人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

サマリー

白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス トラクターは、ワットの一次文化のため安定的かつ適応可能なプラットフォームを提供します。

要約

白色脂肪組織 (WAT) は、重量と毎日の健康の調節に重要な役割を果たしています。 まだ、忠実に脂肪の微小環境を要約またはワット 2 週間を超えて生存を拡張に失敗したすべての利用可能な初代培養モデルに大幅な制限があります。 信頼性の高い培養モデルの欠如は深刻なワット代謝および医薬品開発の研究を妨げます。このため「SWAT」(サンドイッチ白色脂肪組織) と呼ばれるワットの一次文化のための新規プラットフォームを開発する microphysiologic システムの NIH の基準を活用しています。我々 は、みじん切りのワット クラスター脂肪由来間質細胞のシートの間に挟むによって脂肪細胞の自然な浮力を克服します。 このコンス トラクターには、ワットのサンプルは、文化の実行可能な以上 8 週間です。 SWAT そのまま ECM、細胞-細胞間の接触、ワット条件体内の物理的な圧力を維持します。また、SWAT は、堅牢な転写プロファイル、外因性化学シグナリングと全体の組織の機能に対する感度を維持します。SWAT は、脂肪培養の再現性のある、シンプルで効果的なメソッドを表します。 潜在的に、ワット生理学、病態生理、代謝、及び医薬品開発の研究のための広く適用可能なプラットフォームです。

概要

脂肪は肥満は、米国¹の $ 1470 億と $ 2100 億との間の直接の年間医療費を運ぶの主な臓器です。脂肪の蓄積は、心臓病、II 型糖尿病、特定の種類のがん²などの死の他の原因にもつながります。文化モデルの in vitro代謝の研究と医薬品開発に不可欠なが、現在の研究モデル脂肪組織の主要な不足があります。脂肪細胞は壊れやすく、軽快な, と終末分化した細胞細胞培養プラスチックを遵守しない、従って従来の細胞培養法を用いた培養することはできません。1970 年代、いくつかの方法がガラス coverslips、天井文化、懸濁培養細胞外マトリックス^3,4,5,の使用を含む、これらの障壁を克服する試みで使用されています。^6,7します。 ただし、これらのメソッドは、細胞死と脱分化、によってマークされていると、彼らは通常以上の 2 週間の研修期間に使用されます。さらに、これらのモデルがしないでそのまま ECM は保持していません、脂肪細胞と間質の相互作用サポート細胞も収縮力細胞を互いにで生体内で発揮ネイティブ脂肪微小環境を再現ワット。

ゴールド スタンダード脂肪培養法のない場合は、脂肪の研究は分化前脂肪細胞 (diffAds) の主に頼っています。DiffAds は多房性、付着性、および代謝活性です。対照的に、プライマリの白色脂肪細胞は単房性、非粘着性と比較的低代謝を示します。健康な成熟脂肪組織の生理を要約する現在脂肪培養モデルの失敗は、脂肪細胞を直接対象とする FDA 承認薬の不在で主要な要因では可能性が高い。実際には、生理学的体外臓器モデルの欠如は、ほとんどの臓器や疾患にわたって主要な問題です。

Microphysiological システム (MPS) プログラムの創設を発表したそのポジション ペーパー、国立衛生研究所 (NIH) 報告医薬品臨床試験のすべてにわたって 2013年成功率もすぎなかった 18 のフェーズ II の %、第 III 相 50%臨床試験⁸。MPS プログラムは、直接体外単作のモデル人間の生理にできないことに対処するためです。NIH は、人間のプライマリまたは器官の機能を要約するだろう多細胞の 3 D 構造で幹細胞から成る文化システムとして MPSs を定義します。同質で、不死化細胞培養の還元主義的モデルとは異なり MPSs をオルガン薬物相互作用⁹薬物、薬セル セル セル正確にモデルする必要があります。短期の初代培養方法とは異なり NIH の基準は文化⁸で 4 週間にわたって MPS 持続可能性を指示します。NIH の RFAs (#RFA-TR-18-001)¹⁰MPS プログラムの詳細を見つけることが。

適応可能な単純な小説を開発した、安価な脂肪の MPS は「白色脂肪組織に挟まれた」と呼ばれる (SWAT)¹¹。私たちは「挟む」みじん切りにした主な脂肪脂肪由来間質細胞 (ADSCs) (図 1) のシートの間で脂肪細胞の自然な浮力を克服します。結果として 3 D 構築サポート セル人口は自然な脂肪細胞と成熟脂肪細胞を囲む細胞間接触とネイティブ脂肪微小環境を繰り返します。SWAT は、8 週間生存率、外因性シグナリング、アデポカイン分泌と動物モデルに生着する応答を実証によって検証されています。

プロトコル

IRB LSUHSC-NO. オフィスによって承認されたすべてのタスクが #8759 と #9189 プロトコルに準拠しました。すべての動物の仕事を行った #3285 激しい情緒号所 IACUC によって承認プロトコルへの準拠

1. 細胞シートを挟むの播種

注: は、図 1を参照してください。

1. 組織培養プレート (6 cm または 6 ウェル プレート) で約 80% の confluency に種子 ADSCs。SWAT 希望のウェルのシードよく 1 従来の組織文化と組織文化の poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) コーティング プラスチック プレートに対応するサイズの 1 も。
   注: したがって、SWAT の 6 ウェル プレートが必要になります 1 つ 6 ウェル標準組織培養プレート (ベースレイヤー) 上のセルと 1 つ 6 ウェル pNIPAAm 被覆組織培養プレート (上層) シードします。pNIPAAm コーティング プレート、市販で購入することができます。 またはラボの^12,13,14。
2. 維持 ADSCs 37 ° C および 5% の CO₂のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10 %fbs と 1 ペニシリン/ストレプトマイシン_. x2 日ごとにメディアを変更します。
3. 100% 合流になる紋パターン (約 6-8 日) を取るまでを合体します。
   注: これらの細胞は、浮揚性の脂肪組織を安定させるために単一のまま細胞シートとして機能する必要があります。不十分な合流するセルをワットと播種時にフラグメント化します。

2. SWAT の準備用品します。

1. いくつかの 10 mL の因数の 1 x ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS); を準備します。余裕量板の所望の数の十分を準備します。
2. SWAT のシードのプランジャー装置を準備します。円形ディスクに接続されている幹から成る単純なのアクリル プラスチックを使用してプランジャーを構築します。組織培養の井戸の円周内に収まることを確認 (直径: < 料理は 6 cm、6 cm < 6 ウェル プレート用 3.5 cm; おおよその質量: 6 cm 皿、6 ウェル プレート用 5.1 g 6.7 g)。
   1. プロシージャを実行できるように円滑にケースで任意の個々 のプランジャーに問題があるに余分なプランジャーを準備します。
   2. ラボ テープ プランジャー ディスクの縁の周りをラップ、少なくとも 2 倍、ゼラチン液の漏れを防止します。
   3. スプレー安全キャビネット (BSC) 70 %etoh。空、上限なしの 15 mL の円錐管; と BSC 内 15 mL の円錐管ラック ダウン スプレーします。チューブは、ゼラチン プランジャーの配置をセキュリティで保護するのに役立ちます。
   4. ラックに 15 mL の円錐管に各テープ巻プランジャーを 70 %etoh と場所で徹底的にスプレーします。金属ワッシャー (おおよその質量 6.3 g) をスプレーし、フック鉗子; のペアと一緒にラックの上に置きますワッシャーは、SWAT がシード処理中にプランジャーに重量を追加します。
   5. BSC サッシを閉じる、UV 乾燥と殺菌を容易に光を入れます。
      注: は理想的には、この手順の SWAT の播種前に 24 h を行います。また、組織コレクション/SWAT 播種; の日にプロセスを実施します。ただし、この場合、UV 乾燥・殺菌のための 15-45 分を許可します。

3. ゼラチン プランジャーの準備-シート上のセルへの適用

1. 75 ° c の水浴を熱します。
2. ゼラチン溶液を準備するには、1 x HBSS の 10 mL のストックにゼラチン パウダーの 0.75 g を追加します。ヒューム フードの下で、溶液の pH のバランスをとる 1 M NaOH の 100 μ L を追加します。
   1. 風呂の水に 10 mL の株式を追加、ソリューションに粉末が溶解するまで精力的に 5 分ごとを振る。温水のお風呂に追加した後すぐに粉ゼラチンを溶解する目的。
   2. BSC 送風機をオンに、UV ライトをオフに、サッシュを上げ。BSC 表面をスプレーし、フィルターの供給 (5 mL ルアーロック注射器や 0.2 μ m シリンジ フィルター) を準備します。複数のフィルターをプランジャーに適用するゼラチンの十分なボリュームを効率的にひずみを準備します。
3. ゼラチン溶液が均一な整合性に達したら、ソリューションをフィルター処理し、プランジャーに適用。ゼラチンで注射器をロードします。シリンジ フィルター (~2.5 mL 6 ウェル プレート、6 cm 皿 ~4.5 mL) を通じてプラスチック製プランジャーにゼラチンを適用し、(~ 20 分) を固化することができます。
4. ゼラチンがしっかりと、プランジャーの端からテープの包みを開けます。フック鉗子でプランジャーの外側のエッジからゼラチンを削除 (すなわちメニスカスの縁の隆起)。プランジャーの中央に残りのゼラチンが完全にレベルを確認 ADSC シートとの接触を最大化します。
5. 過剰なゼラチンを取り外したら、優しく pNIPAAm コーティング ADSC プレートにゼラチン プランジャーを適用します。金属の洗濯機を使用して、プランジャーを圧迫します。細胞シートはプランジャーを適用中のせん断しません。
6. 室温で 1.5 h の細胞シートにプランジャーを残します。プレート/プランジャー pNIPAAm コーティング プレート表面から細胞シートの解離を完了する 1.5 h の氷水風呂で孵化させなさい。
   1. 氷浴; で抱卵中は注意します。氷浴孵卵中における携帯メディアを汚染することはできません。
   2. インキュベーションを完了すると、非滅菌水を取除く pNIPAAm 被覆板の下部をきれい。

4. 白色脂肪組織の処理

1. ひと脂肪組織を手術室から収集する場合は、氷の上、SWAT がシード処理するまで滅菌コンテナーにすべてのサンプルをしてください。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などの無菌維持媒体を組織安定のため脂肪組織コンテナーに追加します。
2. 冷たいセル培地ごとの井戸/料理する 1.5 mL 遠心チューブにシード (6 ウェル プレート用 100 μ L、200 μ L 6 cm 皿) を追加します。
3. 脂肪組織をミンチします。
   1. 固体脂肪セグメントの次の手順に従います。
      1. 脂肪 3 の大規模なセグメントを洗って滅菌 PBS で x を外し、可能ように同様に多くの PBS。
      2. 粗く組織鉗子と滅菌のかみそりをミンチし、多くの血管と可能な限り筋膜を削除 (詳細については、の説明を参照)。
      3. 細かくみじん切りにした組織が厚く、液体の一貫性にまで剃刀で脂肪をミンチします。
         注: 理想的には組織が表示されますワットのない目に見える個々 のセグメントで均質なこれは常に可能ではありませんが。
   2. Lipoaspirate のように処理します。
      1. BSC、下、ビーカーの上に滅菌ガーゼをテープ、余分な液体を収集する大きなビーカーにこのビーカーを配置します。
      2. 25 mL の血清ピペットを使用して、必要に応じて同様に多くの lipoaspirate を描画し、滅菌ガーゼの面に適用します。Lipoaspirated 脂肪を洗浄し、余分な血液と脂質の残基を削除するこの表面に直接 PBS を適用します。
      3. 排水組織を回復、滅菌肉挽き表面にそれを転送し、lipoaspirate をミンチ鉗子を使用します。
4. みじん切りにした組織を転送する p1000 ピペット チップの遠位端を切断する滅菌かみそりを使用します。これは、脂肪細胞の換散につながることができるせん断応力を最小限になります。適切な組織の整合性に達する (6 ウェル プレートの 300-400 μ L、6 センチメートルの皿のための 500-600 μ L) 各 1.5 mL チューブにみじん切りにした組織の適切なボリュームを転送します。ひき肉のワットとチューブで簡単にメディアをミックスします。
5. ADSC のベース プレートを取るとメディアのデカント/吸引。メディアを各 1.5 mL チューブからワット/メディアの混合物に置き換えます。
   1. 優しく pNIPAAm コーティング プレートからゼラチン プランジャーを削除し、ADSC のベース プレートにワットの混合物に適用します。細胞の剥離を確認する顕微鏡下で pNIPAAm 被覆板の単分子膜を調べます。
6. ヒート ブロックを BSC 約 37-40 ° C に設定します。まだ場所でプランジャー、ヒート ブロックの表面にプレートを移動します。温めた培細胞をインキュベートし、ゼラチンの溶解を容易にする 2-3 mL を追加します。
7. ~ 30 分後に静かにプレート面からプランジャーを取り外します。基本組織培養皿の蓋を交換して、セル文化振興に移動します。ゼラチンは、37 ° C で完全に液化して、一度吸引し、細胞の培養基を置き換えます。
8. 7 μ M インスリン、30 μ M デキサメタゾン、1 x フェノールレッド フリー M199 培地で 37 ° C、5% CO₂で SWAT を維持ペニシリン/ストレプトマイシン。6 ウェル プレートと 6 cm 料理 3 mL 約 2 mL メディアで維持されます。2 日ごとにメディアを変更します。

5. 収穫を SWAT します。

1. 準備コラゲナーゼ (0.5 mg/mL コラゲナーゼ、500 nM アデノシン、PBS) 15 mL コニカル チューブ (おおよそ量 10 mL) の因数。チューブを固定し、-20 ° C で保存
2. 細胞から培地を吸引、PBS、1 x を洗浄し、PBS を吸引します。コラゲナーゼ因数を準備するには、それらを 37 ° C の水浴で解凍。
   注: 理想的には、コラゲナーゼの解決が 37 ° C に達する;その後すぐに組織を追加します。
3. 個々 の因数に SWAT 板からすべての組織を追加します。無菌細胞スクラッパーを使用して SWAT を収穫し、カットオフ p1000 ピペット チップとコラゲナーゼ因数に転送。コラゲナーゼ溶液 15 mL の円錐管に直接組織を追加します。
   1. また、50 mL のコニカル チューブ; 組織/コラゲナーゼ混合物をインキュベートします。面積の増大により、更に酵素消化を促進します。
4. 45 ° の角度でインキュベートした軌道シェーカーにサンプル チューブを配置します。30-60 分の 37 ° c、200 rpm で孵化させなさい。
5. コレクションの新しい 15 mL コニカル チューブにメッシュ フィルターを 250 μ m の場所です。フィルターを通して消化脂肪溶液を注ぐ。
   注: これは線維組織をフィルタ リングを通過するすべてのセルになります。
6. 相分離を許可する部屋の温度で 5 分間座って通過できます。
   注: 脂肪細胞は、脂肪間質細胞 (Asc) 低い段階に解決する間ソリューションの上にフロートします.500 × gで 5 分間遠心分離は、細胞分離やペレットの ADSCs を囲む収穫を最大限ことができます。
7. カットオフ p1000 のピペット チップを使用して、1.5 mL 遠心管を脂肪細胞 (コラゲナーゼの解決の上にフローティング レイヤー) を転送します。脂肪細胞を収集するために管の端に沿ってゆっくりピペット一度に 〜 250 μ L を取るします。
   1. 内部に付着した細胞の回復を最大限に脂肪細胞を収集しながらチューブをゆっくりと回転します。1.5 mL 遠心チューブが完全になるまでより多くの細胞を描画してください。
8. 注射器の針 (~ 21) に接続されているを使用して孤立した脂肪細胞から余分な液体を削除します。フローティングの脂肪層の下に針を沈めます。任意の細胞を針軸に付着を除去するために簡単に針を扇動し、上に浮かぶに外れ脂肪細胞の待ちます。
9. 脂肪細胞の意図しない削除を避けるために注意しながら、余分な液体をゆっくりと描画します。一貫してサンプル ボリュームを分離する遠心チューブ卒業式を使用 (など。サンプルごとに 0.1 mL)。
10. DNA ・ RNA の抽出、グルコース取り込みアッセイ、脂肪分解法等の隔離されたセルを使用します。

結果

SWAT の生存率が個々 のワット クラスターのシリアル明視野イメージングによる評価された当初 (n = 12) 約 7.6 週間。クラスターは、この時間を通して単分子膜上の場所にセキュリティで保護された残った。わずかな形態学的変化は、少し歪むか、またはシフト ポジションを個々 の脂肪細胞で観察されました。しかし、脂肪細胞も房になって、脱分化の欠如を示すも細胞死細胞ブレブ、換散、断片化 (図 2) などのいずれかの兆候を展示しています。クラスターの id を脂肪細胞は脂質染色ナイル赤 (NR) 2 週齢 SWAT に確認されました。明確な NR は、単房性脂肪細胞クラスターの染色には、これらがそのまま膜ではなくアーティファクト、嚢胞、または死んだ脂肪細胞と脂肪細胞にほんとうが示されます。NR 染色周辺の ADSC シートがない場合に、これらの細胞の脂質を蓄積されしたがっていない差別脂肪細胞系統の方 (図 3 a) されていないを示します。Propidiu...

ディスカッション

このプロトコルの詳細 ADSCs を使用してサンドイッチひと白色脂肪組織;人間 ADSC 細胞は十分に確立されたプロトコル¹⁵を介して分離できます。ただし、システムは個別研究の要件 (サンドイッチ マウス ワット 3T3L 1 セルを使用して) などの適応することができます。主な人体組織にはこのプロセスが含まれます。標準的な安全上の注意を採用する必要があります。BSL 2 病原体 (例えばHIV、HepC) として人間の組織を処理します。BSC の直下組織の処理のみ。機関安全規格によって決定されるすべての適切な PPE を着用-二重の手袋をお勧めします。正しくすべての用品を消毒して 10% で廃棄物を再利用したり処分する前にソリューションまたは 70% エタノール溶液を漂白剤.

SWAT 文化の最初の重要なステップは、調達と pNIPAAm 被覆組織培養プレートを維持します。このような板は商業的に、利用または確立された方法^12,

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10x HBSS	サーモフィッシャー	14185052
ゼラチン	Sigma-aldrich	G9391
コラゲナーゼ	Sigma-aldrich	C5138
アデノシン	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	サーモフィッシャー	11995065
M199 メディア	サーモフィッシャー	11043023	フェノール レッドフリー
250 µmメッシュフィルター	ピアス	87791
0.2 µm シリンジフィルター	セルトリート	229747
5 mL Luer-Lokシリンジ	BD	309646
メタルワッシャー			これらはシンプルなメタルワッシャーで、どの金物店でも購入できます。プラッカーの背面に重りを追加するだけで、細胞とゼラチンが均一に接触するだけでなく、ストックや滅菌も容易です。おおよその質量:6.3 g
名前	会社	カタログ番号	コメント
加熱された装置
インキュベート軌道シェーカーVWR		10020-988	サンプルは45°Cでピッチされるべきです; コラゲナーゼの消化を促進するために角度
ブロック			37-40 °Cおよびバイオセーフティキャビネット
ウォーターバス			~75°Cに設定;C
名前	会社	カタログ番号	コメント
特殊プラスチック
Upcell Dishes 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	これらは、ADSCの上部シートを成長させるために使用できる市販のpNIPAAmコーティング皿です。あるいは、pNIPAAmコーティングされたプレートをラボで製造することもできます。直径:<6 cm皿の場合は6 cm、<3.5 cm(6ウェルプレート用)。おおよその質量:6cm皿用6.7g、6ウェルプレート用5.1g
プラスチックプランジャー装置			これらは、所望のpNIPAAmコーティングプラスチック(マルチウェルプレート、ペトリ皿)に収まるように形成することができます。それらは、円形の円盤に取り付けられた単純なステムで構成されています。それらは、ラボ内で、またはアクリルプラスチックを製造できる任意の施設で製造することができます

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