高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

サマリー

このプロトコルはマウスで信頼性の高い HFS メソッドを設定する方法を示しています。を通じて海馬歯状回の神経細胞は、HFS を直接および間接的に生体内で電気刺激します。神経活動と分子シグナリング、 c-fosと notch1 遺伝子の免疫蛍光染色でそれぞれチェックします。神経新生は、アッセイをラベリング ブロモデオキシウリジンによる定量化されます。

要約

電気高周波刺激 (HFS)、さまざまな脳領域をターゲット注入電極を使用しては、様々 な神経疾患、精神疾患の効果的な治療法として実証されています。深部脳刺激療法 (DBS) とも呼ばれます、脳の深部で HFS 臨床試験でますます重要になってきた。高周波 (HF DBS) 外科領域の最近の進歩は大鬱病障害 (MDD)、強迫性障害 (OCD) の治療など、その他の状況にこの侵襲的手法の利用可能性を普及し始めているので上。

これらの拡大の徴候にもかかわらず HF DBS の有益な効果のメカニズムに残る謎。この問題に対処するため 1 つのアプローチはまばら HFS によってニューロンの分散のサブポピュレーションをアクティブに注入電極を使用します。それは、診療所における難治てんかんの治療のため、視床の前核の HFS がされる可能性がありますが報告されています。基になるメカニズムは増加神経新生に関連するかもしれない、神経活動を変更します。したがって、HFS 治療前後 (DG) のマウスの海馬歯状回における神経新生と同様に、神経活動の検出による生理学的変化を探究することに興味を持っております。

本稿では、直接または間接的、急性または慢性的にマウスで DG の活性化をターゲットに HFS のための方法論について述べる.さらに、述べるは、 c-fosと notch1 遺伝子の神経の活動を監視する染色とシグナル伝達活性化蛍光ブロモデオキシウリジン (BrdU) を決定するためにラベル付け、脳スライスの準備のための詳しいプロトコル、HF DBS 誘導後の新生。HF DBS 治療後神経活動と神経の活性化は、神経生物学の直接証拠と潜在的な治療上の利点を提供します。特に、この方法論を変更し、大脳基底核などの他の興味がある頭脳領域とクリニック特定の脳障害に対する視床領域をターゲットに適用できます。

概要

HF DBS は、1870 年代¹から培われた脳の電気刺激のため脳神経外科技術です。1980 年代後半に HFS がパーキンソン病の潜在的な治療的介入として使用された最初と他の運動障害²。過去数十年で、HF DBS 使用されていますより広く現在治療である脳疾患の治療に従来の治療方針で。特に、HFS 電極、非常に効果的な成果、最小限の副作用の精度向上のため、HF DBS によって扱われる脳疾患の大幅増えている過去数十年^{3,4、 5}。HF DBS をパーキンソン病 (PD)、アルツハイマー型痴呆、本態性振戦、運動疾患^2,6、の他の種類の治療のため米国食品医薬品局 (FDA) によって承認されているなど⁷。 ドーパミン作動性薬の削減 PD 患者における HF DBS⁸時 50% まで。運動障害の治療に加えて HF DBS はも^2,9,として認知増強のため診療所で精神疾患の治療に強力な効果を示しています。^10,11. HFS の他の精神疾患の治療のための研究は、さまざまな段階、患者¹²に多くの約束を提供することに注意してください。

多くの研究は焦点の HFS が脳¹³全体のローカルとリモートの両方の効果を持っていることを示している、とらえどころのない^2,14のまま効果の神経学的および分子のメカニズムです。診療所で治療 HF DBS は、通常のパーキンソン病と慢性の痛みなど多くの意見がどの 1 つの可能性の間での HF DBS 治療によって生成される改善を説明する発生の治療のため長期的な方法で適用されます。現在の HFS は、変調注入の HFS 電極近傍における軸索の反復的な脱分極によって神経ネットワークの活動をおそらく。また、HF DBS は、出力ニューロンと投影のターゲットの吐出量を変更可能性があります。また、HF DBS をつながる可能性があります長期的なシナプスの変化によって、長期増強 (LTP) や長期抑圧 (LTD) などに症状の改善に貢献するかもしれない。ところ、それはまだ不明かどうか HFS influences 携帯を調節する分子のキーイベント処理など成体脳ニューロン新生の生体として。研究のいくつかの行は、齧歯動物の HFS が臨床的に応用の DBS^15,16のと同様の神経応答を模倣可能性がありますを示しています。本研究では、HF DBS の基になる細胞メカニズムを理解するには、我々 最初にセットアップを生体内でHFS 方法論マウスで急性 (1 日) または慢性 (5 日間) さま。第二に、我々 は HF DBS 出産後神経と神経活動の変化を決定する化分析の方法論を設定します。

神経幹細胞から神経細胞の生産が萌芽期の開発の間に豊かなが、大人の生活の中で続けていることを考える、海馬顆粒ゾーンは細胞新生が発生する主要な領域の 1 つです。神経新生のプロセスは、多くの生理学的および病理学的要因の影響を受けます。特定のてんかんの場合は、海馬の神経新生は劇的に減少した^17,18です。さらに、単一電気けいれん療法は、¹⁹海馬歯状回の神経細胞の生産を大幅に向上する可能性があります。電気生理学的活動が成体と海馬ニューロンのシナプス可塑性の調節に重要な役割を果たしていることが示唆されました。したがって、神経活動と神経新生に及ぼす HF DBS をさらに示すためには、まず実施から生じる短期的な神経活動のよく知られているマーカーは、即時初期遺伝子 (IEG) fosの免疫染色法²⁰をが発生します。Notch1 遺伝子のシグナルが検出された HFS 配信^21,22後シグナル伝達活性をモニターします。さらに、我々 は、BrdU 染色することもできます gliogenesis のマーカーが様々 な方法で HF DBS 誘導後分析をラベリング BrdU による神経の生産も検出します。

本研究では 2 つの HFS 方法は直接および間接的に海馬 DG の活性化をターゲットに適応されます。電極は DG に直接注入または DG の神経細胞をアクティブにする予測を送信内側貫通パス (PP) に移植しています。HF DBS 誘導プログラム可能な刺激は、マウスの頭の上に固定電極を連続刺激を介して提示されます。HFS の神経細胞の活性化と神経新生に及ぼす影響を決定する免疫蛍光染色と海馬 DG 地域における BrdU 組み込まれて肯定的なニューロン数c-fosと notch1 遺伝子の発現を検出後,HFS の治療。特に、HF DBS の DG における神経新生に及ぼす影響比較されます急性と慢性刺激方法または直接および間接的な刺激方法間それぞれ。

プロトコル

動物実験手順、北京基礎医科学研究所 (中国・北京) のケアと実験動物の使用のための中国の政府の規制機関のガイドラインに従った。マウス (成人男性、26 〜 30 g) が収容され、12 h 光/12-h 暗いサイクル (7:00 に点灯)、下水と食品広告自由との 23 ° C の一定温度で保管します。光のサイクル中にすべての実験プロシージャを行った。

1. 手術の準備

注: カスタム電極だったハルパーンのレポート²³から変更メソッドを使用して自家製。

1. 並列バイポーラ電極として 2 マイクロ-銅線 (外径 200 μ m) を使用します。電極刺激用円筒電極を形成するためにお互いの周りをラップします。
   注: ここでは、PP または DG 内電極の長さは、核の解剖学的深度によると変化させた。
2. エチレン酸化物の消毒キャビネットを使用して電極を滅菌します。処理し、汚染することがなく自家製の 2 ch マイクロ ワイヤ電極を格納します。電極は、任意の外科的移植前に厳密に滅菌する必要があります。
3. オートクレーブ手術器具。
4. 手術前に麻酔の手術面を達成するために、ペントバルビ タール (20 〜 50 mg/kg) と腹腔内、マウスを挿入します。
5. 滅菌ペニシリン G プロカイン サスペンション (75,000 U、i. m.)、感染症や痛み、それぞれ²⁴のリスクを減らすための鎮痛エージェント (カルプロフェン、0.05 - 1 mg/kg、SC) とマウスを注入します。
6. 動物の麻酔した後に、目の乾燥を防ぐために両方の目に目の潤滑剤を適用します。つま先の摘心し、応答がないときにだけ、操作を続行応答で動物の反射により、鎮静作用の誘導と麻酔の深さを確保します。
   注: 獣医軟膏は目の乾燥を防ぐために別のオプションです。
7. 電気バリカンや剃刀の刃を持つマウスの頭の上に毛皮のほとんどを剃る、70% アルコールや betadine ソリューションの 3 つの交互になるスクラブと剃毛エリアを滅菌、betadine、皮膚に乾燥後に操作を続行します。

2. 高周波刺激手術^25,26

注: この手順では電極は一方的背 DG または内側の PP エリア、エピソードの学習と記憶に重要な役割を持つ海馬の部分に植えられました。

1. 定位脳手術フレームに麻酔下のマウスを置きます。マウスの頭を動かないように、耳バーを正しく整列させるし、すぐにそれらをインストールします。中心の頭をサポートし、マウスを少し確保して優しく耳バーを締めます。
2. 37 ± で動物の体の温度を維持するためにサーモスタットのパッドを使用して 0.5 の ° c.
3. 鉗子を使用して、マウスの耳前方の皮膚をつかみ、マウスの頭蓋骨の上に皮膚の 1 cm²の領域を削除する滅菌はさみでカットします。
   注: カット皮膚の端に少量の出血を観察できます。
4. 筋肉や頭蓋骨表面を公開する綿棒と頭蓋骨を覆う他の添付ファイルを削除します。すべての骨膜、腱、結合組織から頭蓋骨の完全に識別、矢状面とラムダ縫合線をきれいに綿棒と解離性ノミを使用します。
5. 前とラムダ点を識別します。冠状縫合と、頭蓋骨の優れた中間部分の矢状縫合の交点は前があります。矢状縫合で後上の縫合の交点はラムダが目に見えるです。他の核の位置を設定するのには、元のポイントとして前を使用します。
6. 頭蓋骨の前とラムダの位置の同定後、横のレベルでこれらの 2 つの点を調整します。これらの 2 つの点の高さが (すべてのエラーは、< 0.05 mm をする必要があります), 背腹方向にほぼ同じであることを確認します。また、頭蓋骨が同じ方法²⁶で内側外側方向に水平であることを確認します。
7. 片側手術のため、自家製 2 ch 銅マイクロ ワイヤ電極を定位脳手術フレーム回転電極ホルダーにマウントします。
8. 最初は、前のポイントの上に垂直方向に電極を置き、元のサイトとして設定。デジタルを使用して表示、前後 (ap 通信)、内側外側 (ML) を示す定位脳手術フレーム、背腹 (DV) が配置されます。
   注: 電極が曲がってばかりを防ぐために操作中に頭蓋骨に電極先端部を触ください。
9. 電極を正しい位置にゆっくり移動 (図 1 a、pp、DG と AP-3.8/ML ± 3.0 の AP-2.1/ML ± 1.0 それぞれ)²⁷タッチせず頭蓋骨の上。電極挿入の目的のサイトが見つかった、電極ホルダー高い卵割の定位調整を使用して、黒のマーカーの位置をマークします。
   メモ: 定位座標に関して正確な場所はマウス緊張、重量、および性によって異なります。同性の大人のマウスを使用して、場所の変化を最小限に抑えるください。可能であれば、事前の解剖学的なスキャンは、個々 の主題の基礎²⁷上の場所を識別するために使用ください。
10. マイクロマニピュレーター アシスト ハンドドリルを使用して (サイズをバリ = 0.5 mm) マークした位置でバリ穴を正確にあける。掘削前に 70% のエタノールでバリの先端を滅菌します。0.8 - 1.0 ミリメートルの X と Y の位置を変更することがなく z 軸に沿って頭蓋骨を介してミニ ドリル ビットを移動します。操作中に任意の出血を止めるため滅菌綿を使用します。
    注: 掘削中に過剰掘削、過度の発熱を避けるためには、掘削速度 15,000-18,000 回転/分 (RPM) は、すべて 8-10 のバリの穴からドリル ビットをよく撤回を確認します。
11. 硬膜は、公開までの掘削を維持します。曲がった針を使用して、掘削中に生成される、基になる柔らかい脳組織を損傷することがなく硬膜にピンホールを作るすべての骨のスクラップを削除します。
    注: 脳組織を損傷しないように、ベントの鈍針置き換えることもできます罰金鈍い鉗子が付いて。
12. バリ穴が目的の位置に適切に行われたことを確認するため定位脳手術フレームの調節によって電極の高さを減らすし、電極はバリの穴を介しては障害物に触れることがなくスムーズに挿入されることを確認します。もしそうならはゆっくりと電極を DG (DG PP) に内側の PP である頭蓋骨の表面に 1.8 mm DG (または PP の 3.0 mm) の深さに挿入します。
    注: は、電極注入のプロセス中に脳脊髄液または滅菌綿とぎざぎざの穴からの血液流出をふき取りなさい。
13. マイクロ ワイヤ電極を頭蓋の穴に挿入すると、小さなヘラを使用して適切な歯科用セメントと場所に保持します。セメントが濃くなると挿入された電極と素敵な滑らかなキャップを形成するネジの周り金型します。なかでも、創傷部を消毒してください。
14. 電極ホルダーから電極を外します。定位脳手術フレームからマウスを外し、暖かいケージに戻ります。
    注: 手術後、彼らは完全に十分な意識と麻酔から回復してまで自分のケージに動物を返すと待ちます。
15. マウスを自由に移動し、檻の中を 2 日間の回復することができます。注入電極を接続し、マウスでは、プログラマブル刺激を介して脳、。図 2に示されるように、ソフトウェアのインターフェイスを設定します。400 Hz で 6 パルスの 6 列車の 6 シリーズとして HFS パラメーターを設定 (図 1B列車、20 間 100 ms シリーズの間 s)²⁸。200 μ A に刺激強度を設定します。
16. セットとして必要な期間、HFS を提供します。刺激 2 日 x 8:00、20:00 配信します。
17. コントロール グループのマウスの電極をインプラントし、刺激を実行しないでください。
18. Fosの染色実験的マウスを鋭く刺激 (一日あたり 2 倍)。Brdu 細胞標識の分割実験的マウス急性刺激グループ (一日あたり 2 倍を適用) と慢性的な刺激のグループ (10 x 5 日間で、1 日あたり 2 倍を適用)。刺激の中に、マウスが目がさめているを確認します。リードがよじれていないことを確認してください。
    注: プロシージャの最後の日で急性刺激群マウスは励まされて同時に。
19. 刺激が終わったら、慎重に電極ホルダーおよび記録システムのコネクタから電極ピンを外します。

3. 蛍光抗体法およびブロモデオキシウリジン²⁹を表示

1. Fosおよび notch1 遺伝子の染色は、最後の HF DBS 刺激後約 3 時間は麻酔の手術面を達成するために (20-50 mg/kg, i. p.) ペントバルビ タールを注射することによってマウスを麻酔します。
2. Brdu 細胞標識の最後の HF DBS 刺激後約 12 時間は 2 h の間隔 (0.9% 生理食塩水、i. p. では 50 mg/kg) でコントロールして誘導マウス BrdU の 6 注射を与えます。最後の注射後 36 時間は、手術面を達成するために (20-50 mg/kg, i. p.) ペントバルビ タールを注射することによってマウスを麻酔します。
3. 心を公開し、左心室に灌流 22 ゲージ鈍針に胸郭をメスを使って切開を確認します。右のアトリウムで小切開を行います。Transcardially はそれを冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 50 mL の 1x PBS (pH 7.4) の冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の後の 50 mL の灌流します。
   注: は、マウス血、生体内では置き換えられ、明確な流体を実行時に PFA に PBS を切り替えます。良い血流は肝のクリアによって判断できます。灌流固定微動が観測されている³⁰一度停止してください。
4. 眼科用ハサミでマウスの首をはねる、皮膚を切開し頭蓋骨を公開します。鉗子を使用して、頭蓋骨を少しチップそして慎重に全体のマウスの脳を解剖します。ポスト fix 追加 2 日間 4% パラホルムアルデヒドで脳と一晩で 4 ° C 30% ショ糖液に転送します。
5. クライオスタットを使用して、20 μ m のコロナ セクションに脳を切り。転送しブラシでスライド ガラスのセクションをマウントし、-20 ° C で保存
   注: 電極 misplacements または過度の機械的損傷を持つ動物は、その後の分析から除外されます。
6. 通常 PBS (0.1 M、pH 7.4) にスライドをコピーする定着剤が含まれていません。任意の余分な定着剤を削除する各 5 分の 3-4 倍の PBS とスライスを洗います。BrdU 標識グループのセクション 2 N 塩酸 37 ° C で 30 分間インキュベートし、0.1 M ホウ酸バッファーにそれらを洗い流して (pH 8.4; 10 分)。その後、洗ってスライス 2 x PBS で 5 分間。
   注: 免疫染色が実行されます。
7. ソリューション (0.5% トリトン X-100 と 0.02% アジ化ナトリウム 1x PBS で、3% ウシ血清アルブミン < BSA > 1% ヤギ血清) 室温 (RT) で 1 h のブロックでスライスを扱います。
8. アンチfosポリクローナル抗体 (1: 500; ウサギ)、反 notch1 遺伝子の抗体 (1:50; ヤギ)、またはブロッキング液の 4 ° c で抗 BrdU 抗体 (1:800; ラット) とスライスを一晩インキュベートします。
9. 洗ってスライス 3 x pbs は、インキュベーションして Alexa Fluor 568 共役抗家兎 (1: 500)、Alexa Fluor 488 共役の反やぎ (1:1, 000) とまたは Alexa Fluor 488 共役抗ラット (1: 500) 二次抗体室温 1 時間
10. サンプル 3 を洗って PBS (各時間 10 分) で x。DAPI を含む耐フェード試薬マウント媒体を用いた免疫標識脳のセクションをカバーしてください。空気乾燥し、4 ° C で光から保護保存スライスを聞かせてください。
11. 高分解能マルチ チャンネル (シーケンシャル) 走査共焦点顕微鏡と脳の刺激と非刺激側から海馬領域の画像を取得します。対照群と実験群の間に一貫して撮像パラメーターを設定します。
12. 隣接する電動ステージを使用して、ビューのフィールドの連続 3次元 (XYZ) を獲得し、大型複合材を作るためにそれらをステッチする適切なソフトウェアを活用して高倍率の目的 (20 X 空気目的、NA 0.45) モザイク画像を実行します。画像。
    注: 真のステッチと改良されたシームレスなイメージのオプションを平滑化に、タイリング機能が含まれます。複合画像迅速かつ簡単に使用しておりますステッチ機能広域イメージを形成します。
13. C-fosと notch1 遺伝子の染色、蛍光密度²¹ステッチの画像の肯定的な核定量分析を実行します。ランダムに吻側、背側、腹側海馬 DG 小で 3 エリアを選択し、画像 Jのソフトウェア (http://rsb.info.nih.gov/ij/) の³¹を使用して二重盲検の方法で蛍光の密度を測定します。
14. ラベリング BrdU、二重盲検の方法で背側海馬 (前を基準にして-2.70 mm-1.70 mm) を介して掘削ポイント周りスライスを分析します。
15. DG における BrdU 陽性ニューロンのみをカウントします。カウントの顆粒細胞の 2 セル径内に横たわっているセルが含まれてください。
    注: ここでは、カウントを行った空気目的 X 40 を使用しています。ランダムに 3-5 セクションごとに動物が数えられたとカウントされた平均し DG¹⁹あたりの手段として表されます。

結果

次の海馬の DG のサブ領域を直接または DG を直接活性化する PP サブ領域に HF DBS 刺激定位調整を使用してを介して挿入された電極、齧歯動物の, ペントバルビ タール麻酔をかけられましたし、3 h をサンプリングc-fosと notch1 遺伝子免疫染色の最後の HF DBS 刺激。BrdU の染色、1 日または 5 日間 HF DBS 刺激の後最後の BrdU 投与後 36 h のげっ歯類脳セクションの準備のため, ペントバルビ タール麻酔されました。図 3は、 c-fosの発現も DG の同側で増加したことを示します。また、DG の側におけるc-fos発現fosの信号の表現をほとんど示さなかった人いいえ HF DBS 刺激コントロールに比べて亢進していたも。我々 はさらに、notch1 遺伝子のシグナルもできなかった大人の海馬 DG の HFS 刺激後誘導によって実証 notch1 遺伝子特定の免疫蛍光染色脳...

ディスカッション

HF DBS 手法は、1990 年代以降多くの神経疾患の治療のための強力なツールとして広く使用されています。これまでのところ、HF DBS のランドマーク作業はパーキンソン病や本態性振戦、多くの関心とクリニックと科学的なコミュニティの両方の関心を集めているの治療。特定神経疾患、精神疾患^32,33HF DBS 治療上の適用の多くのグループによって進行中の HF DBS 研究のさまざまな種類があります。これらの研究のいくつかは現在臨床試験^2,34のさまざまな段階で。刺激の副作用も可逆的である気分、思考などの否定的な変更のような頭脳で完璧な配置で発生する可能性し、の変更を避けることができる HF DBS は、大きな利点をもたらす必要があります、刺激の設定。

臨床試験からの過去十年にわたって蓄積 HF DB 技術の大幅な進歩、に加えて生きて...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
脳定位固定装置	Stoelting	51730D	マウス用定位頭蓋内移植
刺激装置	A-Mシステム	Model 3800	MultiStim 8チャンネルプログラマブルスティミュレーター
歯科用ドリラー	Saeshin Precision Co., Ltd	STRONG 90	穴あけおよび脳切開術用
Burr	Meisinger	HM1 005#	掘削および椎堤開術用
Digidata 1550 デジタイザー	分子デバイス	AXON 1550	高解像度データ収集
クライオトーム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	サーモクライオトーム FSE	標本の凍結切片の切断
共焦点顕微鏡	オリンパス	FV-1200	日本、20倍対物レンズ付き (NA 0.45)
マウス手術ツール			ハサミ、鉗子、ボーンカッター、ホルダーなど
ペントバルビタールナトリウム	R&Dシステム	4579	20-50mg / kg、i.p.注射
用ペニシリンG	Sigma-Aldrich	P3032	75,000 U for i.m.
injection Carprofen	Sigma-Aldrich	SML1713	5-10mg/kg, for s.c. injection
4% パラホルムアルデヒド (PFA)	Beijing Solarbio Sci-Tech Co.	P1110	組織固定用ストッキング溶液
リン酸緩衝液 (PBS)	Invitrogen	10010023	pH7.4, 500ml in stocking
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583	水溶性グリコールおよび樹脂の製剤
抗BrdU抗体	Abcam	ab6326	希釈液:1/800
抗c-fos抗体	Abcam	ab209794	希釈液:1/500
ヤギ抗ウサギIgG(Alexa Fluor 568)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A11036	希釈:1/500
ロバ抗ラットIgG(Alexa Fluor 488)	ジャクソン免疫研究	712-546-150	希釈:1/500
DAPI退色防止封入剤	ベクターラボラトリーズ	H-1200	DAPI
抗Notch1抗体(C-20)	による	対比染色sc-6014	希釈率:1/50
ロバ反ヤギIgG(Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150073	希釈率:1/1000

F.S.T.14084-08,11254-20,16109-14