分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Bronson A. Haynes; Ryan W. Huyck; Ashley J. James; Meghan E. Carter; Omnia U. Gaafar; Marjorie Day; Avennette Pinto; Anca D. Dobrian

doi:10.3791/57804

方法論記事

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

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DOI：

10.3791/57804

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2018年7月17日

Bronson A. Haynes¹ , Ryan W. Huyck¹ , Ashley J. James¹ , Meghan E. Carter¹ , Omnia U. Gaafar¹ , Marjorie Day¹ , Avennette Pinto¹ , Anca D. Dobrian¹

¹Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

この記事について

サマリー

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウンストリームアプリケーションを説明します。

要約

肥満は脂肪細胞の肥大によって主に脂肪組織の大規模な改造を伴います。極端な脂肪細胞成長は、インスリン、ローカル低酸素症および炎症に悪い応答が返される前駆細胞から機能的な白い脂肪細胞の分化を刺激し、脂肪細胞の人口の根本的な肥大を防ぐことができるしの削減とともにその結果、脂肪代謝の健康を改善できます。炎症。また、ベージュ/ブラウンの脂肪細胞の分化を刺激しと、全身のエネルギー消費量を増やすことができる減量、その結果します。このアプローチは、肥満 2 型糖尿病と心血管疾患などの併存の開発を防ぐことができます。

本稿では、分離、拡張、および共同 CD31 と CD34 のマーカーを表現するひと脂肪組織の血管内皮細胞のサブセットから白とベージュの脂肪細胞の分化をについて説明します。メソッドは、比較的安価ですし、労働集約的ではないです。人間の脂肪組織へのアクセスを必要として皮下のデポはサンプリングに適しています。このプロトコルの新鮮な脂肪組織は、病的肥満者からサンプル [ボディマス指数 (BMI) > 35] 肥満手術の手順中に収集されます。間質血管の一部から順次 immunoseparation を使用して、十分な細胞は、脂肪の 2-3 g ほどから生成されます。これらの細胞文化 10-14 日間で拡大することがでくことができますが, 凍結保存、通路 5-6 まで継と、脂肪細胞のプロパティを保持します。細胞は、脂肪細胞の ppar γ アゴニストロシグリタゾンとヒトインスリンの組み合わせを使ってカクテルを 14 日間扱われます。

この方法は脂肪の血管内皮細胞、脂肪細胞応答を駆動する分子メカニズムに関する実験についての証明書を取得するため使用ことができますまたは、脂肪細胞を強化することができます新しい薬物をスクリーニングするため応答指示ホワイトのどちらかベージュ/ブラウン脂肪細胞分化。小さな皮下のバイオプシーを使用して、この手法を使用して肥満と併存の治療のためベージュ/茶色と白色脂肪細胞を刺激することを目的とする臨床試験のための非レスポンダー科目を画面できます。

概要

最近の証拠は、マウスとヒトでは、白またはベージュ/ブラウン脂肪¹^,²^,³に脂肪組織の血管に存在するセルのサブセットを区別できますを示しています。このような細胞の表現型の中間表現型⁴^,⁵^,⁶^、⁷のスペクトルや平滑筋/周皮細胞、血管内皮細胞を支持する証拠との論争の主題であります。この方法論の開発の範囲は、CD31 cd34 陽性 + + 肥満人間から別の脂肪質のターミナルから分離した内皮細胞の脂肪分化能をテストするためだった。文献の他の研究は、潜在的な合計の間質血管の分数または知られている脂肪細胞の前駆細胞の²^,⁸^,⁹の脂肪細胞に着目します。現在既存の技術は、薬配信¹⁰特に脂肪組織の血管内皮細胞をターゲットすることができますので、このような細胞の脂肪分化を受ける可能性を理解白またはベージュの脂肪細胞へ誘導重要です。将来の目標とされた療法。

別のグループは、ひと脂肪組織¹¹^,¹²^,¹³から血管内皮細胞を分離するサロゲートとして CD31 と CD34 マーカーの組み合わせを報告しました。通常、2 つの連続した手順と磁気ビーズを用いた正の選択を使用して分離が実行されます。本報告では、CD31 プラスチックビーズと組み合わせて CD34 陽性磁気ビーズを用いた immunoseparation に利用されました。典型的な石畳の内皮形態の保全に関して逐次磁気 immunoseparation に優れたこの手法がわかった。また、脂肪の 1-2 g ほどから始まって拡大と脂肪細胞の誘導に必要な十分な細胞を生成することができました。皮下脂肪の小さなサンプル生検は、下流用電池の必要な量を生成するのに十分です。この面は可能性のある重要な特に場合は、このメソッドは人間の脂肪分化誘導に対する反応性のスクリーニングに使用されます。

文献で報告された他のシステムとは異なり、この方法は CD31 cd34 陽性 + + 細胞の脂肪分化誘導のための 2 つの成分を利用: ppar γ アゴニスト-ロシグリタゾン — とヒトインスリンです。重要なは、インスリンの使用量は、人間¹⁴post-absorptive インスリンを循環通常/高の範囲内にあります。カクテルの誘導に対応する能力と、細胞の in vitro、Akt のリン酸化による測定のインスリンに対する反応性の程度は相関しなかった。興味深いことに、この誘導のカクテルや実験条件を使用して、白とベージュ/ブラウン細胞のミックスは、サイズと分子マーカーの発現と細胞内脂質液滴の数によって決定された得られました。(白とベージュ)、細胞の表現型の定量的評価と一緒にこの簡単かつコスト効果の高い誘導プロトコルは、差別化されたベージュのバランスを変更することができます潜在的エージェントのスクリーニング: 白色脂肪細胞です。

このメソッドは、ひと脂肪組織の血管内皮前駆細胞の脂肪細胞形成の基になるメカニズムを理解するためトランスレーショナルアプローチを提供します。この特定の分離/差別化手法を使用して、捜査官は様々な経路の細く、肥満の人間の様々な脂肪質のターミナルから血管内皮細胞のサブセットの脂肪細胞の形成を担当に問い合わせることができます。

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プロトコル

東バージニア医学校制度のレビューボード委員会承認研究および研究で使用されるひと脂肪組織サンプルのコレクション。通知の書面による同意は、患者から採取しました。

1. バッファー、メディア、および計測器の準備

Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered ソリューション (KRBBS) を準備: 塩化ナトリウム 135 ミリメートル、5 mM 塩化カリウム、硫酸マグネシウム 1 mM、0.4 mM カリウムリン酸水素、5.5 mM グルコース、1 mM アデノシン、0.01% 抗生物質/抗真菌薬ミックス (50 μ g/mL のペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンの 30 μ G/ml、アムホテリシン 15 ng/mL の 50 μ g/mL) 10 mm HEPES (pH 7.4 を =)。このソリューションは、組織の採取や消化をするたびに新鮮な準備されます。
新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製: KRBSS; で 1 mg/mL コラゲナーゼのタイプ 1、3 mL/g の脂肪を作る。事前組織消化前に水のお風呂で 37 ° C でコラゲナーゼの解決を温めます。
Cd34 陽性細胞分離バッファーを準備: 2% ウシ胎児血清 (FBS)、1 mM EDTA 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。
脂肪細胞形成メディアの準備: DMEM/F12、5 %fbs、ペニシリン/ストレプトマイシン、ヒトインスリン (5 μ G/ml または 144 mU/mL) の 1.25 μ L/mL と 2.8 mM ロシグリタゾン (1 μ M) の 0.36 μ L/mL の 50 μ g/mL。
100 mL のイソプロパノールにオロの 0.3 g を溶解することにより 0.3% オイル赤い O (オロ) 原液 (重量/体積) を準備します。

2. 脂肪間質血管の一部分離

注: 研究は、病的肥満 2 型糖尿病 (T2D) と非糖尿病患者対象、18-65 歳以上センタラ代謝で減量外科センター (センタラ医療グループ、ノーフォーク、VA) 肥満症治療手術の断面のコホートを含まれています。1 型糖尿病は、慢性的な免疫抑制療法、抗炎症薬、thiazolinendiones、アクティブなタバコの使用、慢性や急性の感染症、または歴史を必要とする条件を含む自己免疫疾患が除外基準に含まれています。悪性腫瘍の最後の 12 ヶ月以内で処理。ダグラス T2D は、空腹時血糖 126 mg/dl 以上、200 ミリグラム/dL の以上 2 h 耐糖能をテストすると、血糖値や抗糖尿病薬の使用と定義しました。

肥満手術を受ける被験者からひと大網 (OM) と皮下 (SC) 脂肪 (AT) を収集します。
組織抽出後すぐに室温でペニシリン/ストレプトマイシンの 50 μ g/mL のハンクの緩衝塩液を含む別のバイアルに OM と SC AT をしてください。
慎重にきれいにし組織抽出後、ラボに到着すると、サンプル 70% エタノール採取はさみとピンセットを使用して、組織の線維化と焼灼のセクションを削除します。
脂肪組織を圧迫し、コラゲナーゼの消化力のためのそれを 5 g (または少ない) 因数を分割します。
はさみの 2 つのペアを使用して室温でシンチレーションバイアルにコラゲナーゼ溶液の 5 mL で AT の 5 g を細かくみじん切り。
コラゲナーゼの解決の追加 10 mL を 15 mL 合計でみじん切りにした組織に追加します。
連続振動で水浴中の 37 ° C で、1 h のサンプルを消化します。
鈍い端に 20 mL の注射器に先端を削減します。
250 μ m メッシュから 9 cm × 9 cm の正方形を切り取って鈍い端の注射器を使用して 50 mL の円錐管が途中で押し込みます。
鈍い端の 20 mL シリンジと未消化の組織から脂肪細胞と血管の間質細胞を分離する 50 mL の円錐管に 250 μ m ナイロンメッシュをフィルターにサンプルを注ぐ。
注: 余分な線維化未消化材料によりメッシュが詰まって取得、50 mL コニカルチューブあたり 5 g 以上でを使用しないでください。
KRBBS 10 mL でシンチレーションのバイアルを洗浄し、残留細胞を収集するフィルターを介して注ぐ。
室温で 5 分間フィルターが適用されたサンプルをインキュベートします。
注: この手順は、フロートチューブの上部といくつか間質血管細胞の管の底に解決するために脂肪細胞を可能にすることが重要です。
20 mL シリンジと間質血管の一部のレイヤーを削除し、きれいな 50 mL の円錐管に転送分注針で 20 x 6 を利用します。
KRBBS 10 mL を追加し、室温で 5 分間ベンチに座るにサンプルを許可します。
2.12-2.14 の手順を 2 回繰り返します。
注: これらの手順が浮動の脂肪細胞と間質の血管細胞の汚染がないことを確認します。
以下の手順で説明するよう、両方の拠点、さらなる処理のため氷の上から間質血管の分数を維持します。
注: セル実行可能性に影響を与える可能性があります、1 h 以上の氷の上のセルを残してはいけない。脂肪細胞は長期保存用液体窒素でフラッシュ凍結することができます。または実験用新鮮です。

3. 脂肪組織の血管内皮細胞の分離

4 ° C で 5 分間 500 x gで間質血管の分数 (SVF) をスピンします。
遠心分離機からサンプルを外し、慎重に; 上澄みを離れて注ぐSVF セルを含むペレットを維持します。
軽く 5 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
注: AT デポの 5 g 以上が複数の因数 (ステップ 2.4 参照) に処理された場合細胞ペレットを一緒に分かち合います。
4 ° C で 5 分間 500 x gでサンプルをスピンします。
上澄みを除去、1 mL の PBS、細胞を再懸濁します、セルをカウントします。
注: ここでは、セルの自動カウンターは、セルカウントに使われました。アクリジンオレンジ/propidium ヨウ化 (AO/PI) ソリューションの 12 μ L で 12 μ L の細胞懸濁液を混合することによって得られたセル実行可能性 (材料の表を参照してください)。各デポの AT のグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 1.69 × 10⁵ ± 4.51 × 10⁴;(b) SC デポ: 10⁵ ± 6.45 x 10⁴× 1.24。両方の拠点から細胞の viability が > 90%。
4 ° C で 5 分間 500 x gでサンプルをペレットします。
注: CD34 免疫選択プロトコルは手順 3.7 – 3.15 適応されました (材料の表を参照してください)。
CD34 分離バッファーを 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。
注: 総細胞数次の再懸濁液ボリュームを必要とする: (a) < 2 x 10 の⁷セル: 100 μ L; でペレットを再懸濁します(b) 10⁸–5 × 10⁸セル × 2: 1 mL にペレットを再懸濁します。3.9-3.16 の手順で使用する試薬の量だったため縮小 < 2 x 10 の⁷セル。
CD34 カクテル 10 μ L を追加し、室温で 15 分間サンプルをインキュベートします。
磁気ビーズの 5 μ L を追加し、室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。
各サンプルに 2.5 mL の CD34 分離バッファーを追加し、室温で 5 分間、磁石にサンプルを配置します。
5 のための磁石を反転分離バッファーを注ぐ s。
磁石から、サンプルを削除、手順 3.10 と 3.11 の 4 倍を繰り返します。
磁石からチューブを削除し、2 mL の CD34 分離バッファーを追加します。
4 ° C で 5 分間 500 x gで細胞をペレットします。
CD34 分離バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。
注: ここでは、AT のグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 4.75 × 10⁴ ± 3.36 × 10⁴;(b) SC デポ: 10⁴ 9.53 × 10 ±³x 1.06。CD31 プラスチック immunobead プロトコル手順 3.16-3.34 (材料の表を参照してください) 適応されました。
500 x gで 5 分で細胞をペレットし、バッファー B 250 μ、250 μ L の洗浄バッファーでペレットを再懸濁します。
ボルテックスチューブ CD31 ビーズを徹底的に再懸濁します。
CD31 ビーズの 20 μ L を追加します。
注: [集計] セルのためカウント > 1 × 10⁶、ボリューム製造元の入力に応じて規模を縮小しました。
30 分間、室温のロッキングサンプルをインキュベートします。
ストレーナーを滅菌 50 mL の円錐管に接続します。
注: こし器の大きな開口部上にある必要があります。
細胞分離前にストレーナーを平衡に洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。[ステップ 3.16 ストレーナーに生成された混合物を適用します。
20 mL の容量の円運動で 5 mL の洗浄バッファーとストレーナーを洗浄します。コネクタを滅菌 50 mL の円錐管に接続し、ルアーロックを閉じます。
ストレーナーをコネクタに取り付けます。こし器の壁に沿って洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。こし器の壁に沿ってアクティブバッファー D の 1 mL を追加します。サンプルをゆっくり旋回し、室温で 10 分間インキュベートします。
洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。ビーズから 10 倍上下ピペッティングにより細胞を分離します。
メモ: は、空気の泡を生成しないでください。
ルアーロック-を開き、50 mL の円錐管に流入する剥離細胞を許可します。ストレーナー 10 を洗うたびに洗浄バッファーの 1 ml x。
コネクタとストレーナーを破棄し、遠心分離機の 300 × g 10 分間、4 ° C でのサンプル文化の完全な EGM 2 メディアの 2 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
注: この時点でのグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 5.92 × 10³ 4.27 × 10 ±³;(b) SC デポ: 4.12 10³ ± 2.1 x 10³x。両方の拠点からの細胞の生存率は 90 パーセント以上だった。

4. 血管内皮細胞脂肪細胞形成の誘導

37 ° C、5% CO₂インキュベーターで完全な EGM 2 メディアの 6 ウェル培養処理板の細胞を成長します。メディアを交換して、電池が 80-90% の合流点に達するまで 3-4 日おき。
注: 人口倍増は 2-3 日です。
100 mm ペトリ皿上それらをメッキすることによって細胞を展開し、1:3 回セルを分割します。この段階でセルが 2 の一節にあります。
自動細胞を用いた細胞カウンター (材料の表を参照してください) の数。
デポおよびそれらは 2 日間の EGM 2 メディアを完了で文化ごとに重複する井戸の確保 6 ウェルプレートに種子約 100-200,000 セルです。
任意の成長媒体を離れて吸い出しなさいし、2 ml の 5% を DMEM/f12 キーの交換 FBS ペニシリン/ストレプトマイシンコントロールのための 50 μ g/mL 細胞治療細胞の脂肪細胞形成メディア (手順 1.4 参照) 2 mL に置き換えると。
37 ° c 5% の加湿で細胞をインキュベート CO₂インキュベーター 13 日間のそれぞれのメディアごと 3 〜 4 日の交換します。
注: 細胞治療の 4 日後に脂質を蓄積する開始されます。
オロとナイルレッド公開メソッド¹⁵^-¹⁷によると染色を行います。
RNA 抽出のためのセルを分離するには、6 よく誘導プレートからメディアを取り出し、1 mL の滅菌 PBS で洗浄します。
Guanidium チオシアン酸-フェノール-クロロホルム溶液の 350 μ L を追加 (材料の表を参照) もそれぞれ、5-10 分間室温でインキュベートします。
細胞スクレーパーを使用してプレートから細胞をこすりし、セルを 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
注: サンプルは、RNA の抽出、さらに後日処理-80 ° C のフリーザーで格納できます。
適応の RNA 抽出を用いたサンプルから mRNA を抽出プロトコル (材料の表を参照してください)。
リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) 次のプローブを用いた遺伝子発現を評価するを実行: アディポネクチン、UCP-1、および CIDEA (材料の表を参照してください)。
注: ここでは、RT-PCR 法手続を実施した次の標準的なプロトコルを使用して: 変性 (95 ° C; 15 s)、アニーリング、および 40 のサイクルの拡張 (60 ° C; 1 分)。C_Tの値を持つ遺伝子を表すサンプル > 35 が検出されないと考えられていた。

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結果

私達のプロトコルは CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織別拠点から血管細胞の脂肪分化能を決定するためのアプローチを提供することを目的します。簡単なフローチャート図は、図 1 a

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ディスカッション

本稿の焦点は、分離、拡張および CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織内臓や皮下のデポから血管内皮細胞の脂肪分化誘導方法論を提供することです。

齧歯動物または CD31 抗体、蛍光ラベルまたは磁気ビーズ¹⁸^,に結合を使用して主にテクニックを使って人間の様々な血管ベッドから血管内皮細胞の隔離のための方法論が報告されています。¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³. これらの分離技術の普遍的な使用のための主要な課題は異なる血管ベッドで内皮細胞人口の不均一性と線維芽細胞や血管壁細胞の混入のリスクが高い。しかし、このような汚染を避けるために分離技術の改良は、報告された

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者はベッキーマルケス、センタラ肥満センター、患者スクリーニングと同意のプロセスに彼女の援助のための医療コーディネーターを認識したいです。この研究は、Anca + Dobrian に R15HL114062 によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
大型機器
バイオセーフティキャビネット	Nuaire	nu-425-400
細胞培養インキュベーター	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
ウォーターバス	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
電気泳動ボックス	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini トランスブロットセル
電気泳動電源	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
ブロットリーダー	LI-COR	Odyssey	近赤外線
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ	5810 R
卓上遠心分離機	エッペンドルフ	MiniSpin Plus
蛍光顕微鏡	オリンパス	BX50
倒立顕微鏡	ニコン	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	792519
塩化カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	C7902
リン酸カリウム一塩基	Sigma-Aldrich	P5655
硫酸マグネシウム	Sigma-Aldrich	M2643
塩化ナトリウム <	p>Sigma-Aldrich	746398
リン酸ナトリウム一塩基性一水和物	Sigma-Aldrich	S9638
カリウム塩化物	Sigma-Aldrich	P9333
グルコース	Acros Organics	410950010
アデノシン	Acros Organics	164040250
ウシ血清アルブミン	GEヘルスケアバイオサイエンス	SH30574.02
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15070063
Tissue Digestion
20 mL シリンジ	Global Medical	67-2020
ナイロンメッシュ、250 & マイクロ;m	Sefar	03-250/50
ピペッティングニードル	Popper	7934
Fine Science Tools	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	ジョージ・ティーマン &Co	160-20 <
p>コラゲナーゼ、I型	ワージントン生化学	LS004196
ペトリ皿、100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC処理
エッペンドルフチューブ、 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
セロメーター生存率染色	Nexcelom	CS2-0106-5mL	アクリジンオレンジ/プロピッドヨウ素 (Ium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySepマグネット	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 プラスチックビーズ	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x ウォッシュバッファー	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelectコネクタリング	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S 細胞ストレーナー	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-ウェルチャンバースライド	Corning Life Sciences	354559	フィブロネクチンコーティング
4ウェルチャンバースライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	154526PK	コーティングされていないガラス
ヒト脂肪微小血管内皮細胞(HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 基礎培地	Thermo-Fisher Scientific	11320082
ウシ胎児血清(FBS)	ロッキーマウンテンバイオロジカルズ	FBS-BBT
インスリン	リリー	U-100	ヒューマログ
ロシグリタゾン	シグマ-アルドリッチ	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96ウェルPCRプレート	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR ポリメラーゼ	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot Start、PCR バッファー N
塩化マグネシウム溶液	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	PCR 反応で 3 mM の最終値
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	キット
ビスアクリルアミド	BIO-RAD	1610146	40% ストック溶液
過硫酸アンモニウム	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
グリシン	BIO-RAD	1610718
Dodecal 硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	フィッシャーサイエンティフィック	S311-100
ブロモフェノールブルー	シグマ-アルドリッチ	B8026
ブロットメンブレン	EMDミリポア	IPFL00010
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A452-SK4
Odyssey ブロッキングバッファー、トリス	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	マウスモノクローナル
Anti-pAKT antibody	細胞シグナル技術	9271S	ウサギポリクローナル
抗UCP1抗体	Abcam	ab10983	ウサギポリクローナル
抗マウスIgG抗体	LI-COR	926-68070	ヤギポリクローナル、IRDye 680RD
抗ウサギIgG抗体	LI-COR	926-32211	<>p ヤギポリクローナル、IRDye 800CW
抗ウサギIgG抗体	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	ヤギポリクローナル、 TRITC
リン酸緩衝液生理食塩水	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% ホルムアルデヒド溶液	Electron Microscopy Sciences	15686	細胞固定用 4%溶液
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% ブロッキング溶液
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% 透過処理液
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
カルセイン AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI 標識アセチル化LDL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L3484

参考文献

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