このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

豚モデルでドレッシングの臨床評価のための重症熱傷

9.7K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/57942

⸱

2018年11月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Medical Sciences, National Defense Medical Center, 2Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 3Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 4Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Tri-Service General Hospital, 6Department of Nursing, Yuanpei University, 7Department of Physiology and Biophysics; Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

この記事について

サマリー

臨床的観察並びに動物モデルでの研究間の相互作用を火傷のモードが必要です厳密に模倣。この研究では、重症熱傷の豚の模型は、生理学的および病態生理学的設定で実験的ドレッシングを評価するために設立されました。

要約

創傷治癒動的修復プロセスは、最も複雑な生物学的プロセスは、人間の生活。火傷に対し、生物学的経路の変更については、創治癒遅延の結果、炎症反応を損ないます。切断などの好ましくない結果につながる糖尿病患者に発生障害は創傷治癒頻繁。それ故に、ドレッシングの焼跡の傷の修復を促進する上で有益な効果を持っていることが必要です。しかし、バーン創傷治療に関する研究は、適切な動物モデルの欠乏により制限されます。私たちの以前の研究は、低侵襲手術手技を用いてラットと豚モデルで創傷治癒のパフォーマンスを示した。この研究の目的は創収縮がなくなります重症熱傷の豚のモデルを示すとよりは近い人間再上皮化および新しい組織の形成過程。このプロトコルは、一貫性のある熱傷創面を作成および豚モデルでの実験的ドレッシングの治療下で創傷治癒のパフォーマンスの調査のための詳細な手順を提供します。6 熱傷創面作成された対称的に、背部の臨床ドレッシング 4 つの層から成る対象: 実験材料、防水フィルムの内側の中間層、ガーゼ、外側の中間層、内側の接触層絆創膏の外側の層。実験完了、傷口の閉鎖、創傷部、バンクーバー傷跡スケール スコアを調べた。各動物の後犠牲から切除した皮膚のサンプルは、組織学的調製し、ヘマトキシリン ・ エオシン染色を使用して染色します。各ドレッシング創傷治癒のコンテキストでの抗菌活性を調べた.豚モデルで傷に臨床のドレッシングの適用は人間の創傷治癒の上皮形成、細胞増殖と血管新生のプロセスについての生物学的プロセスを模倣します。したがって、この豚モデルは、重症熱傷で臨床ドレッシングの効果を評価するために簡単に学ぶこと、コスト効果の高い、かつ堅牢な方法を提供します。

概要

焼跡の傷害は炎症性プロセスを開始し、患者の生活の質にマイナスの影響の結果として、事故の直後から多くの身体機能に影響を与える複雑な病理学的効果を誘導します。糖尿病1,2重要な罹患率と患者の死亡率を引き起こす障害は創傷治癒します。熱傷患者のほとんどは、強力なオピオイド鎮痛剤3の使用にもかかわらず耐え難いプロセスとして知られている熱傷創傷清拭中に痛みを経験します。

他の哺乳動物と対照をなして豚は上皮形成、細胞増殖と血管新生のプロセスに関して人間といくつかの解剖学的および生理学的特性を共有します。これにより特定の手順と研究、潜在的により良いモデル、豚、ねずみの有望な結果を示したその後の研究で使われています。これらの機能は、前臨床試験で主要な種として豚の使用の増加につながっています。最近、4,5,6に心血管、尿路、外皮、尊敬と消化器系の生物医学の研究の急速な増加が観察されました。本研究は、重症熱傷創収縮がなくなります、新しい組織の形成と人間の創傷治癒プロセスの近い近似を提供の豚モデルの実証を目指しています。6 熱傷創面は背部、豚の背骨の両側に 3 つの対称的に作成されました。次に、屋内用ロールシェイド ドレッシングを合わせる人間の創傷治癒 (図 1) を複製することができる重症の熱傷の豚モデルで調べた。傷は、4 つの層で構成されている臨床ドレッシングで覆われていた: 実験材料の内部接点層、防水フィルムの内側の中間層、ガーゼ、外側の中間層、絆創膏の外側の層。防水フィルムは、細菌感染を防止するとドレッシングに浸透してガスを許可する湿潤創傷環境を保持します。ガーゼの外側の中間層は、防水膜に適用され、絆創膏の外側の層で保護します。実験の完了時の創傷閉鎖、創傷部、バンクーバー傷跡スケール (VSS) スコアを調べた。各動物の後犠牲から切除した皮膚のサンプルは、組織学的調製し、ヘマトキシリン ・ エオシン (HE) 染色を使用して染色します。このモデルの各ドレッシング創傷治癒のコンテキストでの抗菌活性を調べた.私たちの以前の研究は、ネズミと豚を用いた低侵襲手術手技7で創傷治癒のパフォーマンスを示しています。6 書き込む各豚内甲の傷があったので、各実験のドレッシングはテストされ、豚背に別のスポットで創傷治癒過程に関連するバイアスを最小限に抑えるためにすべてのポジションで評価。したがって、本研究で重症熱傷の豚の模型は臨床ドレッシングの評価のための新しいアプローチを提供します、熱傷に対する新規治療の開発が容易になります。本研究では、熱傷創傷治癒の病態生理を明らかにする重要なツールを提供します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

動物を対象とする手順は、国防医学院、台湾 (中興) で動物ケア委員会によって承認されています。本研究は、国防医学院で実験動物センターで行った。20 と 25 キロの間の重量を量る豚が正常にこのプロトコルを使用してインストルメントされています。

1. 人間の処理に動物の適応

  1. 施設に到着後, 家動物の孤独が互いに相互作用させます。
  2. 動物の自由への食料や水を提供します。
  3. 少なくとも 1 週間日に 1 回の動物を処理することによって実験室の動物の機能から人間の処理、交通機関に豚を順応させます。
  4. 吐き気や嘔吐、胃の液体の吸引を防ぐために手術の前に少なくとも 12 時間動物を絶食します。

2. 鎮静

  1. 傷やけど作成する前に、動物を介してZoletil 50 (25 mg/kg) を静脈内注射落ち着いた。

3. 気管挿管と換気

  1. テーブルや胸骨の位置でトロリーに動物を配置します。
  2. 経口スプレッダーと動物の口を開きます。
  3. 嚥下反射の有無を顎の不足の緩和の場合では挿管、マスクと鎮静作用を誘発するイソフルレン豚を妨げます。
  4. 生理学的な信号のモニターによって潜在的な合併症を防ぐために手術中に血圧、心拍数と体温を監視します。

4. 麻酔

  1. 誘導し、維持麻酔;できればチレタミンとチレタミン (25 mg/kg + 25 mg/kg) の投与による動物を麻酔します。
  2. 気管内チューブと動物を挿管時筋弛緩、顎の緊張の喪失によって特徴付けられ、そして眼瞼下に反り返った、観察されました。
  3. 0.5 – 2.5 の気化器設定で麻酔状態ですべての豚を維持 % (v/v) イソフルラン手術終了時まで。
  4. 手術前に後ろ足のつま先のピンチと痛みの反射神経をテストすることによって麻酔の深さを調べます。必要に応じて、追加の麻酔を追加または数分待ちます。定期的に手術中痛み反射神経をチェックします。

5. 手術部位の消毒

  1. 剃るし、両側腋窩に脊柱から約 25 cm 幅の領域に動物の皮をきれい。
  2. ポビドン ヨードのスクラブ (75 mg/mL) 約 5 分でしっとり肌をスクラブします。
  3. 濡れた滅菌ガーゼを使用して皮膚からポビドン ヨード石鹸を削除します。
  4. ポビドン ヨード ローション (100 mg/mL) で皮膚を消毒します。
  5. 細菌の転送と手術部位の後の汚染を削減する滅菌外科用ドレープの動物をカバーします。

6 バーン創傷作成

  1. ブタの背に対称的に六つの熱傷創面の中心をマークするのに外科用のマーカーを使用します。各やけど間の距離は、少なくとも傷 (図 1 a) の半径より大きいことを確認します。
  2. グリセリンの 50 mL の変更されたはんだごてを入力し、温度を監視する電子温度計を挿入します。熱いアイロンでは、約 9 cm2 (図 1 b) の平らな区域を所有しています。
  3. ホット プレート (図 1) を備えた鉄 137-139 ° C に熱する。
  4. 30 秒 (図 1) のすべての力を適用することがなくマークされた領域に鉄を置くことによって六つの均一な熱傷創面を作成します。
  5. 0.9% 生理食塩液 (図 1) を熱傷創面を洗浄します。
  6. 傷の寸法を測定し、ただし (図 1E) によって傷を記録します。

7. ドレッシングの準備

  1. 直接接触を介して 4 層臨床ドレッシングの内部接触層でそれぞれの傷をカバーしてください。このレイヤーのキャップを含むドレッシングや代替材料 (図 1 f) を使用します。
  2. 細菌の侵入 (図 1 f) に対するバリアとして機能する臨床のドレッシングに防水フィルムを適用します。
  3. ガーゼ (0.5 cm) 各傷をカバーし、ドレッシング (図 1) の中間層として機能する紙テープで固定します。
  4. ガーゼと絆創膏の外側の層を保護します。ドレッシングの変位を避けるために胴体にこのレイヤーを拡張 (図 1 H-1 j)。

8. 後燃焼ケアと測定

  1. すべて 8-12 h の 1 週間、麻酔から回復する前に潜在的な痛みを軽減するための痛み管理のためブプレノルフィン (0.1 mg/kg、IM) と豚を注入します。
  2. 飼料し、水に豚の無料アクセスをできます。
  3. 最初の 10 日間ごとに 2 日間臨床ドレッシングの変更その後 6 週の週二回の研究します。
  4. 清潔度を臨床的ドレッシングを再適用する前に傷を測定します。ドレッシングの変更時に麻酔薬を管理します。
  5. 最初の 10 日間ごとに 2 日間ただし創傷治癒率の比較によって傷を記録し 6 週週 2 回勉強。
  6. 傷再上皮化または収縮前に説明した方法に従って元の傷のサイズのパーセンテージとして計算します。二重盲検の方法で傷の閉鎖の分析を行った。
  7. 4 つの変数から成っている VSS を使用して熱傷瘢痕の測定: 0、7、21、および 42 の火傷後日色素沈着、柔軟性の高さ (厚さ) 血管。各変数には 4 ~ 6 点。合計得点範囲は 0 から 14、0 のスコアが反映しているという正常な皮膚。

9. 火傷後組織の細菌の増殖実験

  1. 火傷後日 0、7、21、および 42 の抗菌力試験のため傷、綿棒します。
  2. 0.9% 滅菌生理食塩と優しく均一な懸濁液を達成するために渦の 100 mL に綿棒を配置します。
  3. 直列 (10− 1– 10−5) 磨砕液を希釈し、それぞれ選択的かつ非選択的メディアにおけるそれぞれの希釈 100 μ L をプレートします。
  4. 24-72 時間インキュベートする 37 ° C で好気性の条件の下ですべての希薄。
  5. プレート 5% 羊血液分離好気性グラム陽性菌に添加した血液寒天培地プレート上にすべて希釈から 10 μ の帳票因数。
  6. 拡散またはコロニー形成数を決定するために夜通し寒天プレートの表面に均一にサンプルを注ぐことによってサンプルをインキュベート ユニット (CFUs)。
  7. 一晩インキュベートした後、プレートを読みます。羊血液寒天培地プレートを反転し、皿の底をマーカーと小さな定規を使用して同等の 4 つの象限に分割します。
  8. 解剖顕微鏡のステージ上にプレートを置き、各プレートのコロニーをカウントします。定義では、植民地を列挙できる 300 CFU の最小値が必要です。
  9. それぞれ 3 つのレプリケートの細菌のコロニーをカウントします。3 つの平均値の複製を計算します。最終希釈倍率の平均値を乗じてプレートごと CFU を決定します。

10. 安楽死とティッシュの固定

  1. ナトリウム ペントバルビ タール安楽死ソリューション (80-120 mg/kg) の過剰摂取を静脈内注入します。
  2. En のブロックには、基になる筋肉、周囲の無傷の組織にやけど傷組織の切除を実行します。
  3. 10% 中性緩衝ホルマリンで組織を固定します。
    1. リン酸緩衝液 (PBS) と 4 ° C でストアの 90 mL でホルムアルデヒド (37%) の 10 mL を混ぜてください。
    2. 定着剤に組織を転送し、すべての組織が定着剤に完全に没頭していることを確認するためのコンテナーを旋回します。固定液の量は、組織量の 30 倍の量をする必要があります。
    3. 4 ° C で一晩組織を修正します。
  4. 脱水エタノールと組織、パラフィン ブロックに埋め込みます。シェーカーで 4 ° C で次の手順を実行します。
    1. 30 分間を PBS で 2 回洗います。
    2. 脱水組織の 70% エタノール 95% エタノール, 80% エタノール一晩 8 時間 8 時間とし、100% エタノールで一晩。
    3. 100% エタノールで組織にさらに 8 時間孵化させなさい。
    4. 組織それぞれのキシレンの 3 つの変更で 30 分間インキュベートします。
    5. キシレンを溶かしたて (52 ° C) ワックスに置き換えるし、オーブンで 52 ° C で 1 時間インキュベートします。
    6. 新鮮なワックス、ワックスに置き換えると, オーブンで 52 ° C で 3 時間、もう一度交換し、52 ° C で一晩インキュベートします。
    7. 各ワックスの 2 つのより多くの変更と組織を 1 時間インキュベートし、ティッシュを埋め込む、4 ° C で保存
  5. カットで彼、パラフィン切片を染色し、を介して100× 倍率顕微鏡可視化します。
    1. 回転式ミクロトームを用いたパラフィン切片を作成します。
    2. 3 分間それぞれのキシレンの 3 つの変更を使用してセクションを dewax します。
    3. 100%、95%、80%、70% のエタノールと組織を 3 分間、水分補給し、蒸留水で浸します。
    4. 10 分間、ヘマトキシリンで染色し、水道の流水ですすぎ。
    5. 5 分間、0.1% 塩酸エタノールと区別するため、水道水ですすいでください。
    6. 1 分 0.5% エオシン染色します。
    7. 2 分の 70%、80%、95%、100% エタノールで組織を脱水します。
    8. キシレンと染色をクリアし、発煙のフード乾燥します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

熱い鉄で 30 秒の書き込み期間は、明確に定義されたマージンと循環され、紅斑 (図 1) の縁を均一に薄い傷で起因しました。それぞれの動物の内で背部の六やけど傷があった。熱傷創面の配置は、図 1 Kで描かれていた。やけどの傷が完全にキャップを含むドレッシングで覆われ、火傷後日 0、7、21、および 42 の瘢痕形成の深さを評価するために使用し、によって決定される、再上皮化総検査。熱傷創面は、火傷後 42 日目の総検査に基づいて再 epithelialized でした。これらの動物の創傷サイズは創傷治癒率 (図 2 a) を決定する評価しました。創傷部であった 9、10、8、および 3 cm2 0、7、21、および 42、火傷後の日.創傷部の大幅な削減は、火傷後 0 日と比較して 42 日目に観察されました。治癒率は、最大平均傷マージン中心からの距離、傷傷の閉鎖を完了する時間...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究は重症熱傷の豚の模型を設立し、キャップを含むドレッシングを使用してモデルを検討しました。この豚モデルを抗菌プロパティを含む実験のドレッシングの臨床のパフォーマンスを監視する使用ことができることが示唆されました。創傷治癒率、傷の閉鎖、および抗菌活性も VSS、H & E 染色、抗菌テストを使用して行った。動物燃焼モデルの使用は、熱傷の病態生理を確認する貴重なツールとして開発されました。ラット特定試薬の数が多いと回復でアクティブな分子のシグナル伝達経路を発見するトランスジェニックラットを取得のための実技を含めて、実験の被験者としてラットを使用して特定の生物学的利点があります。プロセス。しかし、動物燃焼モデルのラットを使用しての主要な不利な点は完全に人間の創傷治癒過程を近似するための失敗です。再上皮化は、迅速な方法9創収縮異なりますが創傷治癒過程における強く人間8観察メイン治癒アプローチです。さらの非脆弱性ラットに肥大やケロイド瘢痕形成は人間の傷の回復過程の非類似度を確認しました。その一方で、豚研究の対象となっている最近肌アーキテクチャは人間...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は三サービス総合病院; からの助成金によって支えられました。国防医学院、台湾 (TSGH-C107-042);省の科学と技術、台湾 (ほとんど 106-2314-B-016-014);国立防衛医療センター (MAB-106-055;MAB-106-010;MAB-107-064)。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
鎮静:
ケタミンメリアル2528 ESP10 mLバイアル
ザペロン中国化学&医薬品47W406100 mLバイアル
アトロピン オリエンタルケミカルワークIN120802 1 mL バイアル
<ストロング>麻酔薬:
チレタミン+ゾラゼパムビルバックBC915 mL
バイアル イソフルランバクスターN002A225100 mL バイアル
<ストロング>手術:
バリカンモーザー--
ポビドンヨウ素スクラブ溶液エバースターHA1612024 Lバレル
変性鉄--
-0.9%生理食塩水CHI SHENGKC130500 mL バイアル
ガーゼ中国外科用包帯センターMO15900080 10 x10 cm
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan-
-紙テープ3MNDC-8333-1530-012.5 cm x 9.1m
防水フィルム3MNDC-8333-1600-4010 cm x 10 cm x 10 m
絆創膏ヤングケミカルBH142601510 cm x 10 m
<強>解剖:
標準的なシャープ/鈍いストレートハサミのペア(14 cm)シャインテック機器ST-S114-
ハルステッド-モスキート(12.5cm)シャインテック製器具ST-H012-
ハンドル(#4)シャインテック製器具ST-H004-
サージカルブレード(#21)シャインテック製器具ST-B021-
<ストロング>ポストフィクセーション&保存方法:
50mlプラスチック遠心分離管 Falcon352070-10
% 中性緩衝ホルマリンライカ3800604EG-
細菌増殖実験 
血液寒天プレート(BAP)(羊の血液を5%含むTSA) CMP-90mmモノラル
アス

参考文献

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17, 763-771 (2009).
  2. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regeneration. 17, 1-18 (2009).
  3. Verhaegen, P. D., et al. Differences in collagen architecture between keloid, hypertrophic scar, normotrophic scar, and normal skin: an objective histopathological analysis. Wound Repair Regeneration. 17, 649-656 (2009).
  4. Experimental Surgery and Physiology: Induced Animal Models of Human Disease. Swindle, M. M., Adams, R. J. , Williams and Wilkins. Baltimore. (1988).
  5. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames. (1992).
  6. Advances in Swine in Biomedical Research. Vols 1-2. Tumbleson, M. E., Schook, L. B. , Plenum Press. New York. (1996).
  7. Wang, C. H., et al. Enhanced wound-healing performance of a phyto-polysaccharide-enriched dressing - a preclinical small and large animal study. International Wound Journal. 14, 1359-1369 (2017).
  8. Rowan, M. P., Cancio, L. C., Elster, E. A., Burmeister, D. M., Rose, L. F., Natesan, S., Chan, R. K., Christy, R. J., Chung, K. K. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Journal of Critical Care. 19, 243(2015).
  9. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 969618, 8(2011).
  10. Gaines, C., Poranki, D., Du, W., Clark, R. A., Van Dyke, M. Development of a porcine deep partial thickness burn model. Burns. 39, 311-319 (2013).
  11. Gnyawali, S. C., Barki, K. G., Mathew-Steiner, S. S., Dixith, S., Vanzant, D., Kim, J., Dickerson, J. L., Datta, S., Powell, H., Roy, S., Bergdall, V., Sen, C. K. High-resolution harmonics ultrasound imaging for non-invasive characterization of wound healing in a pre-clinical swine model. PLoS One. 10 (3), e0122327(2015).
  12. Eaglstein, W. H., Mertz, P. M. New methods for assessing epidermal wound healing: the effects of triamcinolone acetonide and polyethelene film occlusion. Journal of Investigative Dermatology. 71, 332-384 (1978).
  13. Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Sciences. 25, 1-10 (1998).
  14. Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging and Experimental Techniques. , 2nd ed, CRC Press. Boca Raton. (2007).
  15. Mertz, P. M., et al. IL-1 as a potent inducer of wound re-epithelization. Progress in Clinical and Biological Research. 365, 473-480 (1991).
  16. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translation Medicine. 6, 265-266 (2014).
  17. Aryza, M. J., Baryza, G. A. The Vancouver Scar Scale: an administration tool and its interrater reliability. The Journal of Burn & Rehabilitation. 16, 535-538 (1995).
  18. Bystrom, A., Claesson, R., Sundqvist, G. The antibacterial effect of camphorated paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of infected root canals. Endodontics & Dental Traumatology. 1, 170-175 (1985).
  19. Reig, A., Tejerina, C., Codina, J., Hidalgo, J., Mirabet, V. Application of a new cicatrization dressing in treating second-degree burns and donor sites. Annals of Burn and Fire Disasters. 4, 174(1991).
  20. Hindy, A. Comparative study between sodium carboxymethyl-cellulose silver, moist exposed burn ointment, and saline-soaked dressing for treatment of facial burns. Annals of Burn and Fire Disasters. 22, 131-137 (2009).
  21. Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
  22. Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 13505-13510 (2009).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

豚熱傷モデル熱傷創傷治癒創傷閉鎖測定バンクーバー瘢痕尺度組織学的検査細菌培養分析グリセリン加熱鉄滅菌生理食塩水粘着性絆創膏ドレッシング
豚モデルでドレッシングの臨床評価のための重症熱傷
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。