Method Article

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR ポリメラーゼ連鎖反応による定量化のため。

Abstract

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マイクロ Rna (Mirna) は、post-transcriptionally 細胞の遺伝子発現を調節する小さな Rna のクラスです。3' 非翻訳領域 (UTR) にバインドする Mirna ターゲット蛋白質翻訳を阻害したり、いくつかのインスタンスで mRNA 分解を引き起こす mRNA。3' UTR マイクロ Rna の 5' 端に 2-8 塩基種子による mRNA ターゲットの miRNA のバインディング。細胞の制御分子としての Mirna の役割が確立している機能的関連性でターゲット Mrna の同定課題のままです。Bioinformatic ツールは miRNA のバインドの潜在的なターゲットとして 3' UTR Mrna の内のシーケンスを予測するために採用されています。これらのツールは、機能的な役割を予測する試みの近縁種の中でこのような配列の進化的保存を決定するため利用されています。ただし、これらの計算方法は、しばしば偽陽性の結果を生成、miRNA と mRNA の正規の相互作用を予測する制限されます。したがって、マイクロ Rna、mRNA ターゲットへの直接結合を測定実験の手順、機能的相互作用を確立する必要。本報告では、細胞の miRNA のミール 125b と 3' UTR PARP 1 mRNA の直接相互作用を検証するため機密性の高いメソッドをについて説明します。合成ビオチン miRNA を模倣された哺乳類細胞にトランスフェクション細胞ライセート ミルナ ・ mRNA 複合体ストレプトアビジン コートした磁気ビーズをおろされたプロトコルを詳しく説明します。最後に、ターゲットは qPCR ベースの戦略を使用してプル ダウン核酸複合体の mRNA の定量化を行った。

Introduction

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マイクロ Rna (Mirna) は小さなタンパク質式1を負に制御する rna。マイクロ Rna の前駆体は、ゲノム、遺伝子間領域と蛋白質のコーディングの遺伝子2,3のイントロン内にある最も頻繁の多くの地域でクラスターに存在します。Mirna の miRNA エンコーディングから pri miRNAs の転写を含む遺伝子4。Pri miRNAs はシーケンシャル処理、核最初単一の孤立した成熟 Mirna4,5を生成する細胞質にしを受けます。その後、成熟 Mirna が RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に組み込まれている: ターゲット認識4,5のための蛋白質のアルゴノート家族のメンバーを含むポリコームタンパク蛋白・ RNA 複合体 6,7。RISC の複合体の成熟 Mirna は主に 3' UTR ターゲット Mrna

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Protocol

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1. 3'-ビオチン化マイクロ Rna のトランスフェクション

注: 滅菌層流フードの内部次の手順に従います。

  1. シード 4 x 105–5 × 105 HEK 293 t 細胞あたり 2 mL でよくダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) [DMEM 10% ウシ胎児血清 (FBS) とペン連鎖球菌性抗生物質 x 1] を完了します。37 ° C、5% CO2一晩で設定インキュベーターで培養します。
  2. 次の日は、健康と光学顕微鏡の下でめっきされたセルの付着を確認します。
    注: 細胞が付着し、次のステップに進む前に適切な形態を達成したことを確認します。HEK 293 t 細胞は通常 18-24 h の transfection のため準備ができているポストめっき。
  3. 1.7 mL の滅菌および microfuge の管で最小限の必須メディアを 200 μ l 添加のビオチン標識 miRNA の 75 picomoles を希釈します。このミックスを別 1.7 mL および microfuge 管含むリポソーム ベースのトランスフェクション試薬 (8 μ L/ウェル) 最小限の重要なメディアの 200 μ L で希釈に転送します。ミックスを徹底的にでもやさしく、ピペッティングとトランスフェクション複合体の形成を許可する室温で 20-25 分間インキュベ....

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Results

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Mirna は、ターゲット Mrna に結合して細胞過程を調節します。したがって、特定の mRNA ターゲット、miRNA の機能を理解する鍵です。ここで我々 は細胞のマイクロ Rna の mRNA ターゲットを識別するための方法を詳しく説明します。このプロトコルは、ワニブックスらから適応35プルダウンにビオチン化 miRNA LNA ベース mimics を利用の変更とは、mRNA をターゲットします。LNA によるオリゴヌクレオチドの模倣の使用変更されたリボース リング毒性36,37,38無しのより高い安定性のための標的結合の特異性が向上します。プルダウン PARP 1 mRNA 細胞 miRNA ミール 125b の対象としてこのメソッドを採用しました。神経機能39

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Discussion

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携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの同定は彼らの調節の機能を理解するため重要です。シード シーケンス補完とターゲット シーケンス19,20省に基づいてターゲットを予測するいくつかの計算ツールが用いられます。これらのツールは、貴重な彼らは偽陽性と偽陰性の高レベルを生成できます。したがって、これらの予測は、それぞれターゲット27,31miRNAs の直接結合を確認する RISC 複雑で複雑な miRNA:mRNA のプルダウンの免疫沈降などの実験方法とつながれます。ビオチン標識 miRNA を活用した実験的戦略をプルダウンする模倣このレポートの詳細は、mRNA をターゲットします。ビオチン プルダウンは、高感度と低偽陽性率35,43miRNA ターゲットを識別するために使用でき.......

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Disclosures

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著者は金融と非金融の利害を宣言しません。

Acknowledgements

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この仕事は部分的 (装置) に国立衛生研究所 (NIH) の助成金 DA037779 によって支えられた DA024558、DA30896、DA033892、DA021471、AI22960、MD007586 (C.D.) に。仕事も RCMI グラント G12MD007586、ヴァンダービルト CTSA グラント UL1RR024975 によって支えられた Meharry 臨床研究センター (MeTRC) CTSA 付与 (U54 RR026140 傘下/NIH、NIMHD/NIH から U54 グラント MD007593 およびテネシー州エイズ センターから研究 (P30 AI110527)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
細胞株HEK293TATCCCRL-3216
熱不活化ウシ胎児血清 (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco'修正されたイーグル」培地 (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
トリプシン-EDTA (0.25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM 還元血清培地GIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 トランスフェクション試薬Invitrogen/Thermofisher11668-019
ビオチン化 has-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
ビオチン化スクランブルコントロールExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
ストレプトアビジン磁気ビーズPierce88816
酵母 tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA2153
塩化カリウム (KCl) 溶液Sigma-Aldrich60142
塩化マグネシウム (MgCl2)溶液Sigma-AldrichM1028
水酸化ナトリウム(NaOH)Sigma-Aldrich795429
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩(EDTA)溶液、0.5 M、pH 8.0Sigma-AldrichE7889
ジチオスレイトール(DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma-AldrichP8340
RNAse/DNAse 遊離水GIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy 抽出キットQiagen74104
iScript-Select cDNA 合成キットBiorad170-8897
qPCR プライマー Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin MagnetInvitrogen/Thermofisher12320D
細胞

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A.

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Biotin based Pulldown AssaymiRNA Target ValidationStreptavidin coated Magnetic BeadsBiotinylated miRNA MimicsLocked Nucleic Acid MimicsqPCR based QuantificationCellular Lysate PreparationmiR 125b PARP 1 InteractionNucleic Acid Pull downRNA Isolation Protocol

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