酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

サマリー

アレイ プラスミド ライブラリを使用して出芽酵母の発現スクリーニングを容易に交配に基づく手法を提案します。

要約

出芽酵母は、人間の病気と関連付けられる蛋白質の勉強にモデルとして広く使用されています。ゲノム遺伝学的スクリーニングは、酵母の研究でよく使用される強力なツールです。酵母における神経変性疾患関連タンパク質の発現を引き起こす細胞毒性と会合体形成、これらの障害を持つ患者で見られる所見をさたします。ここでは、その毒性の修飾子の筋萎縮性側索硬化症関連タンパク質 FUS の酵母モデルをスクリーニングするための手法について述べる。変換を使用する代わりにこの新しいスクリーニング プラットフォームは酵母酵母モデルへのプラスミド配列ライブラリの導入の合うことに依存しています。交尾のメソッドは 2 つの明確な利点: 最初に、それは非常に効率的な;第二に、プラスミドの変換前の配列ライブラリ格納できるグリセロール ストックとして長期の酵母モデルに変換の手間のかかるステップなし他の画面にすぐに適用されるたびに。このメソッドを正常に使用する方法を示す変更 FUS の毒性遺伝子のスクリーニングに。

概要

出芽酵母酵母は、直接人間の病気に関連して細胞のプロセスを理解する基本的な科学研究¹で広く使用されています。さらに、それ使用されていますモデル生物として、最も一般的な神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側を含むにリンクなど、ヒトの疾患関連タンパク質を勉強横方向性硬化症 (ALS) の²。酵母モデルの利点は、ゲノム広い画面がこのように毒性のメカニズムへの洞察力を与えて、疾患関連蛋白質の毒性に関連する細胞の経路を識別するために行うことができます簡単です。このような 1 つの画面は、どの遺伝子が過剰に発現すると、毒性を変更できますを識別するために酵母のモデルに変換はそれぞれ配列ライブラリで 5,500 酵母遺伝子の過剰発現のライブラリ画面と呼ばれます。このスクリーニング法は、複数神経変性疾患関連蛋白質のハンチントン病³パーキンソン病^{4,5 α-シヌクレインの huntingtin を含む酵母モデルで正常に適用されています。}、アルツハイマー病⁶FUS と ALS^7,8,9の TDP 43 a β。通常、高スループット方法¹⁰で行われますが、画面の最も労働集約的なステップの 5,500 の酵母の遺伝子配列ライブラリから個別に変換です。上映が繰り返されるたびにこの手順を実行する必要がありするたびに新しく設立された酵母モデルは調査される必要性します。このタスクを実行するより効率的な方法を見つけることが重要です。

酵母は半数体と 2 倍体の両方の形態で安定に存在できます。交配交配型単相の細胞のタイプの反対の 2 つがある、および α。 各交配の細胞の倍加の食材を入力して反対側に嵌合型細胞のみが対応、独自の特定交尾フェロモンを分泌します。これはの間で合うことができますと α/α は、安定した二倍体細胞を生成する細胞。このプロセスは、自然と非常に効率的な¹¹です。出芽酵母プラスミド ライブラリを紹介するこのユニークなライフ サイクルを利用することができます。具体的には、各遺伝子プラスミド配列ライブラリでは 1 つの交配型、すなわち、α 細胞の半数体の細胞に変換されます。ライブラリの遺伝子を含むこれらの細胞は、アレイの 96 ウェル フォーマットのグリセロール ストック保存されます。グリセロール ストックから、選別する必要がある各酵母モデルのライブラリ遺伝子を含む酵母細胞を解凍できるし、逆交配型,すなわち, 交配型の興味の酵母モデルとの交配によって、スクリーニングを行うことができます。酵母に一緒に 2 つの遺伝子を持って交配を使用してのこの考えは新しくないです。高スループット酵母ツーハイブリッド法、餌が 1 つの交配型 (すなわち、Gal4 DNA 結合ドメイン融合) 構築を一緒に配列ライブラリから獲物コンストラクトの交配によってもたらされる正常に適用されています。¹²します。 ただし、この戦略は決して過剰発現ライブラリ上映は、伝統的な変換方法は常に使用に適用されています。

私たちの研究室は以前 ALS 関連タンパク質 FUS⁷の酵母モデルを確立しました。変換法を用いた発現ライブラリ スクリーニングを通じて高い FUS の毒性を救う 5 つの酵母遺伝子 (ECM32、NAM8、SBP1、SKO1、およびVHR1) を発見しました。これらの所見が独立してによって確認された同様の調査で別のグループ⁸。hUPF1、 ECM32の人間の相同物は初代神経細胞¹³と ALS¹⁴と同様の動物モデルでの毒性を抑制して後で示されました。これらの 5 つの遺伝子を使用すると、原則の証拠として、交配による FUS 酵母モデルに導入している場合すべての 5 つの遺伝子が同様に FUS 毒性を救出を紹介します。ライブラリの遺伝子を含む酵母細胞はグリセロール ストックで永続的に保存でき、必要な時に復活、以来この交配に基づくメソッドの変換ライブラリに対して上映するたびに時間がかかるステップが削除されます。交尾は関与プラスミド変換効率が高いため、この戦略は精製と大型プラスミド ライブラリの変換に関連付けられているコストも大幅減少します。FUS の酵母モデルに対するスクリーニング ライブラリにこのメソッドが正常に適用されます。

交尾ベースのスクリーニングの手順は、図 1で簡単に説明します。当初は、アレイ プラスミド ライブラリは、96 ウェル プレートの各ウェルに特定のライブラリ プラスミドで形質転換酵母が含まれている高スループット イースト変形のプロトコルを使用して型 α を交配の半数体酵母に変換されます。変換された酵母のこのコレクションは、解凍して使用後に復活できるグリセロール ストックとして保存されます。反対の交配型と半数体酵母の関心は、このケースの FUS 毒性の酵母モデルを生成する必要が (交配型、)。滅菌の 96 ピン レプリケーターを使用して高スループット方法で FUS ひずみと酵母プラスミド ライブラリを含むがリッチ ・ メディアを含む 96 ウェル プレートに転送され、仲間にできます。次の交尾、それぞれから少量交尾文化の井戸が両方の FUS を含むどのだけ二倍体酵母の合成ドロップ アウト メディアを含む 96 ウェル プレートに転送され、ライブラリ遺伝子が成長することができます。ロボット スポッティング マシン、FUS およびライブラリ遺伝子の発現が誘導される寒天プレート上に各ウェルから酵母培養を転送する使用されます。 さらに、酵母培養は、FUS とライブラリ遺伝子が表現されてない寒天を制御する発見されます。次の寒天版で成長、救助または FUS 毒性を悪化させる遺伝子が識別されます。

プロトコル

注: ここで説明されているプロトコル 10 96 ウェル プレートに含まれるライブラリ プラスミドをスクリーニングに最適ですが、スケールがアップまたはダウンします。プロトコルは、ライブラリ全体のスクリーニングを完了するために繰り返される必要があります。通常、1 人で毎回ライブラリの遺伝子の 10 皿に対してスクリーニングを快適処理できます。

1. 96 ウェル酵母の形質転換のための準備

注: この手順は記載されている^7,10以前として行われます。

1. 分注 5 μ L (約 50-100 ng) 丸底 96 ウェル プレートの各ウェルに配列したプラスミド ライブラリからの DNA のプラスミッドの。
   注: このようなライブラリの例は酵母の遺伝子発現ライブラリ¹⁰になります。
2. 半数体酵母 W303α のコロニー (直径 2-3 mm) 500 mL フラスコ内の酵母ペプトン ブドウ糖 (YPD) メディアの 150 mL を接種します。一晩中揺れ (200 rpm) 30 ° C でそれらを孵化させなさい。
3. 次の朝、一晩かけて培養の OD₆₀₀を測定し、外径₆₀₀酵母培養を希釈 (まで) 2 l YPD の 0.1 を =。文化に達する外径 φ₆₀₀まで 〜 5 h の, 振動 (200 rpm) 30 ° C で 0.4 – 0.6 を =。

2. 酵母の形質転換

1. 収穫 8 250 mL の滅菌遠心ボトルを充填し、それらを 3,000 x gで 10 分間、室温で遠心分離による酵母の培養はペレットを中断せず、上澄みを離れて注ぐ。
   注: は、室温で遠心分離手順をすべてを実行します。
2. 洗浄滅菌蒸留 H₂o. と酵母このため、追加 100 mL 滅菌 H₂O の各遠心ボトルし、渦に細胞ペレットを再懸濁します。2 ボトルに遠心上清を注ぐ 3,000 x gで 5 分間で洗浄セルを結合します。
3. 各ボトル 100 mL に 0.1 M LiOAc/1XTE の (100 mM LiOAc; 10 mM トリス、pH 8.0; 1 mM EDTA) のセルを洗浄し、3,000 x gで 5 分間注ぐ、上澄みを離れてそれら遠心分離機します。
4. 遠心分離、100 ° C で 3 分間ブロック ヒーターを使用してのサケ精子 DNA (10 mg/mL) 5 mL を沸騰、アイスで冷却します。
5. 25 mL の 0.1 M LiOAc/1XTE 各ボトルでので細胞ペレットを再懸濁します、再懸濁のセルを結合して、150 mL のフラスコに転送します。予冷サケ精子 DNA の 5 mL を追加し、30 の ° c (225 rpm) を 30 分間振とうしながらインキュベートします。
6. 滅菌ディスポーザブル試薬リザーバーにセルを流し込むし、ライブラリ プラスミド DNA を含む丸底 96 ウェル プレートの各ウェルにセルの混合物の 35 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用して、転送します。渦 96 ウェル プレート 1,000 rpm で 1 分の板 vortexer を使用します。振ることがなく 30 ° C で 30 分の版を孵化させなさい。
   注: 熱がより効率的に移動することができますので、プレート、累積しません。我々 は、ボルテックス 1,000 rpm で 96 ウェルのプレートには、井戸の外に流出する液体を引き起こさないが、安全な渦の速度は、ステップを実行する前にテスト必要がありますを発見しました。
7. フラスコで、200 mL の 40 %peg3350 の最終的な集中、10% DMSO 0.1 M LiOAc を含む変換バッファーを準備します。使用直前に変換バッファーを準備し、揺することによってそれを徹底的にミックスします。、
8. 30 の ° C の定温器からの削除 96年ウェル プレート 30 のためそれらをミックス プレート vortexer を使用して 1,000 rpm で s。1,000 rpm で 1 分間プレート各のよくし渦に変換バッファーの 125 μ L を追加します。
9. 30 ° C、30 分で版を孵化させなさいし、15 分の 42 ° C の定温器でプレートを配置することによってショック酵母を熱します。
   注: は、プレートには累積しません。
10. 3,000 x gで 5 分間プレートを遠心します。井戸からゴミ箱にプレートを反転して強制的にプレートからバッファーをダンプ変換バッファーを削除します。すぐにしみのプレートの上に任意の液体を除去するきれいなペーパー タオルの上に倒立のプレート。
11. ライブラリ プラスミッドの選択可能なマーカーに対応する最小ドロップ アウト中のプレート 200 μ L を追加することによって、細胞をすすいでください。
    注意: 合成裏培地を使用しました。
12. 3,000 x gで 5 分間プレートを遠心し、ステップ 2.10 のようにゴミ箱の上清を除去します。
13. 最小限の裏メディア含む 2% ブドウ糖の 160 μ L を追加します。渦 1,000 rpm で 1 分板を振ることがなく 48 h の 30 ° C にそれらをインキュベートし、。48 時間後に変換された酵母のペレットが各ウェルの下部に表示されている注意してください。
14. 液体ディスペンサーを使用すると、96 ウェルのプレートの新しいセットの各ウェルに裏メディア含むブドウ糖の 100 μ L を追加します。
15. 渦 30 1,000 rpm で (ステップ 2.13) から変換された酵母を含むプレート s の滅菌プラスチック 96 ピン replicator を使用して、変換後の酵母を含む井戸にピンを配置し、新しいプレートの対応する井戸にそれらを接種します。メディアでいっぱい。30 ° C 24 時間で新しい版を孵化させなさい。
    注: 10 皿の場合は、媒体も不要マルチ チャンネル ピペットを使用して手動で。
16. 24 時間後は、酵母のペレットは正常に変換された酵母を含む各ウェルの底に見えるはずです。グリセロールとしてこれらの酵母菌を保存する 50% のグリセロールの 50 μ L を各ウェルに追加渦 30 プレート 1,000 rpm で s シーリング テープでプレートをシール、-80 ° C でフリーズ
    注: 上記の手順は、一度実行するのみ必要。同じライブラリ ディスポーザブル試薬リザーバーに対する異なる酵母モデルの今後の上映は、グリセロールから起動し、すぐに以下の手順から続行できます。

3. ライブラリの遺伝子とクエリ酵母を含むセルの間で合う

1. グリセロール ストックからライブラリ系統を復活させるには、-80 ° C のフリーザー、シーリング テープと聞かせて酵母を約 30 分間室温で解凍削除の 96 ウェル プレートを取り出してください。
2. 酵母は解凍後、96 ウェル プレートで新鮮な裏メディア含む 2% ブドウ糖の 160 μ L にグリセロールを接種するとライブラリの菌株を使用した直後に 30 ° c 24 時間それらを孵化させなさい滅菌プラスチック 96 ピン レプリケーターを使用します。、シーリング テープ、シール プレート、-80 ° C のフリーザーにそれらを返します。
3. 同じ日に図書館の菌株 (W303α) を解凍、クエリの酵母を接種する (ここで W303a で FUS) 50 mL YPD に一晩 250 rpm で振とうしながら 30 ° C でそれを成長と。
4. 次の朝、滅菌ディスポーザブル試薬リザーバーとマルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートの各ウェルにクエリの菌株の 160 μ L 分注するクエリ酵母のひずみを注ぐ。
5. 液体ディスペンサーを使用すると、10 の 96 ウェル プレートの各ウェルに YPD 媒体の 160 μ L を調剤します。ライブラリ酵母とクエリの酵母を交尾の後でこれらのプレートを使用します。
6. 簡単に渦クエリひずみとクエリを転送する滅菌 96 ピン レプリケーターを使用してを含む 96 ウェル プレートは、YPD プレートにひずみ。
7. 簡単に渦ライブラリはプレートのひずみし、プレート、各ライブラリの歪みモデル「新しい滅菌 96 ピン レプリケーターを使用してクエリの負担で接種されて YPD プレートにライブラリ系統を転送。
   注: グリセロールのセルは、複数の凍結融解サイクル後、生存を失います。ライブラリ株を長期保存 (-80 ° C のフリーザー) できるだけ早く返す、良質のライブラリを維持し、将来の使用のための準備します。やりゃ、グリセロール ストック冷凍でき、少なくとも 10 倍を解凍します。作業コピーとグリセロール ストックのバックアップ コピーを維持するを強くお勧めします。在庫が機能しない場合すぐに新しいの作る作業バックアップ コピーからコピーです。
8. 30 ° C 24 時間、酵母のペレットが表示される注意ください各ウェルの底に 24 h 後で YPD プレートを孵化させなさい。
9. 塗りつぶし 96年ウェル プレート 2% ラフィノース、クエリ株のプラスミドに関するライブラリ プラスミド (例えば、ここ裏 - 彼-) の選択可能なマーカーに対応する最小ドロップ アウト中。
10. 滅菌 96 ピン replicator を使用して、YPD 培地、文化の交配から酵母を転送します。48 h; 30 ° C で 96 ウェルのプレートを孵化させなさいだけ酵母交尾細胞形成された二倍体細胞し、したがって、両方のクエリ プラスミドを含むし、ライブラリ プラスミドがこのメディアに成長することができます。2 日後、ウェルの底にペレットが表示されることを確認します。

4. スポッティング アッセイ

1. ラフィノースを含む選択メディアの成長の 48 時間後酵母を寒天にスポットします。
   1. 2% 寒天明らかポリスチレン製プレート、1 つ含む 2% ガラクトースおよび他含んでいる 2% ブドウ糖を含む裏彼ドロップ アウト プレートの 2 セットを準備します。
   2. 1,000 rpm で 1 分間ボルテックス 96 ウェル プレートは、酵母 2% ガラクトースと 2% 寒天培地 (FUS とライブラリの遺伝子は誘導される) を含む裏彼ドロップ アウト プレートと 2% のグルコース, 2% 寒天培地 (FUS とライブラリの遺伝子を含む裏彼ドロップ アウト プレートをスポットします。抑圧された)、各文化も発見されます 4 連で寒天プレートの上にロボットのスポッティング マシンを使用して (すなわち1 の文化も発見されます寒天プレートの 4 点へ)。
   3. スポッティング後、乾燥し、30 の ° C の定温器に逆さまに置く寒天をしましょう。クエリのひずみへの毒性が救出される/より高速な酵母の成長を記録するまたはクエリのひずみへの毒性をさらに悪化/より遅い成長を記録する寒天のすべての 24 h を撮影します。4 日間の版を孵化させなさい。
      注: それぞれの文化も発見できます寒天プレート 1-1、以前の変換に基づく方法¹⁰のように。ただし、1-に-4 ここでスポッティング (これはロボットのスポッティングのマシンを使用して簡単に設定できます) 偽陽性の数を減らし、アッセイの堅牢性が増大します。肯定的なヒットは同じからすべてのコロニーがよく類似した表現型を表示するときのみ考慮されます。

結果

ALS 関連タンパク質、RNA ・ DNA 結合タンパク質 FUS は半数体酵母^7,8で以前調べた。遺伝のスクリーニングの使用して変換に基づく方法は、FUS 毒性を抑制するいくつかの酵母の遺伝子を発見しました。原発神経細胞と ALS¹³のモデルラットにおける毒性を抑制することで効果を発揮する酵母遺伝子の 1 つの人間の相同物を後で示した。ここでは、効果的に交配による過剰発現ライブラリ スクリーニングを行えることを示す同じ酵母モデルを用いています、変換しました。

FUS は両方の半数体および二倍体酵母の細胞に有毒であります。
FUS とそれに続く過剰発現ライブラリ スクリーニングの前の酵母モデルは半数体セルの背景で行われました。仕事に合うベースのメソッ...

ディスカッション

ここでは、酵母モデルにプラスミド ライブラリを導入する交尾を用いた酵母プラスミド発現画面を実行するプロトコルについて述べる。このアプローチを使用すると、複数の酵母モデル神経変性疾患タンパク質毒性の酵母プラスミド ライブラリと変形の同じコレクションを使用して上映されます。変換の骨の折れるプロセスのみを非常に効率的な酵母後交尾がクエリひずみにプラスミド ライブラリを導入に使用されれば実行する必要があります。このプロトコルは、メディアと寒天プレートの上にスポット イースト文化を分配するロボット装置の使用に依存しています。ロボット装置を使用せず、プロトコルを実行できますが、それは時間がかかるだろうこのメソッドが正常に FUS の毒性を変更することができます遺伝子のスクリーニングに使用されます。

FUS は二倍体酵母の背景でわずかにより少なく有毒なことを見ました。これは最も可能性の高い遺伝子コピー数および二倍体酵母の成長率の違いが原因です。場合を除き、研究されている表現型は交配型または倍数性依存性、毒性の成長表現型が半数体および二倍体酵母の一貫性のあります。このため、交尾ベースの方法は広く多...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
サケ精子DNA(SS-DNA)	シグマ・アルドリッチ	D1626
YPD ブロス	研究製品国際 (RPI)	Y20090
粒状寒天	フィッシャー 科学	BP97445
D-(+)-グルコース	研究製品国際 (RPI)	G32040
D-(+)-ガラクトー	ス研究製品国際 (RPI)	G33000
D-(+)-ラフィノース五水和物	研究製品国際(RPI)	R20500
アンモニウム	フィッシャーSci	A702-500
合成ウラドロップアウト培地	クロンテック	630416
酵母アミノ酸ドロップアウトサプリメント-ヒスチジン/-ウラシル	クロンテック	630422
アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない酵母窒素塩基	製品インターナショナル(RPI)	Y20060
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Fisher Sci	S67496
酸リチウム、無水	Fisher Sci	AC268640010
ポリエチレングリコール3350(PEG-3350)	Spectrum Chemical	PO125-12KG
96ピンレプリケーター	Scinomix	SCI-5010-OS
Nunc OmniTray	Thermo Sci	140156
Corning Costar 96 well assay plate, 丸底, 蓋付き	Fisher Sci	07-200-760	未処理, 滅菌済み
Eppendorf Research plus マルチチャンネルピペット	Eppendorf	TI13690052	30-300ul 容量
Fisherbrand Isotemp デジタル ドライバス / ブロック ヒーター	Fisher Sci	88-860-023
Eppendorf MixMate	Eppendorf	21-379-00
Eppendorf 5810R Centrifuge	Fisher Sci	05-413-112
Avanti J-26 XPI Centrifuge	Beckman	393127
MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser	BioTek
Rotor HDA	シンガーインストゥルメント