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方法論記事

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

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DOI:

10.3791/57937

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2018年7月16日

 ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

この記事について

サマリー

プロテアーゼは、基本的な生物学的過程の調節不全プロテアーゼ活性ドライブ進行がんなど疾病の堅く調整された酵素です。このメソッドの目的は、プロテアーゼ活性測定体内ホスト尿から検出され、病気を差別胸の谷間信号を生成してナノセンサーを作成することです。

要約

プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解に特化し、恒常性と allostasis などを含む広範な生物学的プロセスを制御多機能酵素です。また、プロテアーゼ活性の調節不全病態をドライブ、癌などの疾患の機能性バイオ マーカーしたがって、プロテアーゼ活性体内を検出する機能には、生体に臨床的に関連する情報があります。このプロトコルの目的は、プロテアーゼ活性体内の尿で定量化可能な信号を生成することによってプローブ ナノセンサーを作成することです。2 つのコンポーネントから成っているこれらのプロテアーゼ ナノセンサー: ナノ粒子と基板。病気のターゲット サイトに循環の半減期と基板の供給を増やすためナノ粒子の機能。基材はターゲット プロテアーゼやプロテアーゼのグループに特定するように設計された短いペプチッド シーケンス (6-8 AA) です。基板は、ナノ粒子の表面に共役し、検出のための蛍光マーカーなど、記者が終了します。調節不全のプロテアーゼはペプチド基質を切断と記者はプロテアーゼ活性のバイオ マーカーとして定量化のため尿中にフィルターされます。ここマトリックスメタロプロテアーゼ 9 (MMP9)、腫瘍の進行および転移マウスモデルでの大腸癌の検出のために関連付けられているためナノセンサーの構築について述べる.

概要

プロテアーゼは、多機能酵素でペプチド結合の加水分解に特化し、恒常性、allostasis、病1など多くの生物学的プロセスを制御することです。様々 な病気、癌、心血管疾患、プロテアーゼ臨床バイオ マーカー2,3に開発の魅力的な候補者を作るなどするプロテアーゼ活性の変化の状態と相関しています。また、プロテアーゼ活性は機能的に異なるリンク病態、患者の転帰や病4の予後です。広く、さまざまな生物学的現象を検出するバイオ センサーを開発されているし、電子伝達、神経変性疾患、癌などの病気のプロセス5,6,7,8,9します具体的には、基質を用いたプロテアーゼ センサーは10を画像診断用蛍光プローブで、プロテアーゼの活性を検出するために開発されて、から体外のペプチド基質の同位体ラベル。質量11による検出。また、バインド対象プロテアーゼ12を変更する基板のような領域を含むアクティビティ ベースのプローブが開発されています。このメソッドは、ターゲット プロテアーゼは、アクティブ サイトを変更すると、組織は、生体内でアプリケーションの制限の収穫解析が必要と不可逆的阻害されます。プロテアーゼ活性の調節は内因性阻害剤の存在など他の生物学的活動のコンテキストに大きく依存するためしかし、プロテアーゼ活性生体内で、感知することが重要です。

この作業の目的は、尿で測定可能な信号を生成することによってプロテアーゼ活性体内検出アクティビティ ベース ナノセンサーの定式化を記述するためです。このプラットフォームは、機能性バイオ マーカーとして調節不全プロテアーゼ活性を用いた癌のような複雑な疾患を区別する非侵襲的診断として使用されます。私たちナノセンサー プラットフォームは、プロテアーゼの基質に共役酸化鉄ナノ粒子 (IONP) で構成されます。これらの基板は、プロテアーゼ切断基板とき解放される蛍光レポーターによって終了されます。これらの IONPs は、体内を循環させる、病変部位へをローカライズし、アクティブな疾患関連プロテアーゼに基板を公開します。胸の谷間後、蛍光レポーターは解放され、IONP に分解されていない基板のまま体のサイズが小さいため尿にフィルターが。したがって、プロテアーゼの活動生体内での増加は尿 (図 1) の報道記者の高濃度になります。当社のプラットフォームは、尿検査は、イメージング プラットフォームは必要なく、診断信号が尿中に濃縮されています。

このプラットフォームは、様々 な癌、線維症、血栓症13,14など病気を検出する設計することができます。ここで行列メタロペプチダーゼファミリー 9 (MMP9) の標高を検出するナノセンサーの設計について述べる大腸癌のバイオ マーカーとしての活動。大腸がんは、推定の 136,800 新しいケースと 2014年だけ1550,300 人が死亡、米国で癌死の 2 番目の主要な原因です。大腸腫瘍細胞を作り出す MMP9 悪性進展行列分解、転移16を駆動する示されています。さらに、私たちの文学17から MMP9 の適したペプチド基質 (PLGVRGK) を識別します。このプラットフォームは、がんの早期発見と低コスト ポイント ・ オブ ・ ケア診断13,14,18,19,20,21に使用できます。

figure-introduction-1
図 1: ナノセンサー活動In vivoのスケマティック。ナノセンサーは体内を循環し、病気のサイトにローカライズします。その後、病気関連プロテアーゼ クリーブ IONPs によって提示されたペプチッド基板です。劈開フラグメントのサイズは、尿中に局在することそれらを引き起こして腎クリアランスのことができます。動物が排尿後、これらのペプチド断片は、レポーター分子によって分析できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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プロトコル

研究員の機関で機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) から機関の承認は次の動物実験の実施に必要です。また、標準の動物診療施設 (例えば、住宅室、無菌動物フード、anesthetization、isofluorane 室と倫理的なエンドポイント euthanization の CO2室)、これらを適切に遂行するために必要です実験。これらの施設で特別な訓練お 1 つの機関で生理学的な研究所 (PRL) によってを提供できます。すべての動物の仕事は、ジョージア工科大学で IACUC によって承認された (プロトコル: A14100)。

1. 酸化鉄ナノ粒子 (IONP) 合成

注: 安全: 全体の酸化鉄ナノ粒子合成個人用保護具を使用して実行する必要があり、化学物質の下にドラフトチャンバーです。

  1. 15 mL の円錐管に 30 分間氷バケットに 30% アンモニア水 1 mL を冷やします。
  2. 250 mL の脱イオン水で三角フラスコを洗い、10 mL 二重蒸留水 (ddH2O) を追加します。攪拌/熱板で休んで氷浴でフラスコの外に浸します。DdH2O のフラスコに流れ N2ガスにプラスチック製のピペットを使用します。バブル deoxygenate N2で 15 分。
  3. デキストランの 224 µmol (4.5 グラム) の重量を量る (分子量 (MW) = 20 kDa) 50 mL コニカル チューブに。H2O は、デキストランを含む混合物の最終巻が 20 mL になるように追加します。精力的に、デキストランを溶解する渦。
  4. 鉄 (iii) 塩化物水和物の 290 µmol (78.5 グラム) の重量を量る、デキストラン ソリューションおよび溶解する渦に追加します。
  5. 0.2 μ m のフィルターを通して得られた溶液をフィルターします。
  6. 脱酸素水 9 mL に 1 mL チルド水酸化アンモニウムを転送します。4 ° C に戻る
  7. 鉄 (ii) 塩化四水和物の 367 µmol (73.0 グラム) の重量を量る、無酸素 ddH2O、1 mL に溶解し、0.2 μ m フィルターをフィルター処理します。
  8. 250 mL の三角フラスコに dextran-iron(III) ソリューションを転送し、15 分間氷の上 N2 deoxygenate。1600 rpm で回転バー電磁攪拌と混ぜます。
  9. 均質な窒素雰囲気を作成するには、ゴムキャップでフラスコをキャップします。穿刺中隔、18 ゲージのフラスコに流れ N2針。流れの出口として別の 18 g 針を挿入します。
  10. 1600 rpm で電磁攪拌棒でかき混ぜ、1 mL 注射器で鉄 (ii) 溶液の 467 μ L を dextran-iron(III) ソリューションに追加します。鉄 (iii) 鉄 (ii) のこの比率はマグネタイトや Fe3O4生成平衡反応の結果します。
  11. 冷えた希薄水酸化アンモニウム滴下21核生成プロセスを開始する鉄 (II) - 鉄 (III) - デキストラン ソリューションに追加します。確認各液滴を別の削除する前によくミックスします。水酸化アンモニウムの 1-2 の mL の添加後の反応を終了します。
  12. N2の流れを停止し、ゴムキャップを削除します。氷浴を削除し、ソリューションを攪拌しながらぬるま湯のお風呂で置き換えます。ソリューションの温度が 75 ° C に達することを確認し、75 分間インキュベートします。
  13. フラスコを攪拌/ホット プレートから外し、粗粒子を除去する 0.2 μ m、0.1 μ m のフィルターを通してソリューションを二重フィルターします。
  14. バッファーは、ddH2O、非常に粘性であるべきソリューションから余分なデキストランを削除するコンセントレーター (m.w.c.o.) 切断 100 kDa の分子量を使用して粒子を交換します。流れが暗いまま 2-3 回転後もフィルターが壊れている可能性があることを示す場合は、フィルターを交換します。
    1. スピン フィルターと exchange をバッファー、4800 X g で 4 ° C で 15 分間遠心、流れを破棄し IONP ソリューションに新しいバッファーを追加します。3-5 回繰り返します。
  15. 分光光度計/プレート リーダーを用いたナノ粒子の濃度を決定します。400 nm で使用この波長で IONP モル吸光度計測 (ε = 2.07 x 106 cm-1 M-1) IO 粒子の濃度を決定します。
  16. DdH2O (通常容量は 〜 3 mL) で 10 mg/mL に IONPs を再懸濁し、化学互換性のためこの手順にポリプロピレン チューブを使用することを確認します。5 M NaOH の 1.6 のボリュームを追加し、エピクロロヒドリンの 0.65 ボリュームを追加します。厳格な架橋デキストランを 12 時間室温でプレート シェーカーでミックスします。
  17. 18 ゲージ針で 20 mL の注射器を使用して 50 kDa m.w.c.o. 透析膜に IONP ソリューションを転送します。4 L ddH2O に透析膜を配置し、H2O は、いくつか回 (2-3 時間ごとに) を取り付けます。一晩インキュベートします。
  18. 濃度を測定し、5 mg/mL (手順 1.15 参照) に IONPs をもたらします。20% (v/v) に到達し、IONPs の表面をアミノ化する > 12 時間室温で振る水酸化アンモニウムを追加します。バッファー交換 30 kDa m.w.c.o. フィルター (1.14 参照) を使用します。
  19. 高速蛋白質液体クロマトグラフィーによる (FPLC; ゲルろ過カラムの参照テーブルの材料) 最終浄化する前に 2.5 から 3.5 mL にボリュームを調整します。
  20. 動的光散乱 (DLS) を使用して、IONPs (予想される範囲 10-100 nm、平均サイズ 40-50 nm) の流体力学的半径を決定します。早かったキュベットで希薄化後の IONP サンプル X 100 の 1 mL でこれを行う、マシンに配置、製造元のソフトウェアを使用して、測定を取る。
    注: IONPs の総人口が DLS による 10 と 100 nm 間が平均粒径は、40 ~ 50 nm の範囲のまわりの人口の大半は。1 つはサイズの範囲を制限する場合は、さらに異なる直径を持つ画分を分離するサイズ排除クロマトグラフィーを使用できます 1 つ。IONPs は 4 ° C で保存する必要があります。

2. ペプチド デザイン、IONP、およびIn Vitro検証に活用

  1. かに (FITC) など N 末端蛍光レポーターと C ターミナルのシステイン残基のチオールを介した結合を許可するターゲット プロテアーゼの (例えば、中核施設または商業的) ペプチド基質を合成します。
    注: MMP9 の今回の場合使用されるペプチドが FITC-PLGVRGK-C、k猫/Km 〜 105 M-1の-1x 2.0。
  2. 因数 (1 mg/mL) で IONP の結合バッファーにバッファー交換 0.5 mg (50 mM ホウ酸ナトリウム 1 ミリメートルの EDTA、pH = 8.5) 10 kDa m.w.c.o. スピン フィルター (手順 1.14 参照) を使用して。
  3. ジメチルホルムアミド (DMF) 〜 30 mg/mL の濃度に到達するために染色ヨード酢酸 (SIA) を溶解し、500 SIA:IONP のモル比で IONP に SIA を追加します。
    注: SIA は、heterobifunctional スルフヒ ペプチド基板上に IONPs のアミンの結合を仲介するリンカー クロス。
  4. 暗闇の中で室温で 1-2 時間インキュベートします。場合は一晩を残して、4 ° c. で孵化させなさい
  5. 未反応の SIA を削除するバッファーを結合に 10 kDa m.w.c.o. スピン フィルターを使用して exchange をバッファー (1.14 の手順を参照してください)。
  6. 1 mg/mL (0.5 mL ソリューション) に最終的な製品ソリューションをもたらします。90:1 (ペプチド: IONP) のモル比で興味のペプチッドを 20 kDa チオール終端ポリエチレング リコール (PEG) 20:1 (ペグ: IONP) のモル比で混ぜてください。IONP でこのペプチド ペグ ソリューションをミックスします。
  7. 最高速度、蛍光分子の退色を防ぐために箔の管を覆うプレート シェーカーで室温で一晩インキュベートします。
  8. 任意の未反応の SIA の分子を中和するために (C:IONP) 500: 1 のモル比で L システインを追加します。室温での最高速度でシェーカーの 25 ° C で 1 時間インキュベートします。
  9. FPLC を介して浄化 (1.1.19 を参照)。分光光度計を使用して、試料溶液の吸光度を測定し、以下の規則に従ってペプチド: IONP 比率を計算します。浄化、PBS で 4 ° C で 1 mg/mL 製品に保管します。
    1. 400 で試料溶液の吸光度を測定する分光光度計を使用して nm (サンプル 400) と波長 488 である使用、fluorophore の最大吸光度の FITC (サンプル 488) の nm。同じの 2 つの波長でストック アミン IONP 溶液の吸光度を測定 (400 nm、488 nm)、NP 400とNP、488それぞれ表されます。
    2. 式 1 と正規化された計算する 2 A400と488の値を使用します。
      figure-protocol-1式 1
      figure-protocol-2方程式 2
    3. 400と488サンプルの正規化された値を表します。ペプチド: IONP 式 3 との比率を計算するのにには、これらの値を使用します。
      figure-protocol-3式 3
    4. どこfigure-protocol-4とfigure-protocol-5、IONP の蛍光体、モルの日射吸収率は、それぞれ。これらの粒子のfigure-protocol-6= 2.06 106 M-1cm-1 x と FITCfigure-protocol-7だから 72,000 M-1cm-1を = の値figure-protocol-828.75 をする必要があります。代表的なペプチド: IONP 比は 20:1 ~ 50: 1 の範囲でなければなりません。
  10. 胸の谷間の in vitroアッセイを実行することにより、プローブの機能を検証します。
    1. PBS で (1 %bsa)、ペプチドの 200 nM 濃度 18 μ L ナノ粒子溶液を作る。興味のプロテアーゼの 2 μ L でミックス (MMP9; 0.1 - 1 mg/mL)。
    2. 1 時間、蛍光測定プレート リーダー 37 ° c でインキュベート (485 である適切な励起と発光波長を使用して、nm と 528 の FITC、nm それぞれ) 胸の谷間を監視するすべての 1-2 分。

3. ナノセンサーと癌の尿検出の管理

注: モデルの例の詳細については、当社の以前のレポート13を参照してください。

  1. 96 well プレートの上に円筒状のスリーブを保護することによって尿の代謝ケージを作成します。尿コレクション中にスリーブと動物の脱出を防ぐためにペトリ皿カバー付きカバー内でマウスを配置します。
  2. 滅菌生理食塩水でペプチド 3000 mg/kg (〜 50 µmol) の濃度でナノセンサーを含む注射剤 (200 μ L 最大音量) を準備します。
  3. 100 〜 300 の負担で異種 LS174T 大腸腫瘍を有する女性、8 週間の古い、裸のマウスの mm3、約で発生した必要があります 10 日、尾静脈注射を介してナノセンサー ソリューションの管理します。注入後すぐに代謝ケージにマウスを置くし、マウスの各注入時に注意してください。
  4. 注入後 60 〜 90 分、96 ウェル プレートからの円筒状スリーブを削除します。マウスを抑制し、プレート上に任意の残りの尿を無効にしてマウスを誘導するために膀胱にわずかな圧力を適用します。すべて尿 (200-500 μ L) を収集します。
  5. 尿から FITC を浄化し、感度を上げる免疫沈降によって尿のサンプルを分析します。アンチ FITC 抗体結合磁性ビーズを使用します。
    1. まず、磁性体ビーズ コーティング バッファーを 3 回 25 mg を洗うし、225 μ L に最終巻をもたらします。
      注: たびに、およびそれぞれの約 20 mL が必要な新鮮なコーティング バッファー (0.1 M ホウ酸ナトリウム、pH 9.5)、ブロック バッファー (PBS、0.5 %bsa、0.05% Tween 20、pH 7.4)、および洗浄液 (PBS、0.1 %bsa、0.05% Tween 20、pH 7.4) をすることが重要です。
    2. アンチ FITC (5 mg/mL) 200 μ L、200 μ L 硫酸アンモニウム (3 M) を追加します。37 C で回転で 16-24 時間インキュベートします。
    3. 磁気セパレーターにソリューションを追加、上澄みを除去、625 に置き換えますfigure-protocol-9Λ ブロック、バッファーし、37 C で一晩インキュベートします。洗浄バッファーで 3 回を洗うし、1.25 mL 洗浄バッファーに格納します。
    4. 5 μ L 磁気ビーズ (20 mg/mL) の尿の 2 μ L インキュベート容量 50 μ L の PBS をおこない (0.01% Tween 20)。60 分間インキュベートします。
    5. 50 μ L の PBS で 2 回洗って (0.01% Tween 20) 磁気分離装置を使用して各洗浄後磁気ビーズを収集します。
    6. 5% 酢酸の 32.5 μ L で 2 回溶出します。〜 7 の最終 pH を達成するために 2 M のトリスの 35 μ L でプールされた溶出 (70 μ L) を中和します。
    7. プレート リーダーで読む (材料表参照) 尿蛍光を定量化する適切な励起と放射の波長で。無料 fluorophore の既知濃度の梯子に対して蛍光レポーターの濃度を計算します。

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結果

IONPs の人口の大半は、平均粒径は、40 ~ 50 nm の範囲の周りです。Peg 修飾操作後、このサイズの範囲はおよそ 6 時間13 体内の循環の半減期 (図 2 a参照)。1 つは特定のサイズ範囲を選択する場合は、1 つサイズ排除クロマトグラフィーを使用して異なる直径を持つ IONP 画分を分離できます。TEM を用いたナノ粒子は、デキストランの外側の層で一緒に個々 の球状酸化鉄ナノ粒子の架橋として表示されます。13  IONPs のソリューションはない沈殿物とライトブラウン色が半透明で表示されます。後成功したペプチド、吸光度スペクトル解析に蛍光レポーターの最大励起波長の異なる吸光度のピークが明らかになります。FITC、場合これ中心になります約 488 nm (図 2b参照)。典型的なペプチド共役反応...

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ディスカッション

このメソッドでは、ナノ粒子のコアに共役プロテアーゼの基質から成るアクティビティ ベース ナノセンサーの開発について説明します。劈開ペプチッドプロダクト 5 nm23と非侵襲的信号を生成する尿にフィルターろ過数腎サイズより小さいので、蛋白質分解開裂のイベントは「薬物動態スイッチ」と呼ばれます。したがって、ナノ粒子またはキャリアが 5 よりも大きい流体力学的半径を使用する重要です nm 小さいものとしては腎臓によって急速にクリアされ、尿信号を混同します。彼らは FDA 承認、忍容されている、3-5 時間の循環の半減期を持っているので、我々 はペグインターフェロン IONPs を使用します。13ナノセンサーを策定のもう一つの重要な考察はペプチド基質のモル比ペグです。24,25の比率を増やすペプチド26, 立体シールドを通してターゲットをプロテアーゼによって固有でない胸の谷間を減らすが潜...

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開示事項

クォン博士共同創設者であり本稿に記載されている研究に関連して製品を開発している一端バイオ コンサルタントを提供しています。この研究が彼の個人的な財政の状態に影響を与えます。この整理の言葉が検討されており、その利益相反ポリシーに従ってジョージア工科大学によって承認されました。

謝辞

この作品資金が供給された NIH Director の新しいイノベーター賞受賞号DP2HD091793)。Q.D.M. は NSF 大学院研究奨学金プログラム (グラント号によってサポートされてDGE-1650044)。B.A.H は、ジョージア テック社長のフェローシップと同様、国家機関の健康 GT バイオマット訓練助成金受賞番号 5T32EB006343 の下でサポートされます。G.A.K. は、バロウズ社ようこそ基金から科学的なインターフェイスでキャリア賞を保持しています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 &マイクロ;mシリンジフィルターVWR4652
18G ニードルVWR89134-024
15 mL 円錐形VWR89039-670
250 mL 三角フラスコVWR89000-362
攪拌子VWR58949-006
ホットプレート/マグネティックスターラーVWR97042-634
氷酢酸VWR97064-482
ウシ血清由来アルブミン (BSA)サーモフィッシャーA13100
塩化鉄 (III) 六水和物シグマ236489
塩化鉄 (II) 四水和物シグマ44939
エピクロロヒドリンシグマ45340-500ML-F
DMFシグマD4551
アンモニウム水酸化物シグマ320145-500ML
水酸化ナトリウムペレットシグマ221465-500G
EDTAシグマE9884
ホウ酸ナトリウムシグマB9876
L-システインシグマ168149-100G
トリス-HClシグマT5941
トリス ベースシグマT6066
PBS錠シグマP4417
デキストランファーマコスモス5510 0020 9006
アミコン 15 mL 10k フィルター、24 個入りポアUFC901024
アミコン 15 mL 30k フィルター、24 個入りミリポアUFC903024
アミコン 15 mL 100k フィルター、24 個入りミリポアUFC910024
ゼータサイザー ナノ ZSMalvern PanalyticalNanoZS
Slide-A-Lyzer 透析カセットLifeTech66130
Dynabeads MyOne TosylactivatedLifeTech65501
SIALife Tech22349
PEG 20kLaysan BioMPEG-SH-20K-1g
フルオレセイン抗体 [2A3]GeneTexGTX10257
Hiload 16/600 superdex 200GE Healthcare45-002-490
プレート リーダーフィッシャーBTCYT5M
BD インスリン注射器フィッシャーNC0872854
ミリ

参考文献

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