迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

サマリー

ここでは、ウイルス不活化全血から急速なウイルス核酸抽出のためのプロトコルを提案する.抽出は、採血管に直接行い機器や電気を必要としません。メソッドは実験施設に依存しないとすることができます (例えば、野戦病院で) どこでも使用されます。

要約

アウトブレイク管理、リスクの抑制、および患者のケアのための感染症の迅速診断が欠かせません。以前、真空採血管に直接商業換/結合バッファーを追加することによって安全な核酸 (NA) テストのための血液採取中にエボラ ウイルスの急速なベッドサイド不活性化する方法を示しました。このベッドサイド不活化アプローチを使用して、我々 手法を開発した安全、迅速かつ簡単なベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの後続の検出。NA の抽出は、採血管で直接実行され、機器や電気を必要としません。

換/結合バッファーには採血後チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在し、混合物は室温で 20 分間インキュベートします。チューブに磁性ガラス粒子 (MGPs) が追加され、コレクション チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在します。ゴムや磁石マグネット ホルダーを使用して、採血管の側面に、MGPs を収集します。MGPs 3 回洗浄し、コレクションの管に直接溶出バッファーの追加により、NAs NA 試験、qPCR 反応から MGPs を取り外すことがなく等温ループ増幅 (ランプ) などの準備が整います。NA の抽出法があらゆる所に依存しないと簡単にすることができます (例えば、野戦病院の隔離病棟) どこでも使用されます。この NA 抽出法をランプとポータブル機器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分以内で診断が可能です。

概要

ウイルスの発生状況は、患者が隔離病棟または迅速な診断が必要な場合に限られているとき、安全で簡単、かつ正確なポイント ・ オブ ・ ケアの分子診断は患者のケアとリスクの封じ込めのため不可欠です。2 つウイルスの最近の発生、エボラ出血熱ウイルス (EBOV) 西アフリカ (2013)、南アメリカ (2015)、ジカの改善ポイント ・ オブ ・ ケアの診断テスト分子、逆のトランスクリプションのループを介した等温などに対する関心が高まってください。増幅 (RT ランプ)^1,2編シュプリンガー ・ ポリメラーゼ増幅 (RPA)^3,4。RT ランプ、RPA は、簡単なサンプル準備を行うことが急速な敏感な特定の分子テストです。ジカ ウイルスの RT ランプは 30 分¹; 内非精製の全血試料中ジカ ウイルスを検出することができます側方流動試金 (LFA) と結合されていますただし、リスク グループ 4 病原体として分類される、非常に伝染性、EBOV のサンプルは、バイオ セーフティの下で処理する必要がある 4 (BSL-4) 条件、任意の安全な診断手順を実行前に不活化します。

EBOV、^3,2,54,サンプル、換散バッファーの追加など簡略化された不活化方法が発生; 中に使用されました。ただし、これらのメソッドには、BSL 3 バイオ セーフティ キャビネット、遠心分離機、加熱ブロック、最低、ピペットなどの実験装置と BSL 4 条件下で処理が不要です。病棟別や野戦病院でこの装置は通常ありません。このような課題を克服するために、スーツケース³診断を実行する試みがなされ、いくつかのポータブル デバイスとマシンを開発 [例えば核酸 (NA) 抽出のためのポータブル デバイス] されている⁶。ただし、この EBOV 肯定的なサンプルは、これらのデバイスを使用することができます前に不活化する必要があります。

について報告した急速なベッドサイド ウイルス不活化法による EBOV⁷、ワクシニア ウイルス、牛痘ウイルス⁸商業換/結合バッファーの添加による普通の真空採血管に直接を可能にします。患者から不活化バッファー⁷へ血液の転送。クローズド システムのこの直接および即時の不活化 BSL 4 条件⁷など、厳密な包含を使用してサンプルを処理する必要がある、通常の BSL 2 条件下でサンプルを処理できます。この不活化方法はロボットや手浄化キット⁷など、いくつかの NA 抽出システムとの互換性ただし、これらのメソッドには、実験装置、ロボット、遠心分離機、や電気のフィールドの設定または隔離病棟内存在とは限らないなどが必要があります。

本報告で述べる安全・迅速かつ簡易マニュアル NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスのそれに続く分子検出のため。NA の抽出法では、マグネット ・ マグネット ホルダー以外の装備は必要ありません。NA を抽出するための遠心分離機、ブロック、または電気暖房は不要です。したがって、このメソッドは実験施設に依存しないとすることができます簡単に任意の場所 (例えば、野戦病院、病棟の分離または低リソースの設定で) 使用します。NA 抽出法は、迅速かつ簡単な qPCR、RT qPCR、ランプ、または RT ランプなどのすべてのダウン ストリーム NA テストで直接使用することができます。この NA 抽出法をランプとポータブル バッテリー駆動の恒温器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分内ベッドサイド診断を取得できます。

プロトコル

生物医学研究倫理委員会、首都圏は、インフォームド コンセントを与えているし、ここで説明したすべてのメソッドは、アッセイ開発プロジェクトに関するデンマークの法律に従って、倫理委員会システムによってレビューから除外されています。

1. ウイルス不活化と急速な NA 抽出真空採血管の準備

注意: このプロトコルに使用されるバッファーには、刺激であるためチオシアン酸 (GITC) および非イオン性界面活性剤が含まれています。適切な研究室安全対策流フードを使用し、それを処理するときは、手袋を着用します。皮膚と眼との接触を避けます。バッファーがこぼれたら、この混合物は有毒なシアン化物の形成につながる可能性がありますので汚染された表面が消毒クロラミンや次亜塩素酸ナトリウム (「漂白剤」の成分) を直接決してする必要があります。最初、吸収性組織とこぼれたバッファーを拭いてください。次に、70% のエタノールと水の表面をきれいにし最後に、クロラミンまたはナトリウム次亜塩素酸を使用します。

1. 血液コレクション真空管を準備するには、25 x 1 針と 3 mL シリンジを使用してチューブの蓋を貫通して 4 mL EDTA 真空管に特定商業換散バッファーの 1.6 mL を注入します。
   注: は、真空管式のふたを削除しないでください。真空を維持する必要があります。
2. 真空管を使用するまで室温でバッファーを含むを保存します。
   注: 少なくとも 1 年間の準備の後のチューブは安定しています。

2. NA 抽出バッファーの準備

1. NA 抽出バッファーを準備するには、ラックに 2 つ 1.8 mL、2 4.5 mL および 1 つの 3.6 mL チューブを配置します。
2. 磁性ガラス粒子 (MGPs) きれいな 1.8 mL チューブ、MGPs。 それと再懸濁します MGP サスペンション完全にそれをピペッティングする前にラベルの 960 μ L をピペットで追加します。
   注: MGPs は、管の下部を迅速に収集する傾向があります。
3. 追加、ピペッティング、4 mL の洗浄バッファー私きれいな 4.5 mL 管によっておよび WB 1 としてラベルを付けます。
   注意: 洗浄バッファー私は刺激性であるため塩化物を含んでいます。適切な研究室安全対策流フードを使用し、それを処理するときは、手袋を着用します。皮膚と眼との接触を避けます。
4. 洗浄バッファー II きれいな 3.6 mL チューブ 1.5 mL をピペットで追加し、WB 2 としてラベルを付けます。
5. きれいな 4.5 mL の管に洗浄バッファー III の 3 mL をピペットで追加し、WB 3 としてラベルを付けます。
6. きれいな 1.8 mL チューブに溶出バッファーの 100 μ L をピペットで追加し、EB としてラベルを付けます。
7. 使用するまで室温で検体のバッファーを格納します。
   注: チューブは、最低 1 ヶ月の準備期間を経て安定しました。

3. ウイルス感染の徴候と症状を持つ患者からの採血

注意: は、患者から全血を収集するときに適切な研究室安全措置を講じます。手袋、眼鏡を着用します。患者は単独では、バイオ セーフティ レベル 4 の手順に従ってください。

1. 患者から静脈全血を収集するには、小口径の延長チューブと蝶針と換/結合バッファーを含む血液コレクション真空管を使用します。下方の位置に患者の腕を置き、コレクション チューブ蝶針よりも下の位置します。蝶針を患者の静脈に挿入し、血液コレクション真空管を小口径拡張に添付します。
   注: これは逆流を防ぐ。
2. 血液採取後 5-10 回チューブを反転して管の内容をミックスします。
   注: 1.6 mL の溶解/結合バッファーを含む血のコレクションの管に残りの掃除により採取された試料の量自動的に 1.6 mL。
3. 70% のエタノールを使用してチューブの外側を消毒します。
4. 室温で 20 分間チューブを孵化させなさい。
   注: プロトコルをここで一時停止することができます、完全な血のコレクションの管は-20 ° C、5 ° C、25 ° C または少なくとも 1 月⁷の 37 ° C で保存できます。
5. 簡体字の NA 抽出方法に直接進みます。

4. 全血中の NA 抽出の簡略化

1. 換/結合バッファー不活化収集した血液、ミックスから NA を浄化するために真空を反転による管の内容管手で 5-10 倍です。
2. 慎重にチューブの蓋を取り外し、蓋を放電します。
3. 血のコレクションの管に直接 MGPs (1 mL) の準備の因数を注ぐ。
4. サンプルを格納筒、未使用採血管から新しいふたを配置します。
5. チューブがしっかり閉じていることを確認し、採血管をひっくり返すこと手で 5-10 倍管の内容をミックスする蓋の上に指を置きます。
6. マグネット ホルダーにチューブを置き、指を離さないように、管を密閉蓋。
7. マグネット チューブの側ですべての MGPs を収集できるように手で数回チューブ マグネット ホルダーを反転します。
   注: マグネット ホルダーは細長い磁石とゴムバンドで置き換えることができます。
8. チューブの蓋を取り外し、使い捨てのピペットを使用するか、コレクション、50 mL のチューブに内容を注ぐことによって単に管の内容を破棄します。
   注: は、ふた付き管を閉じることにより 50 mL コレクションの管からのエアロゾルを回避します。
9. 血のコレクションの管に直接 WB 1 (4 mL) の準備の因数を注ぐ。
10. チューブのふたを閉めてチューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。
11. 指でしっかり蓋をしながら、マグネット ホルダーからチューブを削除します。
    注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。
12. 手で 5 ~ 10 回の血のコレクションの管をひっくり返すこと、MGPs を再懸濁します。
13. 4.6 4.8 の手順を繰り返します。
14. 血のコレクションの管に直接 WB 2 (1.5 mL) の準備の因数を注ぐ。
15. チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。
    注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。
16. チューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。
17. 数秒間血のコレクションの管を手で弾くことによって、MGPs を再懸濁します。
18. 4.6 4.8 のステップを繰り返します。
19. 血のコレクションの管に直接 WB 3 (3 mL) の準備の因数を注ぐ。
20. チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。
    注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。
21. チューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。
22. 手で 5 ~ 10 回の血のコレクションの管をひっくり返すこと、MGPs を再懸濁します。
23. 4.6 4.8 の手順を繰り返します。
24. 理事会の準備の因数を注ぐ (100 μ L) 血のコレクションの管に直接。
25. チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。
    注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。
26. 5-10 回指で採血管を叩くことによって理事会で、MGPs を再懸濁します。
    注: プロトコルがここでは、一時停止にできるし、チューブが-20 ° C で保存できます。
27. 再懸濁 mgps 1.5 mL 使い捨てピペット (任意の下位診断 NA 増幅分析などランプ/RT-ランプまたは qPCR/Rt-qpcr アッセイを使用できます) を使用して、ダウン ストリーム NA 増幅反応混合物に 1 つの液滴 (5-8 μ L) を転送します。
    注: NAs が、MGPs に固執するので、必ず下流 NA 増幅反応で、MGPs を使用します。使用する前に MGP サスペンションをミックスします。混合した後、管の下部に、MGPs を収集します。

結果

ここで提示されたプロトコルは単純で効率的と換/結合バッファーで不活化感染全血サンプルで実行される任意の分子アッセイに広く適用できます。血の不活性化および NA 抽出のワークフローはに示す図 1血コレクション真空管⁷ (図 1 a)、血液コレクション⁷ (図 1 b)、NA 抽出 (の準備を含む図 1 - 1 H)、および下流の NA 分析 (図 1I)。

簡体字の NA の抽出のプロトコルにより、MGPs は溶出のステップから削除されず、したがって、NAs...

ディスカッション

本報告で述べる安全、迅速かつ簡単なマニュアル ベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの下流分子検出のため。換/結合バッファー (材料表)⁷を含む真空採血管で収集された全血サンプルで直接実行するのに記載されている NA 抽出法が開発されました。この特定のバッファー EBOV⁷を不活性化し、メソッドの重要なコンポーネントです。血液採取後、サンプルの完全な不活化を確保するために、少なくとも 20 分⁷管の培養をお勧めします。ベッドサイドの EBOV 不活化 BSL 4 条件などの厳密な包含条件の下で任意の EBOV 陽性検体を処理する必要があるができ通常の BSL 2 条件下で処理されるサンプル。その他リスク グループ 4 つの病原体など、ラッサ ウイルス、マールブルグ ウイルス、クリミア ・ コンゴ出血熱ウイルスはまたにこのバッファーによる不活化は、この遺骨が表示されることです。

説明...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Vacutainer K2 EDTAチューブ(4 mL)	Becton Dickinson	368861
Plus Blood Collection	Becton Dickinson	362725
23G x 1	Becton Dickinson	300800
LUER LOKシリンジ(3 mL)	Becton Dickinson	309658
Butterfly needle with small-bore extension tubs	Jørgen Kruuse A/S	121714
1% Virkon	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit	Roche Diagnostics A/S 3038505001
Nunc™バイオバンキングおよび細胞培養極低温チューブ(1,8 mL)	Thermo Fisher Scientific	Scientific 375418
Nunc™バイオバンキングおよび細胞培養極低温チューブ(3,6 mL)	Thermo Fisher Scientific	Scientific 379189
Nunc™バイオバンキングおよび細胞培養極低温チューブ (4,5 mL)	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 マグネット	Thermo Fisher Scientific	12303D
トランスファーピペット (3.5 mL)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™Samco™ファインチップトランスファーピペット(1.5 mL)	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™Nunc™50 mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離チューブ	Thermo Fisher Scientific	339652