ショウジョウバエ幼虫の温度設定を決定する温度勾配試験

サマリー

ここでは、連続的な温度勾配を利用したショウジョウバエ幼虫の最寄りの環境温度を決定するプロトコルを提案する.

要約

ミバエショウジョウバエを含む多くの動物は、肥えた最寄り熱風景を模索することができます環境温度のわずかな違いが可能です。幼虫の温度の設定を定義すると、定義された線形範囲にわたって、温度勾配を使用してアッセイを開発しました。単一方向のグラデーションを確立するには、2 つのアルミ ブロックは個々 のブロックの温度を制御する独立した水のお風呂に接続されます。2 つのブロックは、グラデーションの上下限値を設定します。温度勾配は、プレート間の距離にまたがる 2 水制御ブロックをアガロース コーティング アルミ プレートを配置することによって確立されます。水ブロックの上に設定されているアルミ板の両端の最小値と最大温度を定義および中間の地域 2 つのブロックを形成する線形温度勾配。グラデーションのアッセイの幼虫に適用できるし、TRP チャネルと温度差別に必要なオプシン遺伝子に影響を与える突然変異などの表現型を示す変異体を識別するために使用することができます。

概要

モバイル動物によって温度走性を採用して、最も有利な条件^1,2,3環境を選択します。過度に熱いまたは冷たい気候になった場合、この動作は生存に不可欠です。さらに、多くの動物は快適な範囲の温度の非常に小さい相違に敏感であるし、理想的な温度環境を模索します。これは、環境と自分の体の温度を平衡ショウジョウバエなど poikilothermic 生物にとって特に重要なのです。幼虫の温度走性を監視するための試金は識別し、ショウジョウバエ一過性受容体電位 (TRP) チャネル^4,5,6など分子センサーの役割を明確に尽力しています。ロドプシン^7、8、およびイオン型受容体受容体 (IRs)⁹、異なった温度較差上の温度感度を持つこれらの動物のため。

双方向の選択のテストは、幼虫^6,

プロトコル

1. 装置製作・ グラデーション アッセイ用組立装置

1. 単一方向のグラデーションの試金のためのアルミニウム アッセイ プレートを作製します。
   1. トリムしバンド鋸を使用してアルミニウムの単一部分から各アルミ アッセイ プレート (図 1 a) を挽くし、シャープの次の次元を持つ垂直ミル: 外側のサイズは 140 × 100 × 9 mm、内側のサイズは 130 × 90 × 8 mm (図 1 b)。幼虫を視覚化し、錆を防止しやすく、黒の塗料で各アッセイ プレートの内側をアルマイトします。
      メモ: 単一方向のグラデーションのアルミニウム アッセイ プレートの作製は、マシン ショップによって行われます。商用ベンダーによって、陽極酸化処理が実行されます。
   2. 13 分界、永久的なマーカーを使用して 10 mm で区切られた各アッセイ プレートの上部と下部のリムをマークします。アッセイ プレート (図 1 a, B) の最初と最後の分界内側の端から 5 mm を配置します。
2. 双方向のグラデーションのアルミニウム アッセイ プレート作製、板金鋏を使用して次の次元を持つアルミ板をカット: 250 x 220 x 2 mm. アルマイ....

結果

18 ° C から 28 ° C の単一方向を確立するには、グラデーション、2 つの水のお風呂の温度を 16.8 ° C と設定 31 ° C我々 はすべての 6 ゾーン、ゾーン間の境界線の上部と下部の部分内の 26 の位置に agarose のゲルの表面 (図 2, 2 e) の極端な両端の温度を測定することによって 13 点の温度を取得します。グラデーションの温度分布はほぼ線形 (Y = 0.9672 * X + 16.19、R² = 0.9961) (図 2 e)。

我々 は様々 な年齢での制御 (w¹¹¹⁸) の幼虫の温度の設定を試金。1^st (24 ± 1.5 h AEL)、2^nd (4.......

ディスカッション

このプロトコルの成功を確保するため、幼虫の実験を行うための十分な番号を取得する手順を取ることが重要です。あらかじめ産卵を改善するために 2-3 d 酵母貼り付け含むバイアル中のハエを餌が含まれます。バイアルは水の瓶を含むトレイに置かれ、食品の水分を保持し、通常の光サイクルへの露出を確保しながらの幼虫によって効果的な摂食を促進する透明なプラスチック袋に封入する必要があります。ただし、ハエが引っかかるので、ソフトに酵母ペーストしないでください。バイアルあたりの女性の数は遺伝子型に依存します。W¹¹¹⁸、場合通常 12 〜 女性と 〜 6 男性 3 h の卵を産むために十分なです。通常 2 バイアルは単一方向の試金のため十分な幼虫 (幼虫 100-200) 皿の上に配置するを提供します。フライのストックが野生型よりも少なく卵を産むか、孵化幼虫の割合が減少 (30-35/バイアル) まで追加女性と男性を追加します。

これらのアッセイを実行するとき、予期せぬ変動の多くの原因があります。発達段階、幼虫の温度選好に影響を与えます。したがって、定義された段階.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
グラジエントアッセイ装置
PolyScience 9106, 冷蔵・加熱 6L 循環バス	Thomas Scientific	9106	このモデルは販売を終了しています。更新された交換モデルには、120 V、60 Hz用の1186R00および1197U04、または240 V、50Hz用の1184L08および1197U04が含まれます。
アルミニウムアッセイプレート(単一方向グラジエント用)			外寸:14 x 10.1 x 0.9 cm、内寸:12.9 x 8.7 x 0.8 cm、黒色アルマイト。
アルミプレート(双方向グラデーション用)			25 x 22 x 0.2 cm、ブラックアルマイト。
アルミブロック			の外形寸法:25.5 x 5 x 1.4 cm、内部チャネルのパラメータを図1Dに示します。
アルミブロックとチューブ用コネクタ	McMaster-Carr	91355K82
Tygon サニタリーシリコンチューブ	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	カタログ番号	<>strong>コメント
>Itemsアッセイ用試薬
Pestle	USA Scientific	17361	1.5 mL 微量遠心チューブ用乳棒
温度計	Fluke	51II
熱電対		Fluke K タイプ
ユニバーサルマイクロプレート蓋	Corning	6980A77
35 mm ディッシュ	Corning	9380D40
ラベリングテープ(双方向グラジエント用)	フィッシャーサイエンティフィック	15-951	フィッシャーブランドラベリングテープ 2 in x 14 yds
アガロース	インビトゲン	16500500	1%溶液を調製
ショ糖	シグマ	S0389-5KG	アッセイ開始直前に18%溶液を調製
ペイントブラシ	フィッシャーサイエンティフィック	11860
50 mL 遠心分離チューブ	デンビル	C1062-P
スクープラ	フィッシャー サイエンティフィ	14-357Q
500 mL 丸型広口ボトル	パイレックス	1395-500
セルストレーナー (300 mm 細孔)	PluriSelect	43-50300	幼虫洗浄用オプション
段ボール箱 (バイアルトレイ)	ジェネシー サイエンティフィック	FS32-124
Name	会社	strongカタログ番号	コメント
ショウジョウバエ food
蒸留水			22,400 mL
コーンミール、イエロー(極細メッシュ、植毛) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1,609 g
ブリューワーズ酵母 100 ポンド	MP バイオメディカル	ICN90331280	379 g
NutriSoy®大豆粉 (10 kg/unit)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila 寒天、Type II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo light corn syrup	Karo		1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (200プルーフエタノールに懸濁	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
リン酸 ACS試薬、≥H2O Sigma	Aldrich	438081-500 mL	8.5 mL 中 85 wt

ック ). %