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方法論記事

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノ ウイルス レポーター システムを使用しての細胞イメージングをライブします。

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DOI:

10.3791/57926

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2018年7月30日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、TGF-β/Smad3 シグナル伝達活性アデノ ウイルス レポーター システムを使用しての生きているセルイメージ投射のためのプロトコルを提案する.このシステムはリアルタイムで転写活性を追跡し、両方単一細胞の in vitroおよび生きている動物に適用できますモデル。

要約

増殖因子 β (TGF-β) シグナル変換生体のホメオスタシスに必要な多くの重要な機能を調節して、一般的に発見がんなど多くの疾患で過剰に発現します。TGF β が強く関与している転移の遅段階の癌の進行中に渡り鳥や侵襲性の腫瘍細胞のサブセットをアクティブにします。シグナル伝達経路解析のための現在の方法はしばしば生物学的イベントのシグナリング事後を測定しようとし、病気の進歩的な性質を反映していないエンドポイント モデルに焦点を当てます。ここでは、TGF-β/Smad3 シグナリングパス生細胞における転写活性化を検出するための新規アデノ ウイルス レポーター システム固有を示します。広告 CAGA12-Td トム記者を活用し、24 時間体外内の MDA MB 231 セルの 100% 感染率を実現できます。蛍光レポーターの使用により、活単一細胞のイメージングの転写活性状態の細胞の直接同定とリアルタイム。TGF-β と感染細胞の刺激が転写活性アクティブで、特定の生物学的機能に関与する細胞のサブセットのみが表示されます。このアプローチは高い特異性と単一細胞レベルでの感度の TGF-β シグナリング体外に関連する生物学的機能の理解を高めることできます。Smad3 転写活性することができます報告体内でリアルタイムのアプリケーションを介して、広告 CAGA12- リュック ・記者。広告 CAGA12- リュック伝統的な固定して transfected ルシフェラーゼの細胞と同じ方法で測定することができます。Smad3体内移植細胞の転写活性は従来の IVIS イメージングによる解析でき、TGF-β シグナル伝達経路のダイナミクスにユニークな洞察力を提供すること、腫瘍の進行中にライブ モニターします。我々 のプロトコルを記述する生きている細胞のシグナル伝達経路のクイック高速イメージングを可能にする有利な記者配信システムの in vitroとin vivoの両方。このメソッドは、イメージ ベースのアッセイや基礎生物学と治療開発のため高感度で再現性のあるアプローチとして提示の範囲に拡張できます。

概要

トランスフォーミング増殖因子 β (TGF-β) は、信号をヘテロ二量体複合体 II 型を介して人間の開発に関与している重要なサイトカイン受容体1型します。募集およびタイプのリン酸化のタイプ II の受容体に結合結果 I 受容体は、順番に下流 Smad2/3 タンパク質2,3を廃止します。これらは核に移行し、4遺伝子の転写を調節する複合体を形作る Smad4 へ Smad2/3 蛋白質のバインドを活性化。TGF-β/Smad の恒常条件下で信号が堅く調整される;ただし、多くの病気のシグナル伝達経路は自由化は、しばしば病5,6、7の進行につながる過剰に発現します。最近の研究は、TGF β 細胞応答が異種 TGF-β/Smad アクティブな細胞の集団は、時間依存的8,9の生物学的機能を実証しています。TGF-β/Smad シグナリングの一般的な細胞解析は、細胞の活動のスナップショットのみを提供し、しばしば平均 TGF-β/Smad 効果10量的に表わす固定エンドポイント アッセイの使用を含みます。これらのメソッドは、ただし、可能性があります正確に表していない TGF-β/Smad は病気の進行時生理状態の伝達の分子の挙動。生きているセルのイメージ ベース解析は、時空の理解の両方の細胞および生物学的プロセスのダイナミクスをキャプチャします。

私たちの目標は、TGF-β/Smad アデノ ウイルス ベースの試薬を用いるシグナリングの生きているセルイメージ投射のための高感度ハイスループット法を開発することでした。ここでは、我々 感染ひと乳癌癌セルライン MDA MB 231 Smad3 CAGA モチーフ バインド シーケンスとルシフェラーゼ (リュック) または Td トマト (Td トム) レポーターの遺伝子を表現するアデノ ウイルス。アデノ ウイルス レポーター システムは、癌細胞株における 100% 感染率につながるプラスミド導入クイックで安価な方法を提供します。アデノ ウイルス レポーター系も正常に従来のプラスミド11transfect に困難細胞に適用されています。このプロトコルでは TGFβ/Smad のシグナル伝達経路の生きているセルイメージ投射を達成するために、再現性と非侵襲的プロセスを述べる体内と体外の両方。

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プロトコル

すべての動物実験は、メルボルンの動物倫理委員会の大学によって承認されました。

注: シーケンス、建設、世代プロトコル、アデノ ウイルスのベクトル p広告 CMV Td トム、p広告 CMV GFPと p広告 CAGA12- リュック ・/Td-トム前述11,12となっています。 13。すべてのベクトルが市販されています。

1. ウイルス力価測定 50% 組織培養感染量 (TCID50) を使用して

  1. 1 x 106 DMEM + 10 %fbs メディアの 10 mL の HEK293A セルを準備します。
  2. 96 ウェル平底細胞培養プレートの各ウェルに、細胞懸濁液を 100 μ l 添加をシードします。
  3. 1 mL の完全培地のウイルス ストックの 1: 100 希釈を準備します。1 列目のウェルに希薄ウイルスの 11 μ L を追加します。
  4. 96 ウェル プレートに直接細胞懸濁液を 100 μ l 添加で 1 の最終希釈まで希薄ウイルスの 11 μ L を混合することによって連続 10 倍希釈液を実行12に達する x10。非付着性細胞がこの段階で井戸間で転送される細胞の数は変わりません。
  5. 各希釈 10 の最高の希釈から始まる各列に 11 μ L をピペット4。ウイルス粒子のクロス オーバーを制限する各希釈ピペット チップに置き換えます。
  6. ネガティブ コントロールとして列 12 に 11 μ L のウイルス無料完全なメディアを追加します。
  7. プレート 10% CO2と 37 ° C で 7-10 日間インキュベートします。
  8. 顕微鏡を使用して、細胞変性または細胞毒性効果の兆候を表示する各列の井戸の数を獲得します。感染症の兆候がある場合は、よく正を検討してください。
  9. リードと Muench14(1938) 統計的手法を使用してそれぞれの希釈のための肯定的な井戸の割合を計算します。
  10. 比例距離 (PD) を使用して計算: (A-50)/(A-B)、A は回答率 50% 以上、B は 50% 以下回答率。
  11. TCID50を使用して計算: 10X PDX は希釈 50% より大きい応答を与えること。
  12. 次を使用してからウイルス力価を計算: 0.69/(0.011 x TCID50) PFU/mL

2. アデノ ウイルス慣性モーメント測定

  1. 種子 1.0 1.5 を 500 μ l の 10 の5 MDA MB 231 セル x DMEM 培地 FB、12 の各ウェルのウェル プレート 5% 含む (35% の confluency、合計で 6 井戸) の。
  2. 0、250、500、2500 に必要なAd CMV Td トム株式市場で次の数式を使用して 5000 の MOI のボリュームを計算: MOI = (ボリューム [μ] PFU/μ L x)/セル数。1 x 1010 (PFU/mL)、ウイルス感染のボリュームの価と広告 CMV Td トムは、必要なモア、0、3.75、7.5、37.5、75 μ L がそれぞれ。
  3. 徹底した混合井戸にウイルス株を直接ピペッティングによる広告 CMV Td トムセクション 2.2 での計算されたボリュームで細胞に感染します。
  4. 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
  5. 井戸からメディアを削除し、すぐに 5 分間 10% ホルマリンの 500 μ L のセルを修復します。
  6. 井戸からホルマリンを吸引し、500 μ L の PBS で 1 回洗浄します。
  7. ヘキスト溶液 5 分間の 500 μ L の細胞核を染色します。
  8. ヘキスト ソリューションを削除し、500 μ L の PBS 3 回と井戸を洗浄します。
  9. 蛍光顕微鏡で 200 倍の倍率を使用して Td トマト タンパク質と細胞核の信号のイメージ。554 で Td トマト蛋白質をエキサイト nm と 352 のヘキスト染料 nm。
  10. MOI は Td トマト15100% 感染に必要な作業を決定する ImageJ を用いた画像を分析します。

3 ライブの単一細胞におけるデュアル アデノ ウイルス伝達

  1. 種子 1.0 1.5 を 500 μ l の 10 の5 MDA MB 231 セル x DMEM 培地 FB、12 の各ウェルのウェル プレート 5% 含む (35% の confluency、合計 2 井戸) の。
  2. 75 μ広告 CMV GFPの細胞に感染する (力価 = 5 x 109 PFU/mL) とAd CAGA12-Td-トムの 7.5 μ L (価 = 5 x 1010 PFU/mL) 2,500 の慣性モーメントは、100% 感染陽性を達成することができますを取得します。
  3. アデノ ウイルス感染後すぐにセル (10 mg/mL 入荷、最終濃度として 5 ng/μ L) ウェルあたり TGF-β の 0.25 μ L の有無を扱います。
  4. 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
  5. 画像位相コントラスト蛍光顕微鏡による生きた細胞。470 nm、554 で Td トマト蛋白質に GFP をエキサイト nm。
  6. セルを修正し、1.9 1.6 の手順で説明するように細胞核を染色します。
  7. イメージ Td トマト タンパク質とヘキスト染色蛍光顕微鏡を用いたします。352 でヘキスト染料をエキサイト nm。
  8. ImageJ を用いた GFP および Td トマト陽性率細胞15を計算します。

4. 単一細胞シグナリングに創傷治癒の試金

  1. 種 4-5 105 MDA MB 231 セル 1 mL x DMEM 培地 FB 6 の各ウェルのウェル プレート 5% 含む (50% の confluency、合計 2 井戸) の。
  2. 広告 CAGA12-Td-トムの 22.5 μ L で細胞に感染する (力価 = 5 x 1010 PFU/mL、MOI = 2,500)。
  3. 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
  4. P200 ピペット チップを使用して各ウェルの細胞の層の 2 つの交差線をスクラッチします。
  5. 井戸から古いメディアを削除し、新鮮な 5 %2 mL で FBS メディア (10 mg/mL 入荷、最終濃度として 5 ng/μ L) ウェルあたり TGF-β の 0.5 μ L の有無を置き換えます。
  6. 10% の CO2と 37 ° C で 5 分間のインキュベーターでプレートを置き、位相差顕微鏡で 100 倍の倍率を使用して選択した創傷部の画像を取る。
  7. 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
  8. 同じ分野で傷の閉鎖の画像を取る。
  9. セルを修復する、1.9 1.6 の手順で説明するように細胞核を染色および創傷部・蛍光顕微鏡で 200 倍の倍率を使用して非創傷部に Td トマト信号を視覚化します。
  10. 傷や ImageJ ソフトウェア15を使用して非創傷部で Td トマト陽性細胞の割合を定量化します。

5. ルシフェラーゼ アッセイ体外

  1. 3-5 mL の 5% を含む DMEM 培地 1 で 10 の4 MDA MB 231 セルの細胞懸濁液を準備政府短期証券。
  2. 感染細胞懸濁液を 2.5 μ広告 CAGA12- リュック ・ (力価 = 5 x 1010 PFU/mL、MOI = 2,500)。
  3. 種子、96 に感染した細胞は、3,000 セル/100 μ L/ウェルでウェル プレートします。
  4. 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
  5. 井戸から古いメディアを削除し、新鮮な 5 %fbs メディア (1 Mg/ml とストック、最終濃度として 1 ng/μ L) ウェルあたり TGF-β の 0.1 μ L の有無の 100 μ L に置き換えると 0.17 μ L/ウェル (7 mg/mL 入荷 TGF-β 阻害剤の有無、最終濃度として 12 ng/μ L) (新規 TGF-β リガンド トラップ蛋白質、陳ら、未発表の作品)。
  6. 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
  7. ルシフェラーゼ アッセイ システム基板を解凍し、文化 1 x 細胞二重蒸留水 (DDW) 溶解液を準備します。
  8. 96 ウェルからメディアを取り出し、30 分穏やかな攪拌と軌道のシェーカーを使って氷の上 1 x 細胞文化換散バッファーの 50 μ L と井戸を溶解させます。
  9. ライセートの 30 μ L を各ウェルから不透明なルシフェラーゼ プレートに転送でき、部屋の温度を暖かくプレート。
  10. ルミノのソフトウェアでは、新しいプロトコルを作成します。1 注射前に、と注射後の測定を選択します。投与前に、の測定値を 1 に設定測定における遅延と積分時間の両方のための s。噴射量測定後の注入量に設定 1 の遅延測定で40 μ L 注入前後 5 s s積分時間。設定を確認するには、 [ok]を選択します。
  11. DDW にインジェクター チューブを置き、首相の設定で使用する前にインジェクター チューブをきれいにするインジェクター 1ボタンをクリックします。次 DDW とチューブからすべてのソリューションをフラッシュするインジェクター 1 の 2 つのさらなる素数が続く空気の場所からインジェクター チューブを削除します。ホタル基板と再び 2 回基板を準備する総理にインジェクター チューブを配置します。
  12. ルミノにサンプルで不透明なルシフェラーゼ プレートを置き、ソフトウェアのオプションを選択します。関心の井戸を強調表示し、[適用] をクリックします。ルシフェラーゼ信号の計測を開始を押してください。
  13. 測定が完了したら、削除し、水でプレートをすすいでください。インジェクター チューブに空気に総理インジェクター 1 ホタル基板チューブにチューブを配置することによって任意の残りの基板を回復します。DDW にインジェクター チューブを置き、任意の残りの基板のインジェクター チューブをきれいにする 2 つのさらに素数を実行します。

6 ライブ シグナル伝達イメージングは生体内でセル準備

  1. 腫瘍移植前に h 48 175 cm2フラスコ (合計 10 フラスコ) に 2-3 x 10 の6 MDA MB 231 細胞をシードします。20 mL の 5% を含む DMEM 培で細胞の培養 37 ° c、10% CO2FBS。
  2. 24 h 後で、追加の 300 μ L広告 CAGA12- リュック ・ (力価 = 5 x 1010 PFU/mL、MOI = 2,500) 各フラスコに。さらに 24 時間培養細胞を保ちます。
  3. 注入の日、古いメディアを削除し、20 mL の PBS、pH 7.4 で一度アデノ ウイルスが感染した細胞を洗浄します。フラスコに 0.05% トリプシン-EDTA の 2 mL を加えてトリプシン フラスコのすべての面をカバーするように少しフラスコを振る。37 ° C で 3 分間 10% CO2インキュベーターでフラスコを配置します。
  4. フラスコに 8 mL の FBS を含む DMEM 培地を加えることによって、トリプシンを癒します。すべての細胞懸濁液を試薬瓶に転送します。
  5. 診断を使用してセル数をカウントし、2 つの 50 ml の遠心管に 10 の7セル x 4.8 を転送します。
  6. トリプシンを削除し、新規メディアの FBS DMEM の 720 mL の細胞を再懸濁します RT で 5 分間 400 x g で細胞を遠心します。
  7. 5 mL の滅菌チューブに細胞懸濁液を転送し、160 μ L を追加マトリゲル (10% 合計マトリゲル懸濁液)。
  8. 着床まで氷の上の細胞を保ちます。

7. 同所性同種移植

  1. 12 SCID マウスの重さし、制御そして処置のグループ (6 マウス/グループ) にマウスをランダムに割り当てます。
  2. 無菌環境を維持するために滅菌バイオ キャビネットの注入を実行します。1 L/分場所熱パッドの上でマウスの酸素流量を 2.5 〜 4.5% イソフルランを使用してマウスを anaesthetize や角膜の損傷を避けるために両方の目に眼軟膏を潤滑油のドロップを施します。鼻の円錐形に鼻を配置することによって麻酔を維持、イソフルランに接続している間、仰臥位で熱パッドにマウスを修正します。
  3. ピンチをつま先に反応の欠如によって麻酔の成功を確認します。イソフルランを 1 L/分の酸素注入のメモのために 1.5-2.5% の維持投与量に減らします。
  4. 80% エタノールに浸した綿棒を使用して、正中線を両側第 4 ニップルから皮膚をきれい。
  5. 触診を通じて 4回乳腺脂肪パッドを見つけるし、さらに組織を公開するための脂肪パッドを絞る。
  6. 細胞懸濁液を上下にピペッティングでよく混ぜます。優しく 27 G インスリン注射器に細胞の混合物の 50 μ L を吸引し、マウスの両側乳腺脂肪パッドに注入します。
  7. 脂肪パッドの腫れの感じで成功した注入を確認します。優しく脂肪パッドを解放し、マウスをケージに配置します。
  8. 意識を得るし、3 日間開催の部屋に戻ってケージを配置するマウスを許可するように、少なくとも 30 分間熱パッドにケージを残します。

8. IVIS イメージング

  1. 生活イメージソフトウェアを開きます。
  2. コントロール パネルの [ IVIS システムの初期化ボタンをクリックして IVIS システムを初期化します。温度記号が緑色に点灯するまで待ちます。
  3. コントロール パネルの発光イメージング モードを選択します。
  4. 商工会議所と IVIS システムにイソフルラン麻酔を入れます。
  5. 1 L/分の酸素と 2.5 〜 4.5% イソフルランを使用してマウスを anaesthetize します。イソフルランを麻酔、メンテナンスのため 1.5 2.5% で設定します。D-ルシフェリンの 150 mg/kg 体重をマウス腹腔注射による注入します。
  6. IVIS システムにマウスをすぐに転送、温度制御のイメージング プラットフォームに配置し、鼻の円錐形に鼻を配置します。
  7. コントロール パネルの [順序の設定] ボタンをクリックし、培地ビンを選択します。
  8. 画像の露光時間を次のように設定: 10 s、20 s、30 s, 60 s、120 s の開始ルシフェリン注射後約 3 分の画像と信号がドロップを開始するまでをイメージ引き続き (通常これは約 20 分を要するでしょう)。
  9. 鼻の円錐形をイソフルラン麻酔を維持しながら IVIS からマウスを削除し、50 μ L の PBS と 50 μ L TGF-β シグナル伝達阻害剤 (50 μ g/腫瘍) 内腫瘍注射を介してマウスを治療します。
  10. ケージに戻ってマウスを入れて、少なくとも 30 分間熱パッドにそれらを残します。その後、持株の部屋に戻ってケージを配置します。
  11. 治療の翌日に上記のように手順をイメージング IVIS を繰り返します。

9. データの分析

  1. オープンリビング イメージソフトウェアにファイルを保存します。
  2. ビューを使用した画像情報を見つける |イメージの情報。
  3. 同じ露光時間と同様の時間ポイントで撮影した写真を選択します。グループとして写真をロードします。
  4. 強度を正規化するイメージ調整を個々のボックスをオフにします。
  5. 強度を分析するフォトンモードを選択します。ROI ツールの関心領域 (ROI)ボタンを選択することによって、信号の強さを定量化します。
  6. 発光信号を含む領域を ROI 円をドラッグし、信号強度を取得するメジャーをクリックします。

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結果

単一細胞の in vitroイメージングをライブします。

TGF-β/Smad 基づくアデノ ウイルス試薬を用いた単一細胞におけるシグナル伝達の活性化を正確に評価するには、まず、最適な多重度の感染症 (MOI) の各セルの行を調べることが重要です。最適な MOI は、細胞の 100% がない存在の細胞変性または細胞毒性効果を持つアデノ ウイルス感染症の肯定的なときに決定されます。これを判断するには、肯定的な感染のマーカーとして機能する恒常活性広告 CMV Td トム記者を使用しました。アデノ ウイルス感染細胞の割合は、5,000 の MOI に 0 から MOI 依存的に増加しました。2,500 の MOI で MDA MB 231 細胞 (図 1 a、1 b) 100 %td トム式を見ました。ピクセル強度/セルは、強化された感...

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ディスカッション

TGF-β/Smad3 は単一生細胞におけるシグナル伝達のリアルタイム イメージングを可能にする技術を開発しました。この手法を使用すると、動的の TGF-β/Smad3 転写活性強化された侵入および移行8に関連付けられていたと以前セルのサブ人口を同定しました。このメソッドが TGF-β シグナル、Smad3 リン酸化の西部のしみなどの伝統的なアッセイに向上し、TGF-β は、不均一性をキャプチャすることにより遺伝子発現を対象と TGF-β/Smad3 腫瘍集団内におけるシグナル伝達と強調表示の単一のセルの生物学の重要性。さらに、単一細胞イメージングでは、核移行は、時間がかかり、高価な別の方法で実行される場合細胞し、遺伝子転写16,17に常に翻訳しないかもしれない。これらのメソッドは、上流シグナル伝達経路を調べることが重要ですが、アデノ ウイルス レポーター システムは生物学的機能に関連して個々 の細胞における TGF-β/Smad3 シグナリング ユニークな視点を提供します...

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開示事項

利害の衝突を報告しません。

謝辞

この作品は H JZ に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの助成金によって支えられました。TMBW は、Templestowe ロータリーと治療のための食事のパートナーにオーストラリア政府からオーストラリア大学院賞、オーストラリアのロータリー健康からアン ヘンダーソン トップアップ奨学金の受信者であります。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMThermoFisher188102437°Cで温まります。Cの水浴場使用前の
胎児のウシの血清Scientifixの生命FBS500-Sは使用前に不活性化
組換えの人間のTGF-&β;1PEPROTECH100-21重水素減少水溶液で最終濃度を 10 mg/mL
Hoechst-33258Tocris Bioscience5117PBS に希釈して最終濃度を 1 μL/mL
ルシフェラーゼレポーターアッセイキットプロメガ197897使用前にPBSで5倍希釈
ルミノメータープロメガ9100-002
位相差蛍光顕微鏡オリンパスIX50
遠心分離機エッペンドルフ5810 R
VivoGl ルシフェリンプロメガP1041
IVIS ルミナIII In VivoイメージングシステムPerkinElmerCLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x)ThermoFisher15400-054Diltue 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x ReagentPromegaE153ADilute to 1x in DDW
10% FormalinSigma-AldrichF5554-4L
HEK 293AThermoFisherR70507
MDA-MB-231ATCCCRM-HTB-26
PRKDC-SCID動物資源センターSCIDF6
マトリゲルコーニング354234
イソフルランゾエティス26675-46-7
エタノール化学供給EA043-10L-P
リフレッシュ ナイトタイムアラガン1750D潤滑性眼軟膏
<ストロング>溶液<強い>組成
>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)NaH2PO4.2H2O(4 mM);NaHPO4 (16 mM);NaCl (0.12M)
FBS-DMEM 5% 不活化 FBS; 10 μg / mLペニシリン;100 μg / mLストレプトマイシン
されます にする

参考文献

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