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方法論記事

広視野蛍光顕微鏡を用いたメカノバイオロジー研究の柔らかいシリコーン基板の剛性測定

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DOI：

10.3791/57797

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2018年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical & Aerospace Engineering, Old Dominion University, 2Department of Biological Sciences, Old Dominion University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

Kilopascal 範囲内の剛性を有する基板は、生理学的に関連するマイクロ環境剛性に対する細胞の反応の研究に有用。ちょうど広視野の蛍光顕微鏡を用いた、柔らかいシリコーンのゲルのヤングは適切な球でインデントを使用して決定します。

要約

人体の軟部組織は通常 kilopascal (kPa) 範囲で剛性をあります。したがって、生体内での条件を部分的に模倣物理的な微小環境で細胞を培養用便利な基板にシリコーン ・ ハイドロゲルのフレキシブル基板を証明されています。ここでは、通常メカノバイオロジー研究用等方線形弾性基板のヤング係数を特徴付けるための単純なプロトコルを提案する.シャーレや硬いシリコンの柔らかいシリコーン基板を準備、蛍光ビーズを用いたシリコン基板の上面をコーティング、蛍光イメージング (重力) による上面をインデントするミリメートル単位球を用いたプロトコルの構成します。インデントされたシリコンの表面に蛍光顕微鏡を用いたシリコン基板のヤング率を計算する結果の画像解析にビーズ。(蛍光ビーズ) に加えて係数細胞外マトリックス蛋白質と基板の上面を結合セルめっきと牽引力顕微鏡実験を使用してその後の研究に使用する容易にシリコン基板をことができます。硬いシリコン、シャーレの代わりに柔らかいシリコーンのベースとして使用する外部ストレッチを含むメカノバイオロジー研究の使用。 にします。このプロトコルの特定の利点は、この手順で必要な主要機器である一般に利用できる多くのラボでは、広視野蛍光顕微鏡です。異なる弾性率の柔らかいシリコーン基板のヤング率を測定することによってこのプロトコルを示す.

概要

マイクロ環境の剛性は kilopascal の範囲で1ティッシュの培養皿の剛性が高いいくつかの注文の大きさとは対照的に軟組織の細胞が存在します。細胞外マトリックス蛋白質コーティング ソフト基板上のセルと初期実験を示した基板剛性が影響どのセル移動し同様、2、3の下に細胞外マトリックスに付着しています。実際には、基板の剛性は根本的に広汎性の生化学的なシグナルと同様の方法で細胞機能4を影響します。ポリアクリルアミドゲル (細胞外基質タンパク質でコーティング)、(水浸透) 細胞培養基板のメカノバイオロジー研究5として広く使用されているゲル。ポリジメチルシロキサン (PDMS)、最も一般的なシリコーン (ポリシロキサン)、広くとして使用されています硬いシリコン megapascal 範囲剛性を有するミクロン スケール製作6。さらに最近、柔らかいシリコーン基板もっと生理学的に関連する kilopascal の範囲の剛性は、メカノバイオロジー研究7,8細胞培養基板として採用されています。

原子間力顕微鏡、ストレッチ、レオロジー、およびインデントの使用球、球 microindentors9 をひっくり返した時に全てのサンプルの巨視的変形を含む、フレキシブル基板の剛性を測定するいくつかの方法が使用されています。.各テクニックには、独自の長所と短所がありますが、球とインデントはだけ広視野蛍光顕微鏡へのアクセスを必要とする特にシンプルでありながらかなり正確な方法です。金属球とインデントは前の仕事3,9,10でゲルの硬さを測定するために使用されています。基板剛性細胞運動の重要性を示した初期の作品には、ハイドロゲル基材剛性3を決定するこの方法が利用されています。最近では、共焦点顕微鏡は、エレガントな評価10で使用されています。

ここで、蛍光ビーズを結合ソフト シリコン基板を準備するためのステップ バイ ステップ プロトコルは提示 (とコラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白私)、上面にだけ位相イメージング インデント球とトップの表面を使用、蛍光イメージングは、それぞれ、そして最後には、シリコン基板のヤング率を計算する画像を解析します。この方法で準備、柔らかいシリコーン基板は、牽引力顕微鏡実験のために容易に使用できます。柔らかいシリコーンのベースとして (シャーレ) の代わりに硬いシリコンの使用外部ストレッチを用いたメカノバイオロジー研究ができます。ここで保証、起こりうる合併症を回避するために必要な実用的な考慮事項が示されています。

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プロトコル

1. 柔らかいシリコーン基板の作製

  1. A コンポーネントの B コンポーネントの 1.75 g 1.75 g を量り (A:B = 1:1) (ポリスチレン) を使用して柔らかいシリコーンのエラストマー キットからトレーの重量を量るします。
  2. A コンポーネントを計量トレイ内の B コンポーネントに追加し、適切なアプリケータのスティックを使用して 5 分間一緒にそれらをミックスします。
  3. 35 mm のペトリ皿に上記の混合物を追加します。分のカップルのためのペトリ皿で均等に混合物を許可します。
    注: シャーレの直径と柔らかいシリコーンの量の選択は柔らかいシリコーンの厚さを決定します。ここでは、厚さ約 3.5 mm になりますディスカッションセクションでエラストマーの厚さを選択することについての詳細。
  4. 空気の泡を削除に 15 分間、真空チャンバー内で、ふた付きのシリコーンの混合物でシャーレを配置します。この時間の間に 70 ° C にホット プレートを予熱します。
  5. ホット プレートでは、70 ° C に達すると、上にスライド ガラスを置く、スライド ガラスにシリコーン混合物でシャーレを置きます。シリコーンを聞かせて 30 分 70 ° C で治療。ペトリ皿を溶かす可能性がありますと、ホット プレート上で直接ポリスチレンの皿を置かないでください。

2. 柔らかいシリコーンを蛍光マイクロ ビーズの結合

  1. 深い UV 商工会議所 (185 および 254 nm の光の波長から deep UV ランプとエンクロージャ) に (明らかにペトリ皿) でなめされた柔らかいシリコーンを配置します。5 分間深い紫外線に柔らかいシリコーン サンプル (UV ランプから 5 ~ 10 cm) を公開します。
    1. シリコーンは、深い紫外線にさらされている、間 2.2 2.6、次の手順に進みます。深い紫外線照射後サンプルを取得する前に、少なくとも 5 分間深い UV 容器をドガします。
  2. 一方で、19 mg 1.5 mL 遠心チューブに 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) の重量を量り、500 μ L の脱イオン水 (DI) を追加します。軽くチューブを揺することによって、EDC を溶解します。
  3. 別 1.5 mL 遠心チューブに 11 mg Nhydroxysulfosuccinimide (スルホ-NHS) の重量を量り、DI 水の 500 μ L を追加し、チューブを優しく揺することによってスルホ NHS を解散します。単一微量遠心チューブの EDC とスルホ NHS のソリューションを結合します。
  4. この EDC/スルホ-NHS ソリューション (1 %w/v のストック濃度) と 30 μ L 0.44 μ m 径赤 (または蛍光顕微鏡で使用できるフィルター キューブに基づいて他の蛍光色) の変更されたカルボン酸蛍光ビーズを追加します。
  5. EDC/スルホ-NHS/ビーズの混合物に追加コラーゲンの 0.02 mg (ラット尾ストック濃度 0.02 M 酢酸溶液に 4 mg/mL) から約 0.02 mg/mL の濃度を取得します。
  6. 渦 EDC/NHS/ビーズ/コラーゲン私混合物に簡単にビーズが結合する前に均等に、幅広く分散されてことを確認します。
  7. ピペット 1 mL EDC/NHS/ビーズ/コラーゲンの私 (小径) の別の浅い、フラット蓋の上に置かれたパラフィルムの部分に混合物。柔らかいシリコーン表面混合物の連絡先が以下より小さいシャーレの蓋の表面に直接触れないこの混合物で柔らかいシリコーンのペトリ皿を反転します。倒立のペトリ皿を高めるためには、倒立ペトリ皿スペーサーの両側の下で 1 つまたは 2 つのスライド ガラスを使用します。
    注: は、2.7 の手順の実行方法を確認は、図 1を参照してください。
  8. アルミ箔でサンプルをカバーし、30 分間室温でインキュベートします。
  9. 柔らかいシリコーンのペトリ皿を取り外して縦置きにセット (シリコン側を)。
  10. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) が付いている柔らかいシリコーン表面を洗って皿に 2 mL の PBS (pH 7.4) を追加することによって。分のカップルのために座ってみましょう。PBS を離れて吸い出しなさい、2 mL の PBS と再度シリコーンを洗ってください。シリコーンの治療法さらに約一日をしましょう。そのため、一晩柔らかいシリコーン サンプル PBS で 37 ° C で。

3. 広視野蛍光顕微鏡を用いた球圧子押込みとシリコーン剛性の測定

  1. 柔らかいシリコーンのペトリ皿を取得し、少なくとも 1 mL の PBS シリコーン表面液体表面の下数 mm を持っているが含まれていることを確認します。
  2. 柔らかいシリコーンの 5 1 mm ジルコニウム球体球面の曲率半径をドロップ先の尖ったピンセットを使用します。液体培地に球を浸すし、シリコン層と他の球面の曲率半径の場所から少なくとも 5 圧子直径の端から離れて、それらをドロップします。
    注: 液体表面上にドロップ、球が失敗液体培地 (float) を入力する液体培地の表面張力に起因します。
  3. 基本ペトリ皿をイメージすることが可能だ、顕微鏡ステージ上柔らかいシリコーンのシャーレを配置します。
  4. 位相イメージングを用いた 10 × 対物 (乾燥 10 X など na 0.30 客観的)、検索、球圧子を焦点に持って来る。
  5. 一部の位相画像または押しつけて全体を取る、このイメージを保存します。利用可能な場合は、タイル スキャンを使用します。決めに任意の目に見える欠陥がある場合は破棄し、別圧子を置き換えます。
  6. ライブ位相イメージングの下圧子のエッジの左にパンしてフレームの左端が少なくとも ~1.5 R 圧子センターからの距離。押しつけてセンターままイメージ フレームの右端に近い右側に表示を確認します。段階の画像を撮影し、それを保存します。
  7. 顕微鏡光源を赤の蛍光チャンネルに照明に切り替えます。Xとy-球圧子の中心の下で赤の蛍光マイクロ ビーズまで (△ Z) をそのまま座標 ( x- 圧子センター内、フレームの右端近くのy位置)、フォーカスピントだけ行きます。
  8. (画像のフレームの左端) 近く決めからシリコンの最上層で、ミクロ粒子のニキビトリートメント行くピントまで 0.5 μ m のすべての z の増分のイメージで z を取る。
  9. 他球面の曲率半径のサンプルと 3.4 3.8 の手順を繰り返します。

4. シリコーンの剛性 (ヤング率) を計算します。

  1. ImageJ、線ツールをクリックを使用して押しつけて位相画像を開き、ピクセルの圧子の直径を測定します。圧子エッジ上の点のクリックしてそして把握は端に正反対のポイントにカーソルを移動し、カーソルを解放する前に ImageJ のメイン ウィンドウのステータス バーに表示されるピクセル単位の長さに注意してください。
    1. 分析をクリックして長さの単位がピクセルに設定されていることを確認 |縮尺を設定と長さの単位を確認します。
    2. 対物レンズと CCD カメラのピクセル サイズを考慮した圧子の半径 (ピクセル単位) を μ m に変換 (μ m で R = R 画素 CCD カメラ μ m ピクセル サイズ ×/対物レンズの倍率)。
  2. ファイルをクリックして、ImageJ でビーズ画像の赤のチャネル z スタックを (場合、ミクロ粒子のニキビトリートメント赤色蛍光) 開く |インポート |シーケンス画像スタック内の任意の画像を選択し、スタックを開くには[ok]をクリックします。
    注: F1 は圧子センターの下のマイクロ ビーズは、最高の可能なフォーカスと F2 はフレームの左端付近 (~1.5 R ビーズの所の地域) でのマイクロ ビーズが最高の可能なフォーカスにはフレーム番号、フレーム番号です。Z-2 つのフレームの違いは、インデントの深さ δ。
    1. ImageJ で [線] ツールを使用して、線を描くイメージで明確に定義されたビーズ。のクリックを分析 |プロファイルをプロットしながら別のフレームを選択するビーズの間で更新されたライン スキャン強度を取得するライブボタンをクリックします。フォーカスのフレームとしては、最大強度の高い値を与えるフレームを選択できます。
    2. Z スタックにフレーム間の z インクリメントは 0.5 μ m なので計算 δ として μ m でインデントの深さ = (F2 F1) × 0.5。
  3. (マイナス相手浮力の力)、重量のため圧子によってはゲルに及ぼす力を計算、インデントは (押しつけて - 液体媒体の密度の密度) × 重力加速度 × 圧子のボリュームとして F を強制します。 式Fを使用します (4/3) x = (ρ圧子- ρ媒体) x (R3) x 3.142 g Rは、圧子の半径 x ρ圧子が決め、ρ媒体の密度液体媒体の密度、 gは重力 (9.81 m/s2) 加速度。(N) でFを取得する SI 単位の右側にある [すべての数量を表現します。
  4. 変更された11ヘルツ モデル12方程式を用いたシリコンのヤング率 (E) を計算します。
    figure-protocol-1
    どこ：
    c = の後に続く; ヘルツ モデル表現を変更する補正係数
    v = (非圧縮性材料70.5 として取られる); シリコーンゲルのポアソン比
    F = 押込み力;
    R = 圧子半径;そして
    Δ = インデントの深さ。
    ペンシルバニア州のEを取得する SI 単位の右側にある [すべての数量を表現します。
    1. 3次のように補正係数cを計算します。
      figure-protocol-2
      どこ：
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4;そして
      figure-protocol-5.
      この補正因子は特に柔らかいシリコーン接着性良好ペトリ皿 (または硬いシリコン) (ここでは) それの下にある場合にのみ使用することに留意。
    2. H 追加シリコーンとシャーレの直径の量に基づく柔らかいシリコーン層の高さを計算します。または、直接位相イメージングによる吸着シリコン層の上部と下部のサーフェスの z 座標を決定して h を得る (マイナーな不純物はいずれかのサーフェスで焦点に来る)。大きい h の (h2 > Rδ)、補正係数cは 1 に近い。
  5. それぞれの圧子の 4.1 4.4 の手順を繰り返します。シリコン サンプル平均のヤング率を取得するそれぞれの圧子から得られるヤング率を平均します。

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結果

上記プロトコルを使用して、我々 35 mm ペトリ皿の柔らかいシリコーンを用意、70 ° C、30 分で硬化、蛍光マイクロ ビーズの結合 (コラーゲンと私) 上面図 1に示しますように。深紫は基板13結合最終的な蛋白質のため以前使用されています。ここで使用される養生条件、この柔らかいシリコーンに固有の (I)、(II) 圧痕計測は次の日に対して、一日のコースでさらにビットを治すため柔らかいシリコーンが期待どおりに注意してください。

シリコーン面の球状インデンテーションを特徴付けるさまざまなパラメーターは、図 2のとおりです。図 2に示すように、どちらか (私) に押しつけ...

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ディスカッション

球圧子押込み法は簡単に実装できるは、圧子の選択と柔らかいシリコーン サンプルの厚さに注意を支払わなければなりません。ヤング率の計算に使用される式が条件11の下で有効で、圧子半径の > 10% シリコン サンプルの厚さは、通常これらが満たさと < ~ 圧子半径 x 13。圧子半径は前記試料の厚さが高すぎるではない、良い選択をされた 5-10 x のシリコーンの厚さがわかった (すなわち、客観的の作動距離はならない制限) 計算される剛性も敏感ではありませんでしたし、シリコーンの厚さの正確な値。球状圧子の選択には、インデントの深さ δ が圧子半径の < 10% と同様、シリコーンの厚さの < 10% になるよう必要があります。念頭に置いてこれらの考慮点は、柔らかいと硬めのシリコーンの剛性を測定する球面の曲率半径の異なる材料と直径の両方を使用できます。インデントの深さの決定は、この議定書の最も重要なステップです。フォーカスの画像を識別するためにこのプロトコルで提案されている方法は、確実にインデントの深さを定めるため役立つはずです。また、球圧子押込み法用剛性計算が摩擦がない接触を前...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

マーガレット ・ ガルデルにありがとう寛大、レオメータの使用を許可します。我々 はこの作業を有効に NIH (1R15GM116082) からの支援を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CY 52-276 A/B シリコーン エラストマー キット ダウコーニングCY 52-276で保存
Thermo Scientific Pierce EDCFisher ScientificPI22980-20°Cで保存。C
サーモサイエンティフィック Pierce Sulfo-NHS架橋剤Fisher ScientificPI-245104°Cで保管。C
カルボキシル蛍光ピンク粒子、0.4-0.6 µm、2mLSpherotech、Inc.CFP-0558-24°Cで保管。C、
1.0 mmの酸洗浄ジルコニウムビーズOPS Diagnostics LLCBAWZ 1000-250-33
オゾン排気器付き深紫外線チャンバーNovascan Technologies, Inc.PSD-UV4、OES-1000D
広視野蛍光顕微鏡ライカマイクロシステムズDMi8
コラーゲン I、ラットテールコーニング354236ストック濃度 = 4 mg/ml; 4°Cで保存;C
ImageJ-NIHN/Aパブリックドメインソフトウェア
室温を凍結しないでください

参考文献

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