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方法論記事

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

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DOI:

10.3791/57796

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2018年7月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

この記事について

サマリー

この記事では、分光分析用洗剤可溶化 TRPV1 の生化学的な量を取得する具体的な方法について説明します。結合されたプロトコルは、膜制御環境で哺乳類のイオン チャネルの構造と機能の研究を容易にするために合わせることが生化学的な生物物理学的ツールを提供します。

要約

ポリモーダル イオン チャネルは、アロステリック変更に異なる性質の複数の刺激を変換します。これらの動的分子構造を決定し、主不明のまま挑戦しています。アゴニスト結合部位の構造的特徴といくつかのイオン チャネルの活性化機構の単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) 放出光の最近の進歩、ステージは、ゲートの動的分析の設定します。分光学的手法を用いたメカニズム。電子常磁性共鳴 (EPR) や電子二重共鳴 (鹿) などの分光学的手法は、大量に精製することができます原イオン チャネルの研究に主に制限されています。機能的で安定した膜タンパク質の大量のための要件は、これらのアプローチを使用して哺乳類のイオン チャネルの研究を妨げています。EPR と鹿は、x 線結晶構造解析または Cryoem によって入手が困難なこと、低解像度でとはいえ構造の決定とモバイル蛋白質領域の動的変更を含むとリバーシブルのゲートの監視、多くの利点を提供します。移行 (すなわち、クローズド、オープン、増感と鈍感)。ここでは、ミリグラムの機能洗剤可溶化過渡受容体潜在的な陽イオン チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) EPR と鹿分光のラベルすることができますを取得するためプロトコルを提供します。

概要

単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) の最近の進歩と哺乳類のイオン チャネルの構造は異常な率で得られています。特に、一過性受容体電位バニロイド 1 (TRPV1) などのポリモーダル イオン チャネルの構造研究を提供しているさらにその活性化機構1,2,3,の理解4,5します。 ただし、膜環境に埋め込まれたイオン チャネルに関する動的な情報はポリモーダル ゲーティングおよび薬剤結合メカニズムを理解する必要です。

電子常磁性共鳴 (EPR) と電子二重共鳴 (鹿) 分光、イオン チャンネル6,7,8,9の最も決定的な機構モデルのいくつかを提供しています。,10,11,12,13。 これらのアプローチは、原核生物の試験に主に制限されていると 3p293光イオン チャネルを細菌の高い洗剤浄化された蛋白質の多量を得られます。昆虫および哺乳類細胞の構造と機能14,15,16の真核生物の膜蛋白質の生産の発展に伴い、それは生化学的を得ることは今分光学的研究のための洗剤浄化された蛋白質の量。

EPR と鹿の信号は、タンパク質の単一システイン残基に付属する paramagneticspin ラベル (SL) (すなわちmethanethiosulfonate) から発生します。スピン ラベル 3 種類の構造情報をレポート: モーション、アクセシビリティ、および距離。この情報は、残基蛋白質の内で埋められるまたは膜または apo と配位子束縛状態13,17,18,19内の水環境にさらされているかどうかを判断できます。(すなわち、クローズド、オープン、リバーシブルのゲート遷移を監視しながら各自のネイティブ環境での動的モデルの導出のための制約のコレクションを提供する EPR と鹿のデータ (ある場合) の高分解能構造の中で、増感と鈍感)。さらに、x 線の結晶学または Cryoem で決定することは困難かもしれない柔軟な地域は、タンパク質20内の場所と同様、二次構造を割り当てるにはこれらの環境のデータ セットを使用して取得でした。脂質 nanodiscs の低温電子顕微鏡構造提供イオンのゲートに関する貴重な情報チャンネル3,21,22,23,24, 25;ただし、分光学的アプローチは、低温電子顕微鏡を使用して確認することは困難かもしれない構造の州 (例えば、温度変化) から動的な情報を提供できます。

EPR と浄化中とスピン標識後システイン残基 (特に哺乳動物チャンネルの豊富な), 低蛋白質収量タンパク質の不安定性を削除するとき、タンパク質の機能の欠如を含む鹿を実装する多くの困難を克服しなければなりません。、と洗剤やリポソームの蛋白質の集合。ここでは、これらの重要な障壁を克服し、哺乳類の感覚受容器の鹿と EPR スペクトル情報を取得するためのプロトコルを設計しています。ここでの目的は分光学的解析の式、浄化、ラベル付け、および機能最小限システイン レス ラット TRPV1 の再構成 (eTRPV1) を構築するための方法論を記述します。この方法は、それらの膜タンパク質のシステイン残基の除去にもかかわらず彼らの機能を維持することまたはシステイン二硫化物結束の形成を含む適切なです。このプロトコルのコレクションは、他の哺乳類のイオン チャンネルの分光分析の合わせることができます。

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プロトコル

1. TRPV1 の突然変異誘発

注: 分光分析26最小限 TRPV1 コンストラクトは、フルレングス システイン少ないチャネル TRPV127ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 法 (図 1) を使用してから構築されました。このシステイン レス最小限 TRPV1 コンストラクト (以下 eTRPV1) は残基 110 603 と 627-764 から成っています。eTRPV1 pMO (pcDNA3.1 ベースのベクトル) の機能解析と遺伝子組換えドナー ベクトル28 x ヒスチジン マルトース結合タンパク質 (MBP) 8 を含むクローン作成-タバコ etch ウイルス (TEV) の発現と精製 (図 2 a)。eTRPV1 単一-システインの変異体は、サイト指示された突然変異誘発を使用して生成されました。ベクトルおよびチャネル シーケンスで指定されて、補足ファイル 1: 補助メソッド。

  1. オンライン ツール29と突然変異誘発プライマーを設計します。
  2. 0.2 mL チューブ ミックス: 反応バッファー、dNTP ミックス (100 mM) 1 μ、10 μ M の前方および逆のオリゴヌクレオチド、100 ng/μ L eTRPV1 テンプレート DNA26の 1 μ L、DMSO、変異酵素の 1 μ L の 1.5 μ L 各 1 μ x 10 の 5 μ L、と 38.5 μ L の脱イオン水。たちにチューブを配置する前に混合物をスピンします。
  3. 突然変異誘発 PCR を実行します。
    1. 2 分 95 ° C で変性 (a)、(b) 20 95 ° C で変性を実行 s、10 s、および (d) 4 分 68 ° C で伸長の 60 ° c (c) アニール (30 秒・ 1 kb)。18 サイクル d 手順 b を繰り返しますし、5 分 68 ° C で伸長を実行し、さらに使用するまで 4 ° C で反応を維持します。
  4. Dpnの 2 μ L を追加私に反応する酵素混合し、37 ° C、30 分インキュベートします。
  5. 変換を実行します。
    1. 氷の上のエシェリヒア属大腸菌の有能なセルを解凍します。
    2. 予冷 14 mL の生殖不能の管に有能なセルの 75 μ L とDpnI 処理した pcr の 10 μ L を追加します。優しく混ぜます。
    3. 氷上で 30 分維持管 45 42 ° C で反応を孵化させなさい s、その後すぐに 2 分板の氷の上ルリア スープ (LB) の混合物-carbenicillin (0.2 mg/mL) の入った寒天です。37 ° C で一晩プレートを孵化させなさい
    4. プレートから、少なくとも 3 つのシングル コロニーを収穫し、それぞれ 14 mL 滅菌チューブを用いた carbenicillin (0.2 mg/mL) を含む LB の 4 mL に接種します。37 ° C で一晩文化をインキュベートし、250 rpm で振る。
    5. 8,000 × g 10 分間で一晩文化スピンダウンし、市販のミニ準備キットの指示に従って DNA を抽出します。
    6. 標準的な自動化された DNA の配列によって単一システインの変異体の存在を確認 (材料の表を参照してください)。

2. eTRPV1 と単一システインの変異体の解析

  1. HEK293 細胞ライン トランスフェクション 30
    1. よく当たり高グルコース培地 (DMEM) 2 mL 中 6 - ウェル プレートで HEK293 細胞の培養 (37 ° C、5% CO295% 湿度)。70 \u2012 80% 合流は、HEK293 細胞を準備します。
    2. 2 つの独立した 1.5 mL マイクロ遠心チューブにトランスフェクション混合物を準備します。
      1. 反応が、0.5 μ g eTRPV1 またはシステイン変異体を含む pMO を最小限必要な媒体 (例えばオプティ MEM) の 250 μ L に追加します。反応 B、最小必須培地の 250 μ L に 3 μ L のトランスフェクション試薬を追加します。各反応室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。
      2. 1 mL ピペットで反応 A と B を混ぜます。右の 45 分の混合物を孵化させなさい
    3. よく 70-80% の合流から 500 μ L の培地を削除し、500 μ L の反応混合物を追加します。Ca2 +イメージング (37 ° C、5% CO2、および湿度 95%) のために夜通しプレートを格納します。
  2. HEK293 細胞内 Ca2 +イメージング30
    1. 直径 12 mm ガラス coverslips にエタノールと水をきれいおよび 24 ウェル プレートにそれらを置きます。
    2. 各 coverslip のセンターでポリ l リジンの 75 μ L を追加し、45 分 (37 ° C、5% CO2、湿度 95%) のプレートを格納します。
    3. 3 回でリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、残りを削除する余分なポリ-l-リジンと洗って coverslips を削除します。
    4. いったん、coverslips は準備ができて、6 ウェル プレートから細胞をデタッチに進みます。
    5. メディアを取り出し、洗浄用の暖かい PBS (37 ° C) 500 μ L を追加します。
    6. PBS を取り外して、トリプシンを 500 μ l 添加 1 分間インキュベートします。
    7. 消化反応を停止し、ピペット; とミックスする暖かい文化メディア (37 ° C) 500 μ L を追加します。気泡を形成しないでください。必要な場合は、希釈より文化メディアでこの再懸濁細胞濃度を調整します。
    8. 培地 (500/ウェル μ L 最終巻) の前処理 coverslips の 250 μ L 加えて transfected HEK293 細胞 (70% 合流) の 250 μ L をシード、インキュベーター (37 ° C、5 %co2、湿度 95%) で 1-2 時間 (取付用) 落ち着いてみましょう。
    9. 一方で、0.02% プルロニック酸と 1 μ M を追加して読み込みソリューションを準備蛍光 4時リンガーのバッファーにします。ソリューションをよく混ぜます。
    10. 井戸から HEK293 文化メディアを取り出し、ローディング ソリューションを 500 μ l 添加します。1 h (37 ° C、5% CO2、湿度 95%) のための細胞を孵化させなさい。暖かいリンゲル液バッファーで 2 回蛍光 4 ロード セルを洗います。
    11. 細胞内 Ca2 +測定を実行する 10 mm のペトリ皿に (使用目的; 494 nm 励起と 506 nm 発光 X 10) 顕微鏡ステージに読み込むセルの coverslip を配置します。
    12. (例えば、10 μ M カプサイシン) それぞれの配位子を灌後蛍光強度の変化を測定市販ソフトウェアを使用して (材料の表を参照してください)。
  3. mRNA とアフリカツメガエル卵母細胞の準備30
    1. ETRPV1 とPmeと単一システインの変異体を含む pMO をリニア化私は 37 ° C で 1 時間のきれいな DNA 市販精製キットの指示に従います。
    2. 使用する線形し、T7 RNA ポリメラーゼと互換性のある市販のキットで頂いた Rna を合成する Dna を洗浄します。
    3. 市販の精製キットによるとキャップ Rna をクリーンアップします。260 nm の波長で吸光度を測定することにより RNA 量を定量化します。
    4. 転送 5 \u2012 含む ND96 溶液 20 mL、50 mL の円錐管にX. laevis卵 (市販) 10 mL (96 mM NaCl、KCl、5 mM HEPES、2 mM 1 mM MgCl2; pH 7.4) 1 mg/mL コラゲナーゼと室温 50 分 nutate
    5. 解決策が明らかになるまで、ND96 の卵母細胞を洗浄します。新鮮なコラゲナーゼを追加した確認で 30 分のステレオ顕微鏡下で卵子を振るし、外側の濾胞層 (赤い血管の光沢のある層) が存在しない場合、消化を停止ほとんど卵母細胞 (90%)。ソリューションがクリアされるまで ND96 で卵母細胞をすすいでください。
    6. ND96 プラス 1 mM CaCl2 1 h. 消化の下で卵を振るとポリスチレン 50 mL チューブに転送卵子ポリスチレン管に固執します。
    7. ND96 プラス 1 mM ゲンタマイシンの 50 μ g/mL と 50 μ g/mL のテトラサイクリンの CaCl2と補足ソリューションと卵を洗います。
      注: は、露光からテトラサイクリンを含むソリューションを保護します。
    8. 破損した膜と動物と植物極の間の明確な分離を表示せず大きな卵を選択します。卵母細胞 16 ° C でのマイクロインジェクションの前に 4 h の回復をさせる
    9. ガラス ピペットを使用 (外径: 1.11 mm、内径: 0.5、および長さ 8.8 cm) ナノリットル インジェクター システム (46 nL/秒) とステレオ顕微鏡 (2 倍) を使用して卵母細胞に eTRPV1 と単一システインの変異体からの mRNA の 1-5 ng を注入します。CaCl2と抗生物質を添加した ND96 の 16 ° C で卵母細胞を保存 (ゲンタマイシン/テトラサイクリン 1 x)。
    10. 72 時間後 2 電極電圧クランプ (TEVC) 取得システム31を用いた巨視的電流を測定します。
    11. ホウケイ酸ガラス ピペット (0.3 MΩ) を引いて、3 M の KCl でそれらを埋めます。
    12. 転送ピペットを使用して録音室で卵母細胞を置き、低速で風呂ソリューション (120 mM の NaCl、KCl、2 mM MgCl2、グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM と 10 mM HEPES ソリューション 2 mM; pH 7.4) を灌流します。
    13. そのピペット オフセットを調整するバス ソリューションの両方の電極を浸します。ゆっくりピペット電極 (ホウケイ酸ガラス ピペット。内径外径: 1.5 mm: 1.10 と長さ 10 cm) に卵母細胞膜電位の変化だけでなく、小さなインデント (2 倍)、ステレオ顕微鏡観察まで。
    14. -80 から +80 に電圧クランプ ランプを適用中モードとメジャーの巨視的電流を記録するアンプの設定を変更 1 s. 負荷で使用されるソリューションと灌流システムの mV ステップ 2.3.12 pH 7.4 (コントロール) として、pH 5 eTRPV1 動作をチェックします。

3. 蛋白質の表現の組換えバクミドとバキュロ ウイルスの生成

  1. バクミド
    1. 7.5 DH10Bacエシェリヒア属大腸菌の有能なセルの 100 μ L を変換 eTRPV1 および/または単一システインの変異体を含む組換えドナー ベクトルの ng。
    2. 900 μ L の SOC のメディアを追加 (20 mg/mL トリプトン 5 mg/mL 酵母エキス、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、および 20 mM グルコース)、6-7 h 37 ° C で、225 rpm インキュベートします。
    3. 100 μ L の混合物、およびシリアルの希薄をシード (1/10、1/100) の LB 寒天培地プレート 100 μ g/mL、40 μ g/mL、IPTG X gal を含む 7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 G/ml テトラサイクリンと 50 μ g/mL カナマイシン。37 ° C で少なくとも 48 h 用の版を孵化させなさい
    4. 青いコロニーがない関心の挿入から、直径 2 mm は、白人の植民地を選択します。ステレオの顕微鏡を使用して、白人の植民地に青い斑点があるすべてが含まれていないことを確認します。
    5. 少なくとも 3 つのシングル コロニーを収穫し、4 mL LB 培地 7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ g/mL テトラサイクリン、50 μ g/mL カナマイシンを含む 14 mL 滅菌チューブにそれらを転送します。セル一晩 (~ 16 h) 37 ° C および 250 rpm で孵化させなさい。
    6. (詳細なプロトコルの補助のファイル 1 を参照してください) 一晩文化および分離組換えバクミド DNA の 1.5 mL を取る。2 ヶ月間の 4 ° C でバクミドを格納します。
      注: DH10Bacエシェリヒア属大腸菌DNA バクミドを含んでいるグリセロールを準備します。文化の 300 μ L を取るし、50% (20% の最終的なグリセロール濃度) グリセロールの 200 μ L を追加します。さらに使用するまで-80 ° c 因数を格納します。
    7. PCR を用いた遺伝子組換えバクミドの eTRPV1 の存在を確認 (詳細なプロトコルの補助ファイル 1を参照してください)。
  2. バキュロ ウイルス
    注: この手順の 6 ウェル形式で Sf9 昆虫細胞を transfect します。すべての量とボリュームがよく当たりに基づいて与えられます。抗生物質の使用を避けてください。
    1. 昆虫細胞培地 2 mL に 1 x 106 Sf9 細胞をプレートします。少なくとも 45 分を添付します。
    2. 1 μ g の組換えバクミド DNA 昆虫細胞媒体の 100 μ l を希釈します。優しく混ぜます。
    3. 昆虫細胞媒体の 100 μ l のトランスフェクション試薬 (TR) の 6 μ L を希釈します。優しく混ぜます。
    4. DNA と TR のソリューションを組み合わせて (からのステップ 3.2.2 および 3.2.3、それぞれ)。穏やかに混合し、室温 30 分間インキュベート
    5. DNA/TR 混合物; に昆虫の細胞メディアの 0.8 mL を追加します。優しく混ぜます。
    6. Sf9 細胞から昆虫の細胞のメディアを取り出し、新鮮な培地 1 mL で 1 回洗浄します。
    7. 洗浄媒体を削除し、DNA/TR の混合物を追加 (3.2.2 \u2012 3.2.5) セルに。27 ° C (攪拌) なし 5 h でセルを孵化させなさい。
    8. トランスフェクション混合物を削除し、2 mL の 0.5% ウシ胎児血清 (FBS) を含む昆虫の細胞培に置き換えます。5 日間で 27 ° C の細胞を孵化させなさい。
      注意:メディアで空井戸を充填し、パラフィン膜の 2 つの層を持つ 6 ウェル プレートをカバーによって携帯メディアの蒸発を防ぐ。
    9. 15 mL 遠心チューブに細胞培養媒体を転送します。4 ° C で 15 分間 8,000 の x g でチューブを回すことによってウイルス ストックの最初の一節 (P1) を分離します。きれいな 15 mL 遠心チューブに上清を転送し、すぐに 4 ° C で保存
      注: は、アルミ箔の管を覆うことによって露光からウイルスを保護します。
    10. 1 x 106 Sf9 細胞/ml 2% を含む昆虫細胞培地の培養で 25 mL を入れてウイルス ストックの第 2 世代 (P2)、125 mL のフラスコに FBS (平底と出された)。25 mL 文化に P1 ウイルスの 25 μ L を追加します。
    11. 72 h の 27 ° C で文化を孵化させなさい。
    12. P2 のウイルス株を収穫するには、新しい 50 mL チューブに文化を転送し、4 ° C で 15 分間 8,000 × g で遠心分離
    13. 新しい 50 mL チューブに上清を転送し、すぐに 4 ° C で保存
      注: は、アルミ箔の管を覆うことによって露光からウイルスを保護します。最適な TRPV1 式 P2 ウイルス/sf9 に対する比を滴定する小規模な実験を行う (詳細なプロトコルの補助のファイル 1を参照してください、セクション 4 タイトル「P2 ウイルスの小規模実験」)。
    14. 大規模な蛋白質の表現、設定 1 L Sf9 細胞懸濁培養昆虫細胞培地 0.5% で 2 x 106セル/ml で 2.8 L ホウケイ酸ガラス フラスコに FBS。
    15. 1 L 文化に P2 ウイルス ストックの 1 mL を追加し、72 h 27 ° C でインキュベートします。
      注: 3 日目、細胞密度は約 1.5 2.5 x 106セル/ml にする必要があります。

4. eTRPV1 と単一システインの変異体の浄化

  1. 膜分離28
    1. 収穫 4,500 × g、4 ° C、20 分で回転で 1 L 昆虫の細胞培養 (6-9 g 程度を見込み) 細胞ペレットの重量を量る。
    2. 25 mL の氷冷バッファー A で細胞ペレットを再懸濁します (36.5 mM ショ糖、2 mM tris(2-carboxyethyl) ホスフィン (TCEP) と 50 mM; トリス pH 7.4) (1 mM フェニルメチル フッ素 (PMSF), 3 μ g/mL leupeptin, 3 μ g/mL アプロチニン プロテアーゼ阻害剤の存在下で、1 μ g/mL ペプスタチンと)。均一な懸濁液を入手して 4 ° C、20 分で回転する細胞塊の分解および。
    3. マニュアル (dounce 組織グラインダー) または高圧ホモジナイザーを使用してセルを分割します。4 ° C で 20 分間 8,000 × g で遠心分離によって細胞の残骸を削除します。
      注: は、全体の過程で分離細胞および氷のチューブを維持します。
    4. 清と 4 ° C で 30 分間 100,000 × g で遠心分離を収集します。上澄みを廃棄し、冷えたバッファー B (150 mM NaCl, 2 mM TCEP、50 mM HEPES 10% グリセロール; pH 7.4), 20 mL の総量 (4.1.2 の手順) とプロテアーゼ阻害剤を添加した膜ペレットを再懸濁します。
    5. 50 mL チューブの膜を懸濁液と液体窒素で急速凍結の分注 20 mL。さらに使用するまで-80 ° c のサンプルを格納します。
  2. タンパク質精製26,28
    1. 氷の膜の因数を解凍し、n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) チューブ (200 mM 在庫) あたりの 3 mL を加えます。4 ° C で 2 h のチューブを回転させてください。
    2. 4 ° C で 30 分間 100,000 × g のサンプルを遠心分離します。上清を収集し、きれいなウェット アミロース樹脂の 1 つの mL を追加します。4 ° C で 2 h の混合物を回転させる重力流クロマトグラフィ用カラムでタンパク ・ アミロース混合物をロードします。
      注意:樹脂洗浄中に乾燥するようにしてください。
    3. 10 回冷たいバッファー C (150 mM NaCl、10% グリセロール、50 mM HEPES、0.5 mM 0.1 μ g/mL asolectin、0.5 mM TCEP DDM; pH 7.4) のベッドのボリュームと蛋白結合アミロース樹脂を洗浄します。冷たいバッファー D (150 mM NaCl、10% グリセロール、50 mM HEPES、DDM 0.5 mM、0.1 μ g/mL asolectin, pH 7.4) の 10 ベッド ボリュームで洗ってください。
      注: 洗濯前に洗剤や脂質、窒素パージせずにバッファー D をドガします。脱ガス後、DDM と asolectin を追加します。
    4. 0.5 mL の一部分が付いている eTRPV1 蛋白質の溶出、冷たいの 5 mL まで脱バッファー D、20 mM マルトースと補われます。可能であれば、洗浄および 4 ° C で溶出を実行します。
    5. 280 nm の波長で吸光度を測定することによりタンパク質の量を定量化します。
      注: このプロトコルには、文化のリットル当たり 0.5 〜 1.0 mg が得られます。各 eTRPV1 単一システインの変異体の蛋白質収量が変わる可能性があります。EPR と鹿の実験用 4 \u2012 6 L を育てる文化。

5. eTRPV1 単一システイン Mutant Site-Directed スピン標識

  1. 遠心ろ過ユニットを使用して eTRPV1 を含む分数を集中 (カットオフ = 100 kDa) まで 2 \u2012 2.5 mg/mL (4 ° C で 2 分間 7,000 x g のサイクル) の分類のため。
  2. 高濃度のタンパク質を DMSO で 100 mM の原液からメチル (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methanethiosulfonate (MTSSL) スピン ラベルの 10 倍モル過剰 (3 回、各 30 分) を追加 (eTRPV1 モノマー: MTSSL 1:10 のモル比)17. 1 時間 30 分、4 ° C で一晩インキュベート後の RT で暗闇の中で反応を維持
    注: この手順では MBP は一晩スピンラベル孵卵中における TEV プロテアーゼを追加することによって削除でした。
  3. サイズ排除クロマトグラフィー コラムに負荷スピン標識 eTRPV1 平衡バッファー e (150 mM の NaCl、20 mM HEPES、0.5 mM DDM; pH 7.4) タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムによって制御されます。ETRPV1 テトラマーを含有する画分を収集します。
    メモ: 再構成効率を低下させるので、この手順で 10% グリセロールを含めないでください。
  4. 280 nm の波長で吸光度を測定することによりタンパク質の量を定量化します。
  5. SDS ページのゲル (ゲルの染色無料、4 \u2012 20%) を実行して、サンプルの純度を評価します。サンプルは、分光測定ソリューションまたはプロテオリポソームの準備が整いました。

6. eTRPV1 スピン標識単一システインの変異体の再構成

  1. 40 ° C で 1 時間減圧 (100 mbar) ロータリーエバポレーターを使用して asolectin の 10 mg の乾燥します。Asolectin リポソーム バッファー F (200 mM の NaCl、5 mM モップ; pH 7.4) の 1 つの mL を追加し、15 分間またはサンプルが均一になるまで混合物を超音波照射します。
  2. 2 mM の最終的な集中に DDM を追加することにより、リポソームを不安定にし、室温 30 分間インキュベート
  3. 2 mg/mL に分類された蛋白質を集中し、それを 1:5 タンパク質/脂質比 (質量:) を用いたリポソームに追加します。
    注意:スピン標識効率低下低濃度、高蛋白質を沈殿させるかもしれないので前述のタンパク質濃度を維持することが重要です。
  4. DDM 臨界ミセル濃度 (CMC) 蛋白質/リポソーム混合比を調整し、穏やかな攪拌と 4 ° C で一晩インキュベート バッファー F を追加します。
  5. ダブル バッファー F と順番に室温穏やかな攪拌と 1 h 間隔で非極性吸着剤ポリスチレン (30 mg、50 mg、80 mg) の 3 つの因数を追加して削除洗剤タンパク質/リポソーム混合物のボリューム
  6. ビーズを削除し、プロテオリポソーム混合物を遠心管に転送する列フィルター (重力流クロマトグラフィー コラム) の上に混合物をロードします。遠心分離機の 4 ° C で 1 時間 100,000 × g でサンプル上澄みを廃棄し、バッファー f. の 30 μ L でペレットを再懸濁します
    注: サンプル分光分析とアフリカツメガエル卵母細胞への注入のため準備ができています。サンプルは、同じ日に使用できない場合、フラッシュ - それら液体窒素及び凍結-80 ° C でストア
  7. プロテオリポソーム -アフリカツメガエル卵母細胞電気生理学26,32
    1. 50 を注入アフリカツメガエル卵母細胞セクション 2.2 で説明されているようにスピン標識プロテオリポソームの異なる希釈率の nL。
    2. セクション 2.3.10 で前述の注射 12 時間後 TEVC 測定を実行します。
  8. 分光学的測定と分析 (セクション 7) に進んでください。

7. 鹿や EPR 分光法

  1. ダブル電子 (鹿) の共鳴。
    1. Q バンドの周波数 (34 GHz) で動作し、33メーカー提供のソフトウェアを使用して 83 ° デッド ・ タイム無料 4 パルス シーケンスで 10 W アンプ搭載パルス EPR 分光器で鹿測定を実行します。
    2. 低温保護のため 30% (v/v) グリセロールとバッファー E (ステップ 5.5) で洗剤精製 eTRPV1 スピン標識システインの変異体の 50 μ M を補足します。
    3. 簡単な低速遠心分離 (100 x g) によって密閉された石英キャピラリー チューブとチューブの底にスピンにサンプルをロードします。
    4. サンプルを凍結する液体窒素にキャピラリー チューブを配置します。サンプルは、後測定-80 ° C でこの時点で保存できます。
    5. マイクロ波共振器に直接サンプルを置き、-83 ° 10 \u2012 の再平衡せて 20 分。
    6. 標準的な 4 パルス鹿プロトコル、(π/2) mw1 を使用してサンプルを測定-τ 1-(π) mw1-τ 1-(π) mw2-τ 2-(π) mw1-τ 2-エコー34。(Π/2) mw1 と (π) mw1 のパルスの長さは、それぞれ 10 および 20 ns と 40 (π) mw2 の ns。63 mhz 周波数分離を設定します。
      注: 自作ソフトウェア (例えばMatlab で) スピン ラベル19,35間の距離を記述するためのガウス分布の合計を想定すると一次鹿減衰データを分析できます。
  2. 連続波 (CW) EPR 分光法
    1. 製造元のソフトウェアを使用して X バンド (9.6 GHz) の分光器の RT で CW EPR 実験を実行します。
    2. 水チラー、コンソール、および電磁石電源 on にして計測器を起動します。ソフトウェアを計測器に接続、楽器調整、ウォーム アップする楽器のために少なくとも 30 分を待ちます。
    3. ステップ 5.5 に毛細管を使用して 25 μ L ガラス製毛管から 20 μ L のサンプルを読み込むし、シールとチューブの端を密封します。
    4. マイクロ波共振器にキャピラリー チューブをロードし、手動でまたは自動的にソフトウェアの自動調整機能を使用して共振器を批判的にカップルします。
    5. 標準器の条件の下で最初の微分スペクトルを収集: 100 kHz マイクロ波変調、1.6 G 磁界変調、10 mw に電子レンジ。
    6. データ解析とプレゼンテーションは、背景に対してスペクトルを修正、スペクトルを二重積分のピーク-ピーク値で割ることによって正規化します。
    7. 最初の誘導体の吸収スペクトル (ΔHo-1)36中央線幅の逆を測定によるスピン ラベル移動を決定します。

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結果

最小限のシステイン レス TRPV1 の構築 (eTRPV1) と単一システインの変異体の機能解析

分光学的研究への第一歩は、エンジニア リングおよび機能、蛋白質の生化学的な量をもたらすシステイン少ないタンパク質構造 (図 2 a) を特徴付けます。eTRPV1 は、Ca2 +イメージングおよび TEVC (図 2 b・ C) が定める機能します。また、eTRPV1 は、EPR と鹿の実験 (0.5 - Sf9 細胞の 1 リットル当たり 1 mg) の洗剤精製タンパク質の十分な量を提供します26。特定のタンパク質の地域で 1 つのシステインを導入の機能は影響しません。図 2 b...

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ディスカッション

哺乳類膜蛋白質の表現そして浄化のための現在の技術は分光学的研究14,15,16,42のための蛋白質の十分な量を取得する可能にしました。ここでは、エクスプレス、浄化、再構成、および TRPV1 の分光学的解析を実行するこれらの技術を適応しています。

プロトコルの重要なステップの間で以下の我々 に TRPV1 のトラブルシューティングを持っているものがあります、他の蛋白質を調整可能性があります。0.5 - 1 mg/mL 洗剤精製タンパク質を生成するテンプレートを生成する DNA シーケンスを変更します。昆虫の細胞培養の 6 リットル以上の成長変異体ごとに必要になるので、タンパク質の 0.5 mg/mL 未満を生成するテンプレートは挑戦しています。蛋白質必要があります集中する、スピン標識効率を高める TCEP なし 2 mg/mL ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

EPR と鹿のスペクトロ メーターへのアクセスを提供するため博士 h. Mchaourab と博士 t. ローゼンバウム フルレングスのシステイン レス TRPV1 プラスミドを提供するために非常に感謝しております。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
QuikChange Lightning サイト指向性突然変異誘発キットAgilent Technologies210519-5
2-プロパノール (イソプロパノール)フィッシャーサイエンティフィックA416
アルブミンウシ血清 (BSA)GoldBio.comA-420-10
アミロース樹脂NEBE8021L
アプロチニンGoldBio.comA-655-25
Sigma11145からのアソレクチン
Invitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 吸着剤 バイオ・ラッド152-3920
ホウケイ酸ガラスピペット (3.5'') (卵子吸光)Drummond Scientific3-000-203 G/X
ホウケイ酸ガラスピペット (卵子記録)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
カルベニシリン (二ナトリウム)GoldBio.comC-103-5
Cellfectin ReagentInvitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
ChloroformFisher ScientificC606SK
コラゲナーゼ 1型Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlucoseSigma G8270
D-(+)-マルトース一水和物フィッシャーサイエンティフィックBP684
DDM(n-ドセシル-B-D-マルトピラノシド)アナトレースD310S
高グルコース培地(ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s ミディアム)ΣD0572 
使い捨てPD-10脱塩カラムGEヘルスケア45-000-148
EGTAフィッシャーサイエンティフィックO2783
ウシ胎児血清Invitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus プラスミドDNAミニプレップキットEpoch Life Science, Inc2160250
GenCatch PCRクリーンアップキットEpoch Life Science, Inc2360050
Gentamicin SulfateLonza17-518Z
ガラスキャピラリー (25 & micro;l)VWR53432-761
ガラスフラスコ2800 mLレックスUSA4423-2XL
グリセロールフィッシャーバイオ試薬BP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESシグマ H4034
IPTG(イソプロピル-チオ-B-ガラクトシド)GoldBio.comI2481C25
カナマイシン硫酸フィッシャーサイエンティフィックBP906-5
KClフィッシャーケミカルP217
LBブロス、ミラーフィッシャーバイオ試薬BP1426
ロイペプチンヘミス硫酸GoldBio.comL-010-5
リポフェクタミン 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OフィッシャーサイエンティフィックBP214
MgSO4 7H2OフィッシャーサイエンティフィBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 キットアンビオンAM1344
MOPSフィッシャーバイオ試薬BP2936
MTSL (1-オキシル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-3-イル) メチルメタネチオスルホン酸トロントリサーチケミカルズ株式会社O873900
NaClッシャーケミカルS271
Opti-MEMライフテクノロジーズ31985-062
プスタチンAGoldBio.comP-020-5
ロン酸F-127(20%)PromoKine  CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Poly-L-lysine SolutionSigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
密閉毛細管VitroCom特注
SF-900 II SFM (昆虫細胞培地)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9細胞(SFM適応)Invitrogen Life Technologies11496-015
Soybean Polar Lipid ExtractAvanti Polar Lipids, Inc541602C
SucroseFisher ScientificS25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
Tetracyclin HydrochlorideフィッシャーサイエンティフィックBP912-100
トリスベースフィッシャーバイオ試薬BP152
プトンDifco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
アフリカ産卵母細胞NascoLM00935M
XL1 - Blue Competent Cellsアジレントテクノロジーズ株式会社200249
酵母抽出物Difco0127-01-7
エコノパッククロマトグラフィーカラムBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast GelsBio-Rad17000436
pFastBac1 Expression VectorInvitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Competent CellsInvitrogen Life Technologies10361-012
Critiseal 毛細管シーラントライカ マイクロシステム02-676-20
ABI モデル 3130XL 遺伝子分析装置Applied Biosystems4359571
トランスファーピペットフィッシュブランド13-711-9AM
Nanoject IIドラモンドサイエンティフィック3-000-204
大豆Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系パイック フィペプルトリ

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