL および microfuge の管に各サンプルを転送します。
  2. 1,500 × gで遠心分離によって掻き細胞のペレットの 5 分は、滅菌 PBS (リン酸バッファー生理食塩水)、pH 7.2 × 1 でペレットを再懸濁します。ペレット残留メディアの自由を取得する 5 分間 1,500 × gで遠心するもう一度。すぐに突入する氷に餌を含んでいる管。
  3. 新鮮な完全なセル換散バッファーを準備 (150 mM NaCl、25 ミリメートル pH 7.5、トリス-の Cl 5 mM DTT、0.5 %igepal、60 U/mL Superase プロテアーゼ阻害剤 1)。
    注: IGEPAL、Superase、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテルに欠けているセル換散バッファーの在庫が事前に準備して、常温保存します。在庫のセル換散バッファーに推奨される最終的な濃度で上記の補足を追加して氷の上に格納することによって完全なセル換散バッファーの新鮮なバッチを準備します。
  4. および microfuge の管 (すなわち、各および microfuge の管には 6 ウェル プレートの 1 つの井戸から採取した細胞が含まれています) では各サンプルに冷たい完全セル換散バッファーの 260 μ l 添加し均一な懸濁液にピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。
  5. 凍結融解法を用いた細胞の溶解:-80 ° C で 10-15 分でチューブを孵化させなさい。氷の上解凍する細胞、許可します。
  6. 4 ° C で設定冷蔵ベンチトップ遠心分離機で 5 分間 16,000 x gにて、結果細胞を遠心分離します。
  7. 氷の上、滅菌 1.7 mL および microfuge の管にクリア細胞ライセートを転送します。ペレットを破棄します。
    注: の最終巻クリア ライセートはず 〜 240-250 μ L。
  8. ライセートをクリアの 5 M NaCl を加える最終濃度 1 M と氷のサンプルを維持します。

4. ストレプトアビジン磁性ビーズの作製-II

  1. 新鮮な完全なプルダウン洗浄バッファー (10 mM KCl 1.5 mM MgCl210 mM Tris Cl pH 7.5、5 mM DTT、1 M 塩化ナトリウム、0.5 %igepal、60U/mL、Superase、1 x プロテアーゼ阻害剤カクテル) を準備します。
    注: IGEPAL、Superase、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテルを欠けているプルダウン洗浄バッファーの在庫が事前に準備して、常温保存します。在庫のセル換散バッファーに推奨される最終的な濃度で上記の補足を追加して氷の上に格納することによって完全なセル換散バッファーの新鮮なバッチを準備します。
  2. 2 分のための磁石の (ステップ 2.9) から準備されたビーズは慎重に削除し、上澄みを廃棄を含む管を配置します。
  3. ビーズに冷たい完全なプルダウン洗浄バッファーの 150 μ L を追加します。15 の渦 s し, 室温で 30-60 s. 場所 2 分のための磁石の管は慎重に削除し、上澄みを廃棄します。
  4. 3 回の合計 4.3 手順を繰り返します。
  5. 完全なプルダウン洗浄バッファーの 300 μ L でビーズを再懸濁します。

5. ターゲット mRNA-マイクロ Rna 複合体のプルダウン

  1. (ステップ 3.8) から細胞ライセートの 300 μ L を転送 (ステップ 4.5) からビーズの 300 μ L を含むおよび microfuge の管に。
  2. 室温で 1 時間ならびにミキサーでの混合物を孵化させなさい。
  3. 5 分のための磁石の管は慎重に削除、上澄みを廃棄場所。
  4. ビーズに冷たい完全なプルダウン洗浄バッファーの 300 μ L を追加します。15、渦部屋の温度と場所 5 分のための磁石の管は慎重に削除し、上澄みを廃棄で s。
  5. ステップ 5.4 をさらに 2 回繰り返します。
  6. ヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L のビードを再停止しなさい、氷の上を孵化させなさい。

6. 総 RNA の抽出、cDNA の統合、qPCR

  1. (ステップ 5.6) から再懸濁のビーズからの総 RNA の抽出、適切なメソッドを使用して (材料の表を参照してください)。ヌクレアーゼ フリー水を 25 μ l 添加で抽出されたトータル RNA を再懸濁します。RNA 濃度と品質 (260/280 吸光度) 分光光度計を使用して決定します。50 ng/μ L の RNA の作業在庫を準備します。
  2. トリプリケート、50 を使用して cDNA 合成を実行 (ステップ 6.1) からの総 RNA の ng (材料表参照) 適切な cDNA 合成法を用いたキット 20 μ L (表 1) の最終巻の oligo dT プライマーを使用して。表 2に記載されている条件に従って熱サイクルを実行する qPCR 測定器に、PCR チューブを負荷。
  3. 実行 (ステップ 6.2) から CDNA qPCR SYBR グリーン化学を使用して (材料の表を参照してください)。
    1. 無菌状態で 96 のよく明確な底板をトリプリケートの qPCR 反応のすべてを実行します。
    2. QPCR マスターから反応混合物の 9 μ L 分注はミックス プレートの各ウェルに (表 3参照)。その後、10 μ L の最終巻を達成するために各ウェルに cDNA の 1 μ L 密封耐熱性 PCR プレート シーラーを使用して PCR プレートを追加し、qPCR 楽器に読み込みます
    3. 表 4に記載された条件に従って熱サイクルを実行します。
    4. スクランブル コントロールの発現レベルに各サンプルの発現 (Ct 値) を正規化します。これらの値を使用して、計算式のフォールドの変更。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mirna は、ターゲット Mrna に結合して細胞過程を調節します。したがって、特定の mRNA ターゲット、miRNA の機能を理解する鍵です。ここで我々 は細胞のマイクロ Rna の mRNA ターゲットを識別するための方法を詳しく説明します。このプロトコルは、ワニブックスらから適応35プルダウンにビオチン化 miRNA LNA ベース mimics を利用の変更とは、mRNA をターゲットします。LNA によるオリゴヌクレオチドの模倣の使用変更されたリボース リング毒性36,37,38無しのより高い安定性のための標的結合の特異性が向上します。プルダウン PARP 1 mRNA 細胞 miRNA ミール 125b の対象としてこのメソッドを採用しました。神経機能39

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの同定は彼らの調節の機能を理解するため重要です。シード シーケンス補完とターゲット シーケンス19,20省に基づいてターゲットを予測するいくつかの計算ツールが用いられます。これらのツールは、貴重な彼らは偽陽性と偽陰性の高レベルを生成できます。したがって、これらの予測は、それぞれターゲット27,31miRNAs の直接結合を確認する RISC 複雑で複雑な miRNA:mRNA のプルダウンの免疫沈降などの実験方法とつながれます。ビオチン標識 miRNA を活用した実験的戦略をプルダウンする模倣このレポートの詳細は、mRNA をターゲットします。ビオチン プルダウンは、高感度と低偽陽性率35,43miRNA ターゲットを識別するために使用でき...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は金融と非金融の利害を宣言しません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この仕事は部分的 (装置) に国立衛生研究所 (NIH) の助成金 DA037779 によって支えられた DA024558、DA30896、DA033892、DA021471、AI22960、MD007586 (C.D.) に。仕事も RCMI グラント G12MD007586、ヴァンダービルト CTSA グラント UL1RR024975 によって支えられた Meharry 臨床研究センター (MeTRC) CTSA 付与 (U54 RR026140 傘下/NIH、NIMHD/NIH から U54 グラント MD007593 およびテネシー州エイズ センターから研究 (P30 AI110527)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
細胞株HEK293TATCCCRL-3216
熱不活化ウシ胎児血清 (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco'修正されたイーグル」培地 (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
トリプシン-EDTA (0.25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM 還元血清培地GIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 トランスフェクション試薬Invitrogen/Thermofisher11668-019
ビオチン化 has-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
ビオチン化スクランブルコントロールExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
ストレプトアビジン磁気ビーズPierce88816
酵母 tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA2153
塩化カリウム (KCl) 溶液Sigma-Aldrich60142
塩化マグネシウム (MgCl2)溶液Sigma-AldrichM1028
水酸化ナトリウム(NaOH)Sigma-Aldrich795429
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩(EDTA)溶液、0.5 M、pH 8.0Sigma-AldrichE7889
ジチオスレイトール(DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma-AldrichP8340
RNAse/DNAse 遊離水GIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy 抽出キットQiagen74104
iScript-Select cDNA 合成キットBiorad170-8897
qPCR プライマー Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin MagnetInvitrogen/Thermofisher12320D
細胞

References

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