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方法論記事

トラッキング システムは、単純なすぐに利用できるソフトウェアを使用して新規の単一の動物の運動機能

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DOI:

10.3791/57917

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2018年8月31日

 ,  ,  , 
1Advanced Platform Technology Center, Rehabilitation Research and Development, Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

この記事について

サマリー

現在の研究の目的はラットにおける運動障害の定量化を自動化します。初期評価モデルでは、運動野の皮質内微小電極注入によるモータ損失を評価します。開発と簡単に適応可能なシンプルで、すぐに利用できるソフトウェアのコーディングを使用して追跡アルゴリズムの使用について報告します。

要約

我々 は最近、即時かつ持続的な運動障害の結果ラットの運動 corteces の皮質内微小電極を埋め込むことを実証しました。運動障害は、総運動機能を測定するためのオープン フィールド グリッド試験と微細運動機能を測定するためのはしごテストを通して手動で定量化されました。ここでは、カスタム Capadona 行動ビデオ分析システムを使ってビデオに記録されたテストの自動定量評価手法について論じる: グリッドとはしごテストまたは変更できます |。シンプルですぐに利用できるソフトウェアのコーディングを活用 (材料の表を参照)、このプログラムは、オープン フィールド グリッドとはしごテストの両方で 1 つの動物の追跡。強度のためのビデオ フィールド グリッド、トラッキング コードのしきい値を開き、グリッド試験の 3 分の期間にわたってラットの位置を追跡してパスを分析します。計算し、旅の総距離、最大速度を達成、左、右利きの回転数とラットによって交差するグリッド行の合計数の値を返します。はしごが追跡、コードを再度のしきい値の強度のためのビデオは、はしごでラットの動きを追跡し、はしごを横断するラットがかかった時間を含むリターン計算測定足数スリップの平面で行われる、はしごの段と停滞や逆戻りによる障害の発生率。けがや病気の多くのモデルを含む、アプリケーションの様々 な運動機能の解析のためここに開発変更できます | を用いることができることを想像します。

概要

機能や動作の運動と認知障害1,2,3の両方を評価するために多くの確立された方法があります。いくつかのより一般的に使用される方法、微細運動機能を介して足配置、ステップ、はしごテスト4、テスト総運動機能とストレスの動作を介してオープン フィールド グリッド試験5 下肢調整のテスト ,6恐怖、抑うつ、および絶望を介して強制水泳試験試験7,8または回転子の棒のための9。ただし、これらのメソッドの多くは人間研究者「スコア」動物またはそのパフォーマンスを主観的判断に依存します。人間の主観的な評価の必要性は研究10研究バイアスの意図的または意図しない影響のための機会を提示し同様遅い世代とにデータを分析することができます。データのさらに、主観的な評価はまた、物忘れ、貧しい人々 の動機、不適切なトレーニング、または過失11で不正確なデータ表現のリスクを生じます。

我々 は最近、オープン フィールド グリッド試験とラット皮質内微小電極12,13注入はしごテストの両方の使用を報告しています。ためにこれらの研究の調査結果の目新しさは、我々 はすぐにそれらを採用始めたと研究室では、多くの進行中の研究で追加機能テストします。主観的な評価、分析のスループットを改善するために数の増加から生じる意図しない人間生成変動を見越して、行動テストのスコア、コンピューターによる自動化されたプログラムを作成に着手しましたエラーの可能性を大幅に制限します。

ここでは、変更できます | の開発について報告する.変更できます | は総体および良い運動機能の指標として、オープン フィールド グリッド試験とテストのはしごをそれぞれスコアをコンピューター分析を使用します。結果は、負傷又は疾病モデルに関係なく、傷病によって引き起こされる可能な運動機能欠損を明らかにする使用ことができます。分析コードは、行動試験装置または運動機能のさまざまなメトリックを獲得するための変更に合わせることが。したがって、弊社は利用目的または他の所で現在用いられるものの用途を超えて、多くのアプリケーションでは、変更できます | を実装できます。

オープン フィールド グリッドとラダーのテストがビデオ録画を必要とすることに注意してください。したがって、[1080 p, 最小の 15 フレーム/秒 (fps)] ビデオ カメラ、ノート パソコン、ビデオ データを格納するルーム各テストが必要になります。両方のテスト フレームで見られる全体の装置を可能にする、中心位置にカメラを配置します。それがテスト中に移動しないように、三脚や足場の上にカメラを固定します。可能な限りテスト装置の端と平行に近いビデオ フレームの端を維持します。必ず同じ人員をすべてのテスト完了、部屋は温度制御システムによる明るいです。部屋に最小限の変更で、テストのコース全体ですべての動物の同じ部屋を使用します。穀物やバナナ チップの動作テストを完了する動物を奨励する良い報酬を確認します。

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プロトコル

すべてのプロシージャと動物ケアの実践された承認、ルイ ストークス クリーブランド部のベテラン事務医療センター施設動物ケアおよび使用委員会に従って実行されます。行動テスト プロトコルは、過去に発表された12,13です。

1. 行動テスト: タスクを撮影

注: ここでは、動物が慢性的な行動の変更を検出する 8 週間を調べた。研究期間は研究用アプリケーション/怪我/病気モデルに依存します。

  1. フィールド グリッド テストを開く
    注: グリッド テストは 40 cm の壁 1 m2の領域には、社内に建てられました。下部は、9 の正方形で鮮やかな色のテープ (図 1A) に分割されます。自動変更できます | 用ラットを線とグリッドの色のコントラストに注意が重要です。ここでは、白いスプレイグ ラットが用いられていました。したがって、グリッドの背景は黒で描かれた、明るいピンクのテープで線が作成されました。
    1. 試験動物 2 週後の計算で使用するための基準スコアを作成するために研究を開始する前に週を含むすべてのテストのための x。
    2. 装置をきれいすべてテスト初めに塩素ガスによる滅菌剤と各テスト セッションと各動物の間。
    3. テストのための部屋に動物を持参し、試験を開始する前に 20 分のための部屋を調整することができます。
    4. 撮影を開始し、グリッド テストを開始、研究者から直面しているグリッドの中心に動物を置き。
    5. 上から記録されているビデオを 3 分間自由に実行する動物を許可します。
    6. 期間が終了する 3 分の撮影を停止し、その家のケージに動物を返します。塩素ガスによる滅菌剤、世話を完全にテストする前に、表面を乾燥させるとグリッドをクリーンアップします。テスト各動物 1 セッションあたりの倍。
  2. ラダーのテスト
    注: はしごテストは社内に建てられから成っている 2 つの側面にアクリル製壁、3 mm 径段 2 cm 間隔 (図 2) でつないだ長さは 1 m。動物では、公式テストを開始する前にラダー トレーニングの週を必要とします。トレーニングとテストのプロトコルの違いはありません。訓練が撮影される必要がないことに注意してください。
    1. 変更できます | で使用するため黒ポスター ボードが付いている梯子の後ろの壁をカバーし、ラング、開始、および白いラットとのコントラストを作成する明るいテープでフィニッシュ ラインのレベルを描きます。
    2. 試験動物 2 週後の計算で使用するための基準スコアを作成する研究を開始する前に週を含むすべてのテストのための x。
    3. 装置をきれいすべてテスト初めに塩素ガスによる滅菌剤と各テスト セッションと各動物の間。
    4. テストのための部屋に動物を持参し、試験を開始する前に 20 分のための部屋を調整することができます。
    5. ラダーのテストの前にきれいなケージに動物を配置します。
      注: 一時的なケージは動物のホーム ケージは梯子の終わりに使用されますが、動物を保持するために短期的なケージです。年齢の研究で使用されるすべての動物としてバイアスが同じ年齢、同じ期間にわたって包括的なテストがないです。ここで使用されるコントロールは、手術を受けたことがない素朴な動物です。
    6. スパン 2 ケージまではしご装置を設定します。開始ケージはきれいなケージと最後の檻は動物の生活ケージ、実行を完了するためのインセンティブです。
    7. はしごの長さを中心とした、三脚にカメラを配置します。カメラのレンズは、梯子の段の高さは、三脚を拡張します。カメラの位置を段正確に整列のレンズでこれはスリップ検出アルゴリズム変更できます | コード内の重要であります。
    8. ビデオの録画を起動し、ラットの梯子の最初の段の上の彼らの前部足を保持することによって実行を開始します。自力でのはしごの上を移動する動物を許可します。
    9. スタート ラインから撮影しながら自分のペースでフィニッシュ ラインに移動する動物を許可します。ビデオ録画を終了し、動物が実行を完了したら、はしごから動物を削除します。
    10. 動物が回るまたは 20 の停滞のまま s の終わりビデオ録画と動物、実行が失敗した場合、はしごから動物を削除する場合は、実行の失敗した実行を検討してください。手術前のベースライン テスト中に記録された最も遅い時間に相当する失敗した実行のペナルティ スコアを割り当てます。
    11. それぞれの動物がテスト初日あたり 5 の実行を完了したことを確認し、各試行の間 1 分の残りの期間を与えます。
      注: この研究では、動物がテスト 2 x 8 週間の週。期間は、研究者の裁量に委ねられています。

2. ファイル ストレージと命名

注: 変更できます | コードは、特に指定したビデオ ファイルとフォルダーの名前付け規則、ビデオ可能性があります確実に解析され、適切に解析を使用します。異なる名前付け規則は現在サポートされていません。テスト セッションの終了後ビデオのファイルは、既定の名前で既定の場所に保存されます。

  1. 個々 のビデオの命名
    1. 動画のテストすべてのグリッドの動物の指定の各ビデオを名前します。
    2. テスト各動物のセッションあたり 5 はしごの動画を収集します。すべての 5 つのビデオを選択し、動物の指定を使用して、最初のビデオの名前を変更します。など動物の名前が"C1NS"に場合、ファイルの名前が"C1NS (1)」、「C1NS (2)"、"C1NS (3)」、等
  2. ストレージ フォルダーの名前付け
    1. 各動物にちなんで今ビデオを撮影し、自分の記憶域フォルダーにファイルを配置します。次の規則を使用してこのフォルダーに名前を付ける:「TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY」.
      注: の例では、このフォルダーはグリッド動画の最初の週を保持し、1 月 1 日撮影された場合はst、2018 年にこれらのビデオは"Week1_GridTest_01_01_18"の名前を保持するフォルダー。
    2. この明確な名前付きフォルダーに属している実験のこのセットは大規模な研究を示す別のフォルダーに置きます。
      注: フォルダー ツリー システム研究を維持するための名前付けの要件がないと整理モードのテストします。システムを選択するだけのフォルダーは、動画手順 2.2.1 で名前を保持するフォルダーです。
  3. スプレッドシート ファイルの作成
    1. 外部のスプレッドシート プログラムを使用して (材料の表を参照)、研究およびテスト モードごとにデータを格納する新しい空のスプレッドシート ファイルを作成します。
      注: このファイルの命名やストレージの場所の要件がないです。各研究は、グリッドをテストするため、はしごをテストするためのシステムで使用する 2 つのスプレッドシート ファイルを必要があります。今のところこれらのファイルを空のまま。
    2. これらのスプレッドシート ファイル、任意のコンピューター上で開いていない、変更できます | の実行中を確認します。
      注: 場合は、変更できます | が既に開いているスプレッドシート ファイルを開くしようとすると、これになりますエラー。

3. システムのインストール

注: 変更できます | 建てられ、PC のオペレーティング システムでランタイムを活用シンプルで容易に利用できるソフトウェアのコーディングからコンポーネントをテストします。他のシステム構成は現在サポートされていません。

  1. 変更できます | の最新バージョンをインストールします。
    1. ラベル インストーラー アイコンをダブルクリックしてインストーラーを実行 'BVASX。XXinstaller'。"X.XX"は、現在のバージョン番号、現在 'BVAS3.30installer'。
      注: これはオープン ソースのソフトウェアです。最新バージョンの対応する著者にお問い合わせください。
    2. に従って、画面に表示される、変更できます | をインストールする手順。
      注: インストーラー ソフトウェアの正しいバージョンのシステムがチェックされます (e.g。、MATLAB ランタイム)、それがインターネットからソフトウェアをインストールされますが見つからない場合。
    3. 一度インストールすれば、プログラムをクリックして起動、'BVAS.exe'ファイル。

4. システムの利用

  1. プログラムを開く
    1. 次のオプションを使用できますを変更できます | メイン メニューを表示する変更できます | プログラム アイコンをダブルクリックします: 'グリッド解析'、'梯子分析'、'梯子レビュー' または '終了'。
      注: またある「メールの設定」(図 3A) をラベル左上隅にあるドロップ ダウン メニュー。
  2. メールの設定
    1. [メール設定] ドロップ ダウン メニューをクリックし、まず 'メール宛先の変更' を選択します。
    2. 分析のアップデートを受信し、'[ok]' を選択する優先電子メール アドレスを入力します。現在保存されている電子メールを変更する場合は、[キャンセル] を選択します。
    3. システムに現在保存されているメール アドレスにテスト メールを送信するテスト電子メールの送信] をクリックします。近くに、「メール送信!' テストの完了を示すウィンドウ ポップアップ。
  3. オープン フィールド グリッド テスト分析
    1. トップ メニュー画面から「グリッド解析」を選択します。
    2. トグル ボタン '単一のビデオ/全体セッション/プロット データ' はセッション動画をテストの全体のセットの分析を完了する全体のセッションを表示することを確認します。
    3. 分析する動画のファイルを検索するファイル システムを参照する上部の入力ボックスの横にある '...' ボタンを利用します。2.2.1 の手順で説明するスタイルのラベルのフォルダーを選択します。
    4. 活用、...、データを格納するスプレッドシート ファイルを選択してファイル システムを参照する下の入力ボックスの横にあるボタン。
      注: と同様、スプレッドシートのファイルにデータを出力する、各ビデオの完全なパスのデータはファイルに格納データ (.mat) 4.3.3 で選んだ動画を保持しているのと同じディレクトリに。
    5. 4.3.2 の手順に記載されているトグル ボタンは 1 つのビデオの解析を完了する '単一ビデオ' に設定されてを確認します。
    6. 活用、... 分析するビデオのファイルを検索するファイル システムを参照する上部の入力ボックスの横にあるボタン。
    7. 活用、. データ ファイル (.mat) 単一のビデオ分析からの結果を保存するディレクトリを選択するファイル システムを参照する下の入力ボックスの横にあるボタン。
      注: データ ファイルのビデオの動物にちなんで後名前なります。
    8. 4.3.2 の手順に記載されているトグルから「出力データ」を選択します。以前に分析されたグリッドのビデオからのデータを出力。このプロットされたデータの例としては、図 1 bと1 Cのとおりです。
    9. 活用、... 以前に作成されたグリッド データ ファイルを選択するファイル ・ システムをブラウズする上部の入力ボックスの横にあるボタン。選択 '行く!' プロットとデータの図を作成します。
      注: この関数は、名前のテキスト ファイルを作成しますも同じ、動物データ ファイルと同じディレクトリにあるのそれのデータを実行します。
    10. 両方の必要なファイルが配置されたら、選択 '行く!' ビデオの分析を開始。'戻る' ボタンは、上部のメニューが再開される 'Quit' ボタンは完全にプログラムを閉じることに注意してください。(図 3および3 D) 追跡アルゴリズムの視覚的表現を表示する 'デバッグ表示' トグルを選択します。
    11. 選択 '行く!'分析プロセスを開始します。校閲者画面の各ビデオの画像を確認します。5 つを超える動画がある場合は、'次'と'前へ] ページ ボタンを使用します。
    12. 手動選択メニューを表示するには、緑の線がないか、テスト領域の周囲正しい正方形にする緑の行が表示されない場合 '編集' ボタンを選択します。コーナーを編集するには、「編集コーナー ' ボタンを選択します。
      注:「次のフレーム」ボタンは、該当する動画の次のフレームに代表的な画像を変更します。自動的にフレームが妨げられる場合または焦点が合っていない、「次のフレーム」ボタンを選択します。
    13. 選択プロセスを完了するテストの領域を選択し、'Enter' を押してする代表的なイメージの右に指示に従います。
      注: 選択したグリーン ラインは、代表的な画像に今表示します。
    14. 選択範囲を保存し、校閲者の画面に戻る '実行' を選択します。
    15. 動画ごとにグリッド領域を正しく選択したら、完全な分析プロセスを開始するセンター"完了"ボタンを選択します。実行するプログラムを許可して、完了時に、成功のプロンプトが表示されます。
      メモ: ビデオのセッションの完全な分析は、いくつかの時間は、1 頭につき約 10 分かかります。
  4. はしごテスト分析
    注: 初期のはしごテスト分析のためのプロトコル、手順 4.3.10–4.3.15 で説明されているプロトコルに似ています。これらの手順の前に顕著な違いは次のとおりです。
    1. はしご分析メニューを開くには上部のメニューから「はしご解析」を選択します。
    2. トグルは、'1 つのビデオ」と「全セッション」(図 3B) の 2 つのオプションを表示します。
    3. 「全体セッション」選択の上入力はしご動画という名前のフォルダーを選択するにはボタンと手順 2.2.1.Select. の下で後で確認するはしご動画からデータ保存フォルダー ディレクトリを選択するボタン。
    4. '単一ビデオ' が選択場合単一のビデオ ファイル上で... ボタンと場所 4.4.3 の手順と同じ。
    5. 選択 '行く!' 分析プロセスを開始し、はしごテスト領域の校閲者画面を表示します。
    6. 手順 4.3.10–4.3.15 グリッドは梯子の同じ方法に従ってください。実行するプログラムを許可して、完了時に、成功のプロンプトが表示されます。
      注: 解析中に問題が発生した場合、電子メールは 4.2.2 の手順で入力したメール アドレスに送信されます。どんな種類の分析が完了したら、完了メールは同じメール アドレスに送信されます。
  5. はしご画像レビュー
    注: 次のプロトコルは、以前を確認する分析エラーを確認し、伝票を手にはしご動画です。注意してください、'はしご画像レビュー' (手順 4.5.1–4.5.5) が完了するまでを表示するのにははしご交差のスプレッドシート ファイルは生成されません。
    1. トップ メニューから「はしご画像レビュー」を選択します。はしごレビュー ファイルの選択画面が表示されます。
    2. トップを選択] ボタンをクリックすると、データ ファイルのフォルダーを選択します。
      注: ファイル 4.4.2 のステップで選択した場所に保存されの名前は次の形式に:「M1_D1_Y1 はしごビデオ セッション HH_MM M2_D2_YYYY」。M1、D1、および Y1 は、分析対象セッションの日です。「ビデオ ・ セッションをはしご」は単一のビデオを行った場合のみ「単一ビデオ分析」を読むでしょう。HH_MM と M2_D2_YYYY は、レビュー セッションが開始された日付と時刻です。
    3. . 下を選択すると、研究のため作成したスプレッドシート ファイルを選択します。
    4. 選択 '行く!'マニュアルのレビュー プロセスを開始します。
    5. 自動的に開かれたはしごデータ校閲者メニューを表示します。スリップが検出されると、「次のフレーム」を使用と連続していずれかをチェックする「最後のフレーム」ボタンが利用可能な場合、フレームを記録。
    6. ラットの何足が滑っているを示すためにスリップ トグルを利用します。トグルに残す '滑りなし' 検出が、false の場合肯定的です。次の検出 (図 2A) に移動して保存/再開] をクリックします。
    7. 失敗した場合はトグルを使用して障害が反転 (どこラットになっての実行中に) または停滞が原因かどうかは、(ラットが失敗タイムリーに実行を完了した) を示します。
    8. 次の検出に移動する保存/再開] をクリックします。最後の検出分析を完了し、以前に選択したスプレッドシートのファイルにデータを保存する保存/再開] をクリックします。完了通知を閉じます。
      注: 確認が完了後に見直されたフォルダーの名前を変更「の見直し M1_D1_Y1 はしごビデオ セッション HH_MM M2_D2_YYYY」。

5. 出力データ解析

  1. グリッド スプレッドシート ファイル
    1. 各グリッドのビデオからスプレッドシート ファイルで作成されたデータを探します。
      注: 列が左から右に次のように: 動物の名前、テストの日付、試験番号、旅、総時間停止、最大速度を達成、右ターン、左ターン、総距離、グリッド線の週を越える (図 1D)。
    2. 総モーター性能を定量化し、比較動物と時間点のプロットを作成するこれらのメトリックを使用します。
  2. はしごスプレッドシート ファイル
    1. 失敗を次の各はしごビデオからスプレッドシート ファイルで作成されたデータを検索および足のスリップのレビュー。
      注: 列が左から右に次のように: 動物の名前、番号 1-5、研究数の週、テスト、実行の種類 (成功または失敗)、% 完了すると、成功のための実行の時間の日付足足、および故障モードごとにスリップ。失敗の時間コラムが空白と反転または停滞 (図 2B) 障害モード列を読み取ります。
    2. 細かいモーター性能を定量化し、比較動物と時間点のプロットを作成するこれらのメトリックを使用します。

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結果

紹介した方法、ラットはオープン フィールド グリッドを完成品し、はしごテスト週の 2 倍。データを変更できます | を使用して両方と、ストップウォッチで手動で行ったによって訓練と初心者のレビューです。結果提示が単一の非注入コントロール動物から生毎週のスコアの平均、8 週間の研究では、週「0」が基準となるテストに対応します。手術動物の残り週が第 1 週の間にテストはありませんでした注意してください。オープン フィールド グリッドはテスト 1 日あたり x、はしごは 1 日あたり 5 x をテストし 1 週あたりの 2 つの試験日には、同じ 8 週間の期間ではしごテストの 80 の試験があるに対し、オープン フィールド グリッドの 16 の試験のサンプルがあります。

変更できます |対手動解析:
3 つの専門家の校閲者からのマニュア...

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ディスカッション

強力な分析を確保するためのプロトコルの最も重要な部分は、一貫した撮影です。プロトコルの最初のセクションで説明したようによく点灯して撮影が正しい位置でビデオが、システムは正確な分析を行うことになります。正確で簡単な任意の画像処理の問題と同様、前処理での作業後の処理になります。そのため、装置と動物は、テスト中に明るい任意の影やフレームに他の動きは最小限に抑え、確実なは、変更できます | に精度の高いレベルで機能することができますを意味します。

ここで提示されたプロトコルは効率的かつ再現性をもって総体および良いモーター機能経由で齧歯動物のオープン テストからの結果を分析する使用ことができますフィールド グリッドとラダーのテスト。さらに、データ分析は主として自己機能しているコンピューターで、ユーザーの入力なしで完了としてヒューマン エラーまたは解析プロセスのバイアスの可能性を低減します。この機能のためは、専門家と初心者の両方のユーザーが同じレベルの精度を変更できます | システムを使用できます。変更できます | プログラムが自己チェック、簡単に実装できると使用する安価です...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、レビュー賞によって支えられた # B1495 R (ジェフリー ・ r ・ Capadona) に、科学者およびエンジニア (PECASE) (ジェフリー ・ r ・ Capadona) に退役軍人庁リハビリテーションのアメリカ合衆国の部門の大統領早いキャリア賞研究・開発サービス。さらに、この作品は、ピア レビュー医療研究プログラムを通じて賞号下健康担当アシスタント長官の防衛のオフィスによって部分で支えられましたW81XWH-15-1-0608。著者は、その研究資金援助のソースを認めます。内容は、アメリカ合衆国退役軍人局やアメリカ合衆国政府の見解を表していません。著者らは、設計および齧歯動物の行動プロトコルをテストに彼の指導のため CWRU 齧歯動物の動作コア博之荒川を感謝したいです。著者も感謝したいジェームズ ・ ドレイクとケビン タルボット CWRU 機械科・航空宇宙工学から設計および製造齧歯動物のラダーのテストで彼らの助けのため。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Sprague Dawley ラット、オス、201-225 gCharles RiverCD
Webcam HD Pro c920Logitec960-000764
ExcelMicrosoftN/A
Matalb 2017a, Computer Vision System ToolboxMathworksN/A
オープンフィールドグリッドテストCase Western Reserve UniversityN/A
はしごテスト:ケースウェスタンリザーブ大学で社内で行われ、N / A
で社内製。

参考文献

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