Method Article

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

DOI:

10.3791/57889

⸱

August 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, 2Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, 4Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して記述されています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代替選択的スプライシング (AS) は、ヒトの遺伝子の 90% 以上で発生します。オルタナティブスプ エクソンの表現パターンは多くの場合セル型固有の方法で調整されます。パターンは通常 RT-PCR および RNA シーケンスによって分析される表現としての RNA のサンプルを使用してセルの人口から分離されました。試験では、その場の特定の生物学的構造の表現のパターンとしては、RNAの in situハイブリダイゼーションによる (っぽい) エクソン特異的プローブを用いた実施できます。ただし、代替のエクソン、一般的にエクソン特異的プローブの設計には短すぎるので、ISH のこの特定の使用が制限されています。本報告では、BaseScope、RNA ISH で短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを用いる最近開発された技術の使用はマウスの脳のセクションで式パターンとして分析する説明。神経線維腫型 (Nf1) 1 のエクソン 23 a は、短いエクソン エキソン接合プローブがマウスの脳のセクションの RNA っぽい分析に高い特異性と堅牢な交配のシグナルを示すことを説明するために例として使用されます。もっと重要なは、エクソン包含とスキップ特定プローブで検出される信号は確実にNf1エクソン 23a 式マウス脳の別の解剖学的領域での値でスプライス % を計算する使用できます。実験プロトコル、分析としての計算方法が掲載されています。BaseScope 式パターンとしてその場で評価するために強力な新しいツールを提供することが示唆されました。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代替選択的スプライシング (AS) は、mRNA の成熟過程で発生する一般的なプロセスです。このプロセスで、エクソンは成熟した mRNA の差動含めることできます。したがって、AS を介して 1 つの遺伝子コードを生成できる多く Mrna その異なるタンパク質製品。推定されているヒトの遺伝子の 92-94% が代替スプライシング1,2を受けること。パターンをスプライシング異常の代わりに起因する遺伝の突然変異は、多数の疾患、筋萎縮性側索硬化症、筋強直性ジストロフィーがん3,4などにリンクされています。つまり、調査し、人間の病気の新しい治療法を見つけるための代替選択的スプライシング制御機構を理解することが重要。

多くの場合セル型固有の方法で調整されます。特定の生物学的システムでの特定の遺伝子として発現パターンを調べることが重要です。しかし、これは脳や心臓などの細胞の多くの異なる種類を含む複雑な器官を学んだとき複雑になります。この場合、アッセイ システムの理想的な選択肢は、RNAの in situハイブリダイゼーション (っぽい) ティッシュを使用してセクションの特定の遺伝子として発現パターンを多くの細胞のタイプで同時に検出できます。確かに、エクソン特異的プローブは、代替エクソン5,6、7の発現レベルを評価するために使用されています。ただし、この方法は次の理由ではパターン分析としての適していません。まず、従来の ISH 法は通常 300 以上のプローブを使って bp、脊椎動物の内部エクソン (ない最初または最後エクソン) の平均のサイズは 170 ヌクレオチド8,9。第二に、内部代替エキソンの選択的スプライシングのパターンを調べるエクソン特異的プローブを使用すると、プローブによって検出のみの mRNA アイソ フォームは、エクソンは検出できませんなし mRNA アイソ フォームながら、エクソンが含まれている 1 つであります。したがって、代替のエクソンの値を (PSI) 融着接続割合の計算は複雑です。さらに、従来の蛍光っぽいはしばしば免疫染色は、検出効率と堅牢性を軽減っぽいを兼ね備えています。たとえば、ストレス誘発性を検討した研究ではスプライシング アイソ フォーム切り替えアセチルコリンエステラーゼ (AChE) の mRNA、ジゴキシゲニンっぽいプローブに編入され、アンチ ジゴキシゲニン抗体を使用して検出されました。また、ビオチン標識プローブは、アルカリ性ホスファターゼ/ストレプトアビジン共役およびアルカリホスファターゼの10のための基板によって検出されました。どちらのメソッドでは、任意の拡大戦略を使用して、検出の感度を上げます。その結果、それは低レベルで発現する mrna の検出に挑戦します。したがって、表現のパターンとしてその場で分析する単純で丈夫っぽいアッセイ システムが必要です。

BaseScope は最近 RNAscope、老舗のプラットフォームをベースに開発され、広くっぽいアッセイ システムを使用します。両方のアッセイ系では、検出11,12の感度を高めるターゲット固有の増幅技術を採用しています。その他から 1 つを区別するものは BaseScope、50 のヌクレオチドと RNAscope の 300-1,000 ヌクレオチドとして短いターゲット シーケンスの長さです。したがって、ターゲット特定の代替の mRNA のアイソ フォームの検出するエクソン エキソン接合設計プローブすることが可能です。現在の研究では、神経線維腫の発現パターン入力 1 (Nf1) エクソン 23 a、同じ研究室13,14,15で手広く研究代替エクソンを調べる手順を設立,16,17マウスの脳のセクションで。結果は、BaseScope がNf1エクソン 23 a原の発現パターンを研究する理想的なシステムであることを示します。このアッセイ システムは、多くの代替のエクソンの発現パターンとして分析に適応できますが、それは AS の研究の強力な新しいツールを表します

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての実験では、マウスを含むここに記載は、ケース ウエスタン リザーブ大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されています。2016-0068 プロトコルのタイトル (PI: 華楼) は、「代替の Pre-mrna スプライシング脊椎動物の発生での役割」.

注意: 装置、試薬およびこのプロトコルで使用される供給のすべての情報は、テーブルの材料に含まれます。

1. ホルマリン固定パラフィン埋め込まれたセクション (FFPE)

  1. 頚部転位によって 1 の CD1 のマウスと 1 c57bl/6 j マウスを安楽死させます。慎重にカット オープン外科はさみ鉗子とスカル。スコップで脳を削除します。
    注: 1 歳 5 か月 CD1 雄マウス 3 ヶ c57bl/6 j マウス使用し、同様の結果を示した。
    1. PBS で脳を洗います。ホルマリン溶液 50 mL に脳全体を置くことによって常温 (RT) 10% ホルマリンを含む溶液で 30 h の脳全体を固定します。
    2. 定着液を PBS に変更し、4 ° C で一晩 PBS で脳を孵化させなさい脱水、キシレンやパラフィン標準手順18を使用して脳を埋め込みます。
  2. ミクロトームを使用して、5 μ m のセクションに埋め込まれた組織をカットします。最初のそして、リボンを広めるため 45 ° C の水浴中 RT の水浴のパラフィン リボンを置きます。
    1. しわや折り目にリボンが消えて、すぐにスライド ガラスのセクションをマウントします。使用する前に 60 ° C で 1 時間焼く RT。 スライドで一晩乾燥スライドを空気します。

2 試料の前処理

  1. 組織切片を deparaffinize します。発煙のフードで次の手順を実行します。
    1. 新鮮なキシレン、250 ml の 100% エタノールの 2 つの 250 の mL で 2 皿洗い (図 1 a) を入力します。次の表 1に示されている順序とインキュベーション時間皿洗いの洗濯ラック洗濯ラック (図 1 a)、場所に組織スライドを挿入します。
    2. 各孵卵中リフト洗濯ラックを上下 3 回以上洗濯皿に。各インキュベーション後すぐに組織切片の乾燥を防ぐために次の洗濯料理に洗濯ラックを移動します。
    3. インキュベーションの手順を完了した後洗浄皿からスライド洗濯ラックを削除します。スライドが完全に乾くまで、5 分または 60 ° C のインキュベーターでラックを配置します。
  2. 疎水性障壁ペンでティッシュ セクションを囲む 0.75 'x 0.75' 障壁を描画します。空気乾燥室温 3 分のための障壁
  3. スライスを前処理します。
    1. 試薬と機器を準備します。
      1. ハイブリダイゼーション オーブン (図 1 b) をオンにし、温度を 40 ° C 使用前に 30 分に設定します。
      2. 蒸留水と加湿の紙 (図 1E) を完全に濡れているし、湿度コントロール トレイ (図 1、左)。ハイブリダイゼーション オーブンで湿度コントロール トレイをおいてください。
      3. 10 x ターゲット検索試薬の 70 mL に dH2O の 630 mL を追加して新鮮な 1 x ターゲット検索試薬の 700 mL を準備します。
    2. 過酸化水素を適用します。
      1. Deparaffinized のスライドをベンチに置きます。組織を完全にカバーするセクションに過酸化水素 5-8 滴を追加します。室温 10 分間インキュベートします。
      2. 過酸化水素のソリューションは、一度に 1 つのスライドを削除する吸収紙の上のスライドをタップします。すぐに洗濯ラックにスライドを挿入して dH2o. でいっぱい洗濯料理にラックを移動
      3. 用蒸留水でラックを上下に移動することによって、スライドを洗って 3-5 回。新鮮な水と洗浄スライド 1 つより多くの時間をいっぱい洗濯料理に洗濯ラックを移動します。
    3. ターゲットの検索を実行します。
      1. ホット プレートに 1,000 mL ガラス製ビーカーを置きます。ビーカーに新鮮な 1 x ターゲット検索試薬の 700 mL を追加し、箔でカバーします。フォイル カバー (図 1) をビーカーに温度計を挿入します。ホット プレートをオンにし、10-15 分のために高い設定します。
      2. 検索試薬の温度 98 ° C に達すると、穏やかな沸騰を維持するために低高からホット プレートの温度制御を切り替えます。15 分以上沸騰していません。
      3. 一方、慎重に箔を開くし、検索リージェント内のスライスを洗濯ラックを置きます。ビーカーを再びふたをして 15 分間インキュベートします。
      4. DH2O および 15 のリンス 200 mL でいっぱい洗濯料理にビーカーからラックを削除する使用鉗子 s。
      5. 100% 新鮮なエタノールを含んでいる洗浄皿にラックを移動し、3 分のスライドを削除し、10 分の 60 ° C の定温器に乾燥するために座らせてください。
    4. プロテアーゼ III を適用します。
      1. 染色ラック (図 1右) にスライドを配置します。組織を被覆するプロテアーゼ III の 5 滴を追加します。慎重に湿度コントロール トレイ (図 1、左) でラックを置くし、40 ° C ハイブリダイゼーション オーブン トレイに挿入します。30 分間インキュベートします。
      2. スライド ラックを取り外し、トレイにオーブンに戻します。余分な液体は、一度に 1 つのスライドを削除するスライドをタップします。洗濯ラックにスライドを挿入、洗浄皿のラックの場所に満ちて dH2O. 移動ラックを上下のスライドを洗うが 3-5 回。

3. っぽいアッセイ

  1. 材料を準備します。
    1. あらかじめ 20 分ミックス 2.94 L dH2O および 50 の 60 mL の洗浄バッファー洗浄バッファー x 1 x 40 の ° C の定温器の洗浄バッファー x 50 を温めます。
    2. 100 mL コンテナーでも dH21 N 水酸化アンモニウムの 1.43 mL を 250 mL の dH2o ・ ミックスに追加することによって O. 準備 0.02% (w/v) アンモニア水 100 mL にギルのヘマトキシリンを追加することによって 50% ヘマトキシリン染色液を準備します。
    3. プローブを入れて、アンプ 0-6 RT 30 分使用前に試薬。40 ° C ハイブリダイゼーション オーブンで湿度コントロール トレイをおいてください。
  2. っぽいの手順
    注: アイソ フォーム選択的スプライシングNf1の式を調べて、エクソン 23 a、エクソン 23 a 付属のアイソ フォームを対象とする 3 つの異なるっぽいプローブの値を (PSI) 融着接続パーセントを計算するには、エクソン 23a 除外アイソ フォームまたは両方のアイソ フォームは、使用される (図 2).プローブは、隣接してカットするティッシュ セクションで使用されます。計算の正確さを保つ 3 つの切片が扱われることが重要です交配、増幅および信号の検出手順で同じ。
    1. プローブの交配。
      1. 洗濯ラックからスライドを削除し、スライドから余分な液体をタップします。染色ラックにスライドを配置します。
      2. プローブ名とスライドのラベルに鉛筆を使用します。一緒に 3 つの異なる Nf1 のプローブ (図 2) と交配させるための 3 つの隣接してカット脳組織スライドを置きます。スライドの同じ順序の以降の手順を実行します。
      3. 組織を被覆するプローブの 4 滴を追加します。セクションが乾くを防ぐために同時にこの 1 つのスライドを行います。湿度コントロール トレイに染色ラックを置き、2 h の 40 ° C のオーブンにそれを挿入します。
      4. スライドを洗浄バッファーで 2 回洗浄します。各洗浄のための洗浄バッファー × 1 200 mL で染色の皿を満たしし、洗濯ラックを配置します。同時に紙タオル 1 枚のスライドに余分な液体をタップし、洗濯ラックにすばやく挿入します。スライド ラックを上下に移動するための皿で 3 ~ 5 回右で 2 分間
      5. 2 番目の洗浄では、新鮮な洗浄バッファーを使用します。
    2. 信号増幅。
      1. スライドから過剰な洗浄バッファーをタップし、染色ラック内に配置します。組織を被覆する AMP 0 の 4 滴を追加します。湿度コントロール トレイの汚れのラックを置き、40 ° C で 30 分間オーブンで挿入
      2. スライドを上記のように洗浄液で 2 回洗浄します。
      3. 1-6 次の順序、表 2の条件のアンプでこの手順を繰り返します。交配の各ステップ後 2 回スライドを洗ってください。
    3. 信号検出
      1. スライドから過剰な洗浄バッファーをタップし、染色ラック内に配置します。高速赤 120 μ L を高速赤 B の 2 μ L を追加微量遠心チューブに (1: 60 の比)。よく混ぜるし、ティッシュ セクションを完全にカバーするために追加。
        注: 赤い A の容量/B のミックスは、数とティッシュ セクションのサイズに基づいて。0.75 'x 0.75' 領域、120 μ L は、1 つのセクションに十分です。5 分以内でミックスを使用し、ミックスの直射日光や紫外線への暴露を避けます。
      2. トレイを閉じますと廃棄物コンテナーにソリューション ルート削除で 10 分間インキュベートすぐに洗濯ラックにスライドを挿入して水道水で満たされた洗浄皿にラックを置きます。新鮮な水道水でもう一度すすぎます。
  3. スライドの counterstaining
    1. 洗濯ラックを水道水から外し、余分な水分を除去する吸収紙の上をすばやくタップします。50% ヘマトキシリン染色液にラックを置くし、すぐに数回上下ラックを移動します。室温 2 分間インキュベートします。
    2. 水道水皿にスライド ラックを転送します。ラックを上下に移動、スライドが明確な脳組織が紫のままになるまで、新鮮な水道水を変更する 3-5 回を洗います。
    3. 0.02% アンモニア水を含んでいる皿にラックを移動します。ラック上下に 2-3 回まで移動組織が青色に変わります。染色皿に新鮮な水道水で 3 ~ 5 回スライドを洗います。
  4. サンプルの実装
    1. 60 の ° C の定温器に染色の皿からスライド ラックを移動し、スライドが完全に乾燥するまで、少なくとも 15 分間インキュベートします。
    2. スライド上で、慎重に媒体をマウントの場所 40 μ L 組織切片上 24 ミリメートル x 50 mm の coverslip に置きます。室温 30 分間空気乾燥スライド

4. データの収集と分析

注: は、40 倍の倍率で画像をスキャンするのにスライド スキャナーを使用します。

  1. 正と負のコントロール
    1. 各実験の正と負のコントロール (図 3) が含まれます。良い肯定的な制御として信号が 20-40 倍の倍率で点状のドットとして表示されます。
    2. 肯定的な制御として - PPIB - 1 zz (Mm) にマウスを使用。このプローブは、一般的なハウスキーピング遺伝子 PPIB を対象します。マイナス コントロールの 20 X 顕微鏡フィールドごと染色の背景を表示するすべての 20 のセルに 1 つのドットは、許容。
    3. ネガティブ コントロールとして DapB 1 zz プローブを使用します。このプローブは、細菌の遺伝子 dapB を対象します。これらのコントロールのプローブは、多くっぽい試金19で使用されています。
  2. 信号検出およびNf1エクソン 23 a の発現パターンの解析
    1. 交配のシグナルに点状のドットとして表示されて、手動でドットを数えます。ドットの数が特定のプローブによって検出された成績証明書のレベルと相関しています。ドットの数には、ImageJ または SpotStudio ソフトウェアによって分析できます注意してください。
    2. 3 つのプローブを使用すると、エクソン 23a 含む、エクソン 23a 欠けてアイソ フォーム、または合計nf1 で成績証明書 (図 2) に交配させます。3 つのプローブは、同時に使用することはできません、各プローブに交配させる 3 つの隣接する脳組織切片を使用します。
      1. エクソン 23 a のスプライス (PSI) のパーセントを計算するには、細胞といくつかの脳領域でドットの数をカウントします。興味の地域ごとの図 4に示すようにいくつかのサブ領域から 400 以上のセルを個数します。
      2. 3 つのプローブごとに同じサブ領域からデータを収集します。エクソン 23a 封入プローブを用いた細胞あたりのドットの数として PSI を計算/(エクソン 23a 封入プローブ + プローブをスキップ、exon23a のセルあたりのドットの数でセルあたりのドットの数) x 100%。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BaseScope っぽいが 3 つのマウス系統を用いたを行った: CD1 野生型マウス、c57bl/6 j 野生型マウスとNf123aIN/23aIN変異マウス c57bl/6 j バック グラウンドでどのエクソン 23 a の結果としてすべてのセルのタイプに含まれています設計スプライス部位突然変異14,15。

最初のステップとしてっぽいアッセイ システムを提供する会社の試薬を使用してテストされた: 3T3 細胞と陰性と陽性があるスライドっぽいプローブします。図 3に示すとおり、ポジティブ コントロール プローブを使用した場合、多くの点状のドットが検出された一方、陰性コントロール プローブを使用した場合、信号は検出されません。

...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この通信は、マウスの脳のセクションでの発現パターンを検討する BaseScope RNA っぽいの使用を報告します。そのアンチセンス エクソン エキソン接合プローブ エクソン包含およびしっかりと具体的にアイソ フォームをスキップを標的に 50 のヌクレオチドより短いことを示しています。さらに、結果として得られる信号は代替エクソンの PSI を計算する使用できます。

いくつかのバリエーションは、手順でテストされました。たとえば、クライオスタット切片によって生成される凍結するティッシュ セクションおよびこのっぽいプロトコルで使用するために成功するために示されているテストされました。ただし、この場合、2.1 に deparaffinization ステップは、5 分を PBS で 10 月の洗濯に変更されました。さらに、ACD によって提供されるハイブリダイゼーション オーブンを使用すると非常に便利ですが、染色、免疫組織化学用トレイ スライドと組み合わせて 40 ° C で設定簡単なインキュベーターの使用は、同等の結果を与えます。重要なことは、ボックスでプロシージャ全体で湿式ろ紙を含める...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、アメリカの心臓協会 [HL を費 0365274B] によって支えられた国立がん研究所 [Z.W. に GI 胞子 P50CA150964] 国立衛生研究 [オフィスの研究インフラ共有計装グラント S10RR031845 にケース ウエスタン リザーブ大学の施設をイメージング、光学顕微鏡 】、【 名大 】 を中国奨学金理事会。
著者は彼の助けの光顕微鏡イメージング コア スライドのスキャニングとリチャード ・ リーをありがとうございます。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
ハイブリダイゼーションオーブンAdvanced Cell Diagnostics241000ACD
湿度制御トレイ(蓋付き)Advanced Cell Diagnostics310012
Stain RackAdvanced Cell Diagnostics310017
Hot plateFisher Scientific1160049SH
インペリアルIII汎用インキュベータラボライン302
スライドスキャナーライカSCN400
名前会社カタログ番号コメント
試薬
<ストロング>前処理キットアドバンスドセルダイアグノスティックス 322381
酸化水素アドバンスドセルダイアグノスティック2000899
テアーゼIII*アドバンストセルダイアグノスティック2000901
10x ターゲットリトリーバルアドバンスドセルダイアグニ2002555
BaseScope Detection Reagent Kitアドバンスドセルダイアグノスティック332910
AMP 0アドバンスト セル診断2001814
AMP 1ト セル診断2001815
AMP 2ド セル診断2001816
AMP 3アドバンスト セル診断3
AMP 4アドバンスド セル診断16229B
AMP 5-REDアドバンスト・セル・ダイアグノスティック16229C
AMP 6-REDアドバンスド・セル・ダイアグノスティック2001820
ファスト・レッド-Aアドバンスド・セル・ダイアグノ2001821
ファスト・レッド-Bアドバンスド・セル・ダイアグノスティック16230F
50x ウォッシュ・バッファーアドバンスト・セル・ダイアグノスティックス310091
ネガティブ・コントロール・プローブ- マウス DapB-1ZZアドバンストセルダイアグノスティック701021
ポジティブコントロールプローブ-マウス (mm)-PPIB-1ZZアドバンストセルダイアグノスティックス 701081
コントロールスライドマウス 3T3細胞ペレットアドバンスドセルダイアグノスティックス310045
名前会社カタログ番号コメント
その他の消耗品
加湿紙高度な細胞診断310015
洗浄ラックアメリカンマスターテック サイエンティフィック9837976
ウォッシングディッシュアメリカンマスターテック サイエンティフィックLWS20WH
疎水性バリアペンベクトル研究所H-4000
スライドガラスフィッシャーサイエンティフィック12-550-15
カバーガラス、24 mm x 50 mmフィッシャーサイエンティフィック12--545-F
名前会社カタログ番号コメント
Chemicals
水酸化アンモニウムフィッシャー・サイエンティフィ002689
100% エタノール (EtOH)デコン ラボ2805
ホルムアルド溶液フィッシャー・サイエンティフィックSF94-4
ヘマトキシリン Iアメリカン・マスター・テック サイエンティフィック17012359
マウンティング ミディアムベクター ラボH-5000
キシレンフィッシャーサイエンティフィック173942
ー過ス プロス スティックス ス アドバンス アドバンス 2001817 ス ス スティックス ス ス ック ・サイエンティフィック

References

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