ラット皮質運動野の微小電極注入による機能的障害を評価するためにテスト行動の齧歯動物

サマリー

我々 はラットの運動皮質の微小電極注入が即時かつ持続的な運動障害を引き起こすことを示しています。方法が提案電極注入手術と罰金または総モーター機能の運動野への注入による損傷のための潜在的な変化を明らかにする 3 つの齧歯動物行動タスク概要本。

要約

脳に移植医療機器は、大きな可能性を保持します。脳機械インターフェース (BMI) システムの一環として、皮質内微小電極は個人や小グループのニューロンの活動電位を記録する機能を示しています。そのような記録された信号は、患者とのインタ フェースを可能にするまたはコンピューター ロボット手足の手足を制御する正常に使用されています。ただし、以前の動物研究では、脳内電極注入だけでなく周囲の組織を損傷、障害にもつながるを示しています。ここでは、一連の次の皮質内微小電極の注入ラットの大脳皮質に潜在的な運動障害を定量化する行動テストをについて説明します。オープン フィールド グリッド、はしご交差グリップ強度テストのメソッドでは、電極の注入から生じる潜在的な合併症に関する貴重な情報を提供します。行動実験の結果は、エンドポイントの組織学、病理学的成果と隣接する組織にこの手順の影響に関する追加情報を提供するのに関連付けられます。

概要

皮質内微小電極は、脳の回路をマップし、機能出力¹を生成する使用ことができるモーターの意図の検出を有効にするための貴重なツールに発展したに使用されていた。検出された機能の出力がコンピューターのカーソル^2,3やロボット制御脊髄損傷、脳性麻痺、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、または他の動きが制限された条件で苦しんでいる個人を提供できます。腕を^4,5,6、または自分の障害のある上肢⁷に機能を復元します。したがって、皮質内微小電極技術は有望なフィールド⁸急速に浮上しました。

中での成功のため臨床研究は改善し、BMI 技術^5,9,10の可能性を理解する進行中が。脳のニューロンとの通信の完全な可能性を実現することで、再生アプリケーションは無限⁸として認識されます。皮質内微小電極技術の将来の偉大な楽観が、またよく知られている電極が¹¹、次の注入急性アミロイド応答に起因を最終的に失敗することです。脳における異物の注入は、周囲の組織への直接的被害の結果し、インプラント¹²のプロパティに応じて異なりますアミロイドの応答によって引き起こされるそれ以上の損傷に 。さらに、頭脳のインプラントは、microlesion 効果を引き起こす可能性が: グルコース代謝の減少は急性肺水腫とデバイス挿入¹³による出血によって引き起こされると考えられています。さらに、信号品質と有用な信号を記録できる時間の長さに関係なく、動物モデル^11,14,,1516一貫性がないです。いくつかの研究は、neuroinflammation と電極性能^17,18,19の間の接続を示しています。したがって、社会のコンセンサスが、電極を囲む神経組織の炎症反応が少なくとも部分的に、電極の信頼性を妥協します。

多くの研究が, 局所炎症^11,20,21,22または挿入^11,23,による脳へのダメージを軽減する方法を模索^24,25日時間^14,26記録の性能改善を目標とします。さらに、ラットの運動皮質の微小電極挿入による医原性損傷が即時および不変の微細運動障害²⁷を引き起こすことを最近示しました。したがって、ここに示すプロトコルの目的は移植と皮質内のデバイスの永続的な存在の脳外傷の結果として可能な限りの運動障害を評価するために定量化の研究を与える、(の電極、この原稿の場合)。ここで説明した動作テストは両方の総体および良いモーター機能障害を引き出すように設計された、脳損傷の多くのモデルで使用することができます。これらのメソッドは、簡単で、再現し、齧歯動物モデルで簡単に実装することができます。さらに、紹介した方法、組織成果にモータ挙動の相関まで最近、著者を見ていない利点が bmi 値フィールドに公開できます。最後に、これらのメソッドは、微細運動機能²⁸、²⁹総運動機能とストレスや不安行動^29,30をテストする設計されていた、ここに提示されたメソッドも実装できますに、様々 な研究者がアウト (または) を支配する頭部外傷モデル運動機能欠損。

プロトコル

すべてのプロシージャと動物ケアの実践された承認、ルイ ストークス クリーブランド部のベテラン事務センター機関動物医療および使用委員会に従って実行されます。

メモ: コントロールとして刺す傷害モデルの使用に関する決定についての研究者を教育するには、勧め陶工らによって行われた作業を確認するには²¹。

1. 電極注入手術

1. 動物の術前準備
   1. イソフルラン (2-4%) を用いた誘導室で動物を麻酔します。麻酔、動物の心拍数、血中酸素濃度を監視する重要な測定システムを使用して継続的に監視します。
   2. 動物を麻酔を継続する鼻の円錐形に移動します。皮下 (SQ) セファロスポリン系抗生物質、例えばセファゾリン (25 mg/kg) と非ステロイド系抗炎症、感染症を防ぎ、痛みをそれぞれ管理する例えばカルプロフェン (5 mg/kg) を注入します。
   3. 乾燥を防ぐために動物の目に眼軟膏を寛大に適用されます。
   4. 小さな動物爪切りを使用すると、動物の創傷治癒過程における縫合糸に傷を防ぐために足指の爪をトリミングします。その爪クリップされていない小さすぎ、これは動物のため出血や痛みにつながる可能性を確認します。
   5. 電気かみそりトリマーを使用して目の間に耳の後ろから徹底的に動物の頭を剃る。
   6. 切開部の動物の頭の上部にブピバカイン (原液から希釈 0.125% ブピバカインの 0.3 mL) の SQ の注入のローカル麻酔を提供します。
   7. 動物を手術中に移動から頭を保つために耳バーを使用して、固定フレームにマウントします。動物の内部温度を維持するために動物の下にパッドを加熱循環水を配置します。
   8. 滅菌ドレープなど制度的承認滅菌ラップ、手術野を分離するを適用します。
   9. スクラブ交互 betadine ソリューションを使用して外科領域とイソプロパノール スクラブ。
   10. 動物が手術の平面の下でことを確認する機関のプロトコルに従ってつま先ピンチを実行します。
2. 注入用動物を準備します。
   1. 正中線番 10 メス刃を使用して頭蓋骨を公開するダウンの約 1 の切開を作成します。ぶっきらぼう、綿棒を使用して骨膜を削除し、出血、ガーゼのパッドの使用を停止します。ワニ口クリップを使用して周囲の組織を撤回し、きれい過酸化水素と頭蓋骨を脱水します。
   2. 後の手順で接着歯科用セメントを改善するために露出の頭蓋骨にシアノアクリ レート系組織接着剤を数滴を配置します。
   3. 選ばれた半球で前足の動き約 3 mm の正中線と前の前方 2 mm 外側に骨の中のニックネームを作成することによって対応する運動野の領域をマークします。
   4. 1.75 mm の丸みを帯びた先端歯科用ドリルを使用して、余りにすぐにまたは余りに深く、ドリルダウンしていない特別な考慮と脳定位固定装置のフレームに 1 つの手を支持の頭蓋骨の一部を削除します。ドリルは、³¹の過熱を避けるために断続的に頭蓋骨に適用必要があります。
   5. 高級フック 45 ° 硬ピックを使用して硬膜を反映してください。
   6. 綿棒、生理食塩水、脳の表面に直接タッチする世話を使用して、出血をきれい。
3. 運動皮質の微小電極の挿入
   1. 慎重にバンプ電極のシャンクしないように注意を取って脳定位固定装置のフレームにユニバーサル ホルダーで滅菌電極をマウントします。ホルダー主催しっかりパッチアンプ用アダプター インターフェイス コネクタ電極のことを確認します。
      注: ここでは、2 mm x 123 μ x 15 μ m の測定非機能的なミシガン州スタイル シリコン シャンク電極を使用した、シャンクは微細鉗子を使用して挿入されました。
   2. オープン開頭に電極の先端を置きます脳定位固定装置のフレームのマニピュレーターを使用して、慎重に。
   3. 測定ガイドとしてマニピュレーターを使用して脳に約 2 mm の電極をゆっくりと下ろします (電極の選択は、によって制御された速度で自動挿入が必要)。可能な限り、目に見える血管を避けるために注意してください。電極は、場所には、慎重にユニバーサル ホルダーからコネクタを外します、挿入腕を撤回します。
   4. 慎重にきれいに綿棒と生理食塩水を用いた電極周りから任意の出血します。
   5. シリコーン ・ エラストマーを用いた注入電極周り開頭術を封印します。
   6. 歯科用セメントを使用して頭蓋骨に電極を修正します。
   7. セメントが完全に乾燥しては、前面と背面セメント headcap と縫合してシャット ダウンに切開部の端を一緒に持参しています。
4. 手術後のケア
   1. そのバイタル サインを監視しながらパッドを加熱循環水で回復する動物を許可します。ランプの温度はコントロールが難しく、動物がオーバーヒート、熱ランプを使用しないでください。
   2. 動物は完全に目を覚まし、一度は、食料や水に簡単にアクセスと清潔なケージに動物を移動します。
   3. 術後 1-3 日の間に平方セファロスポリン系抗生物質 (25 mg/kg) と感染症を防ぎ、彼らの痛みを管理する非ステロイド性抗炎症 (5 mg/kg) と動物を提供します。
   4. 痛みや不快感、出血、体重変化、または少なくとも術後 5 日目から縫合問題の兆候を毎日動物を監視します。

2. 行動テスト

1. すべて動作テスト、テスト 2 の動物テスト電極注入手術の手術前の基準スコアを計算する前に週に 1 回。手術の後、テストごとに週 2 x をテストして動作を開始する前に 1 週間の残りの部分に動物を許可します。前と手術後、ストレスが不安の測定される可能性がありますパフォーマンスに及ぼす影響を最小限に抑えるためのテストの研究を通じて使用される一貫性のあるテスト条件。
   1. 初めに塩素ガスによる滅菌剤各動物の前後各テスト セッションのすべてのテスト装置をクリーニングします。
   2. 映画オープン フィールド グリッドとラダーのテストします。これらのテストは、ビデオカメラ (1080 p, 15 fps、ビューの 78 ° 斜めフィールドの最小値) を必要とするラップトップ、およびビデオのデータを格納する部屋。
   3. 各試験日の初めには、テストの部屋に動物を持って来るとテストを開始する前に、少なくとも 20 分間順応させることができます。部屋は光と温度制御をする必要があります、同じ人員をすべてのテスト完了する必要があります。理想的には、同じ部屋は部屋を変更せずにテストのコース全体ですべての動物のために適用されます。
   4. ラダー トレーニング、特に中に、タスクを完了する動物を奨励する使用食糧報酬。穀物やバナナチップやクラッカーの小片は、良い報酬を確認します。
   5. それぞれの個々 の動物 (式 1) の手術前のスコアにすべての週テスト公演を正規化します。
      式 1:
2. フィールド グリッド テストを開く
   注: オープン フィールド グリッド試験は社内に建てられ、約 40 cm 高不透明なそで壁付け 1 m²の実行している表面があります。走行面グリッドの下部は、テープ (図 1A) を使用して下側から等しい正方形 9 に分かれています。カメラの記録は、足場にグリッドの中心の上永久にマウントされます。
   1. オープン フィールド グリッドのテストを開始するには、テスターから離れて直面してグリッドの中心に動物を配置します。
   2. ビデオを記録しながら自由に 3 分間実行する動物を許可します。
   3. 動物のテストが完了すると、グリッドから削除して、動物とケージに戻ります。塩素ガスによる滅菌を徹底的にグリッドをクリーンアップします。
   4. それぞれの動物 1 のテスト テスト初日あたりの倍。
   5. ビデオのトラッキング ソフトウェアを使用して総運動機能の指標として動物の最大速度、総距離目盛線の交差の数を分析します。
      注: ここに示すデータは手動で訓練を受けた研究者が定量化されたが、最近開発された社内を使用することが好ましいアルゴリズム³²を追跡します。
3. ラダーのテスト
   注: はしごテストは社内に建てられ、2 アクリル クリア側壁、長さ、直径 3 mm 段間隔 2 cm 離れて (図 2A) によって接続されている各 1 m で構成されています。はしごテスト熟練したテストは、したがって手術前基準スコアを記録する前に訓練の 1 週間が必要です。訓練のためのプロトコルと同じです。
   1. ラダーのテストを開始する一時的な清潔保持ケージに動物を移動します。
   2. 2 ケージをブリッジするように梯子をセットアップします。きれいなケージにかかっている梯子の始点と終点が実行を完了する動機として機能する動物の家のケージにかかっています。
   3. はしごの中央に三脚の同じ (または類似の) カメラを配置します。カメラの位置がラングの高さで、見られるように全体のはしごできます。
   4. 実行するビデオ カメラ、最初のラングに触れる彼らの前部足をできるように、はしごのスタート ・ ラインに動物を保持します。
   5. 自分のペースではしごを横断する動物を許可します。動物の前足に触れる最初のラング ラングは最後に 3 分でフィニッシュ ラインを横断する動物の時間を決定する瞬間までの経過時間。
   6. 動物の梯子の上回る 20 の期間は移動しませんか s、実行に失敗したと動物をご検討ください。ペナルティ スコアを実行失敗ごとに動物を割り当てます。手術前検査²⁷の間に記録された最も遅いパフォーマンスのペナルティ時間を決定します。
   7. 5 はしごを横断する各動物の許可それぞれの実行の間に約 1 分残りのテストあたり x。
   8. 微細運動機能の指標として 1 日あたり最速 3 実行を平均します。さらに、ビデオのトラッキング ソフトウェアを使用して段に伝票・足前面の各回数を記録します。
      注: ここに示すデータは手動で訓練を受けた研究者が定量化されたが、ドナらを使用して最近開発された社内追跡アルゴリズムを使用することが好ましい³²。
4. グリップ強度試験
   1. 各テストのセッションの前にグリップ強度メーターを調整し、グラムの強さを測定します。
   2. カウンターの端に床わたって延長グリップ ハンドルバーとグリップ強度メーターを配置します。
   3. (図 3A) の尾の根元で動物を押しながら、両方の前足でハンドルをつかむには、動物を許可します。
   4. 動物が各足でしっかりしたグリップと、ゆっくりと着実な力で尾の根元でメーターから動物を引き出します。
   5. グリップ強度計による出力デジタルに表示される動物によって出される最大握力を記録します。
   6. それぞれの動物 3 をテスト各テストの間に約 2 分間の休息のテストあたり x。
   7. 微細運動機能の指標として記録し、3 回の試行のそれぞれから出力最大握力の平均します。

3. 後行動プロトコル

1. ケタミン (160 mg/kg) を使用して深く動物を麻酔すべて行動実験 (例えば移植後 8-16 週間)、後、キシラジン (20 mg/kg)、transcardially それらを灌流、頭脳とクライオ スライスを収穫、それら組織を染色免疫組織化学的マーカーを使用して、注入^{33,34,35,36,37,38}のサイトの周りの細胞応答を定量化します。

4. 統計解析

注: 将来電力解析は特定の研究の質問に答えるしようとすると、任意の研究を強くお勧め。力の分析は、特定の研究デザインの統計的有意性を達成するために必要な動物の数を通知するは、特定研究仮説、実験、推定効果サイズの可変性の設計に基づく必要があります。目的のトリートメントは、臨床的または科学的な妥当性を達成するために必要な効果のサイズも。

1. 一般的な統計ソフトウェアを使用して統計分析を行います。
2. 記述統計を集計し、平均 ± 標準誤差として表示します。
3. 2 標本の t 検定を使用してグループ対注入コントロールを比較する各週の時点でオープン フィールド グリッド (手順 2.2)、はしご (ステップ 2.3)、およびグリップ強度試験 (ステップ 2.4)] [行動のパフォーマンスを分析します。各週時点の独立した基準を検討してください。
4. 混合効果線形モデルを使用して縦のパフォーマンスを定量化します。週およびグループの要因は固定、実験動物は、ランダムな効果としてグループ内で入れ子になっています。分散分析 (ANOVA) は、 p < 0.05 の有意水準と効果因子を決定するために使用されます。
5. 線形回帰分析を使用して immunoglobin G (IgG) 強度とはしごパフォーマンスを比較します。によるピアソンの相関係数を計算します。

結果

ここで紹介する方法を使って、運動皮質の微小電極注入手術は完了次確立された手順^39,40,41,42, オープン フィールド グリッド テストが続く総運動機能とはしごとグリップを評価する良いモーターを評価するテストの強さは²⁷を機能します。運動機能テストは完了した 2 週 16 週コントロールとしてない手術非移植動物と注入の動物の手術後の x。手術後のすべてのスコアは、週平均され、それぞれ個々 の動物の手術前の基準スコアを正規化します。すべてのエラーは、平均 (SEM) の標準エラーとして報告されます。

総体モーター機能測定、ストレス行動するには、動物は...

ディスカッション

ここで説明されているプロトコルは、齧歯動物の脳損傷モデルにおける罰金と粗大運動障害を効果的に再現性をもって測定に使用されています。さらに、運動皮質の微小電極注入の組織学的転帰に細かい運動行動の相関が可能です。メソッドは、従うことは簡単、安価で、設定して、研究者の個々 のニーズに合わせて変更することができます。さらに、動作テストを発生させない大きなストレスや痛み動物;むしろ、研究者は、動物が運動とテストに付属している報酬を気に入っていたと考えています。以前の研究では、モーター、メモリ、および機能障害^44,45大脳皮質運動野の損傷を引き起こす可能性を示唆しています。ただし、この知識は、にもかかわらず、患者の予後に悪影響がある運動野²⁷に、電極の注入によって引き起こされる機能影響の限られた情報があります。

プロトコル、手術の手順と動作テストの両方で変更することができます。このプロトコルは、前足に影響を与える領域で動物の運動皮...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Sprague Dawley rats, male, 201-225g	Charles River	CD
Compac5 麻酔システム	Vetequip	901812
電動トリマー	Wahl	9918-6171
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	1760
Gaymar 温水パッドとポンプ	Braintree Scientific Inc	TP-700
Vetbond 組織接着剤	3M	07-805-5031
デンタルドリル	ピアソン デンタル	O60-0045
デュラピック	ファインサイエンスツール	10064-14
シリコンシャンク マイクロ電極	クリーブランド VA メディカルセンターで社内製	N/A
KwikCast シリコンエラストマー	ワールドプレシジョンツ	KWIK-CAST
ティーツ歯科用セメント	A-M Systems	525000
Webcam HD Pro c920	Logitec	960-000764
握力計	Harvard Apparatus	565084
Minitab 17 統計ソフトウェア	Minitab Inc
オープンフィールドグリッドテスト	ケースで社内製 ウェスタンリザーブ大学	N/A
ラダーテスト	ケースで社内製Western Reserve University	N/A
ウサギ抗ラットIgG抗体	Bio-Rad	618501