方法論記事

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

DOI：

10.3791/58024

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2018年6月29日

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1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

この記事について

サマリー

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ゼブラフィッシュは、遺伝子編集技術の登場により、特に、生物医学研究における信頼性の高い遺伝モデル有機体として使用されています。幼虫の表現型の場合は、DNA 抽出と遺伝子型同定は挑戦できます。ここでは、尾クリッピング、早ければ 72 時間後受精によるゼブラフィッシュの幼虫、効率的なジェノタイピング手順について述べる.

要約

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ゼブラフィッシュ (動脈分布) では、人間の病気と関連付けられる知られていた遺伝子の 84% 第オーソロガスを所有しています。さらに、これらの動物は、短い世代時間を持っているし、簡単処理、高い繁殖率、低コストを表示にして胚における DNA の微量注射による遺伝子操作に簡単に適しています。遺伝子編集ツールの最近の進歩は、ゼブラフィッシュの遺伝子と変異の正確な導入を迎えました。ゼブラフィッシュのモデリング病気幼虫の表現型と遺伝子型が不明な場合の解釈に挑戦することができますの早期死亡に します。遺伝子表現または質量分析法の研究など、サンプルのプールを必要とする実験に必要な遺伝子型のこの早期発見しています。ただし、遺伝的スクリーニングは、ほとんどのラボでのみ大人ゼブラフィッシュや死後の幼虫で実行される従来の方法によって制限されます。我々 は早ければ 72 時間後受精 (hpf) 達成することができる生きたゼブラフィッシュ幼虫からゲノム DNA を PCR 用の隔離のための方法を適応させることによってこの問題に対処します。この時間とコスト効果の高い手法、以前発行したジェノタイピング プロトコルから微細フィン バイオプシーから遺伝子の同定をことができます。フィンは、幼虫を開発に迅速に再生成します。研究者を選択し、この高速 PCR に基づくジェノタイピング プロシージャを用いた成人に必要な遺伝子型を上げることができます。

概要

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ゼブラフィッシュ (動脈分布)治療仮説1,2,3の前臨床試験としてだけでなく病調査のためのモデルとして広く脊椎動物の生物します。これらの動物が短い世代時間、簡単処理、高い繁殖率、低コストを表示にして、胚4dna マイクロインジェクションにより遺伝子操作に簡単に従うです。新規トランスジェニック遺伝子の増加開発を通じて亜鉛指核酸 (ZFN)5タルのようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs)6,7、および、クラスター化定期的に空間短いなどの技術の編集回文を繰り返す (CRISPR)/CRISPR 関連 9 (Cas9) システム8ゼブラフィッシュは大幅にいくつかの病態の理解を改善するために態勢を整えています。これらの技術は、体細胞の両方のターゲットを絞ったノックアウトを作成する使用されている、ゼブラフィッシュ、効率的に遺伝子を醸成の生殖細胞変更動物8。本邦の最近の例は、ゼブラフィッシュ3,9,10、11,12 てんかん、代謝性疾患の遺伝学的モデルの開発に成功.

ゼブラフィッシュ ゲノム編集でなされる進歩、迅速かつ信頼性の高い遺伝子型別否定の律速段階となっています。予測されたゲノム編集ターゲット サイトに隣接する特定の DNA の突然変異の同定は、プロトコルの重要な段階です。伝統的に、フィン クリッピングによる遺伝子型解析技術は、通常のみで実行される少年や大人のゼブラフィッシュです。ただし、時間は成年期に引き上げゼブラフィッシュ (> 2 ヶ月) はかなり研究の進歩を遅らせます。多くの場合、必須遺伝子 (例えば、疾患モデル) または表現型の有害な影響につながる機能獲得変異のノックアウトによる成人期を実現できません。さらに、いくつかの試金は RNA または代謝物抽出のような幼虫のプールを必要とし、したがってジェノタイピング テクニックのホックの記事だけが利用できるときに挑戦できる遺伝子型の事前の同定が必要があります。これらの前述の例は、正確な同じ時に、完全復旧モデルと幼虫の正常な発展を有効にする幼虫検出技術の重要性を強調します。初期段階のゼブラフィッシュの遺伝子型が現在広く使用されるに表示されません。実験12,13,14の実行前に遺伝子型ではなく、事後のジェノタイピングによる幼虫の遺伝子型を識別する疾患モデルの最近の出版物に反映されます。本稿では以前に確立された遺伝子型のやり方を改善することを目指して幼虫フィン クリップ戦略を提案します。

過去には、遺伝子型にプロティナーゼ K 消化を採用戦略は幼虫が可変のポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 効率15につながっているゼブラフィッシュを住んでいます。もっと最近より有望な結果16を提供顕微鏡尾生検手法を公開、我々 と他のグループができませんでした高効率、著者によって報告された DNA の回復を再現します。ウィルキンソンらによって記述されたプロトコルの主要な後退16は、PCR チューブに尾組織を転送可能性があります。その顕微鏡サイズのため、フィンは正しく収集、ピペッティングにより調剤を確保するは難しいです。この障壁に対処するため遺伝子型9のほぼ 100% の効率で生きたゼブラフィッシュ幼虫数が多いため改良されたプロトコルを開発しました。Microscalpel を使用して、フィン尾の先端が削除され、フィルター紙の上に配置します。組織を含むフィルター紙の作品は、容易に視覚化し、PCR チューブに正しく配置できます。ゲノム DNA の抽出が実行されます、続いて遺伝子試料への関心領域の PCR の拡大。このメソッドの利点には、PCR 効率、低偽陽性率と低い死亡率率があります。さらに、多数の胚の遺伝子型は、このプロトコルを使用可能です。ここ記載されているプロトコルは、このアプローチと誘因の魚と 2 日以内尻尾再生の正しい id を使用して 2-3 h 内幼虫数百人のフィン クリッピングを使用できます。

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プロトコル

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動物のケアのガイドラインに従って、承認されている含む動物科目の手順は、アニマル ・ ケア委員会動物ケアとオタワ大学のカナダの理事会によって提供されます。

1. 準備

  1. 郭清の面を準備するには、その内部の表面を横切ってオートクレーブ テープで 9 cm シャーレのふたをテーピングします。ステレオ顕微鏡の下に配置します。
  2. 3-5 日後受精 (dpf) を置くペトリネットにおける幼虫のゼブラフィッシュ皿し、˜1.5 mM Tricaine 1 x E3 胚メディア (5 mM NaCl、KCl、0.33 mM CaCl2、0.17 mM 0.33 mM MgSO4、pH 7.2) の麻酔。
  3. 最小限のストレスで 3 dpf 幼虫に合わせて 2 mm の直径にはさみやかみそりの刃のペアで P1000 ピペット チップの端を切り落とします。

2. ゼブラフィッシュ幼虫フィン クリッピング

  1. 変更された P1000 マイクロ ピペットを使用して麻酔の幼虫をピックアップし、シャーレのふたを配置されたオートクレーブ テープ ゼブラフィッシュ幼虫を配置します。
  2. マイクロ ピペットを使用して幼虫を取り巻く過剰の Tricaine ソリューションを削除します。地域はセクション フィンをピックアップすることは不可能が、生存を確保するのにはまだウェットとして乾燥する必要があります。
  3. マイクロメス、ステレオ顕微鏡、ウィルキンソンら16に示すように、図 1で示さで尾鰭のセクションを使用します。切開中に尾鰭血液循環 (図 1 a) の限界への遠位の色素ギャップ サイト内で安定した下方圧力を適用します。脊索の損傷を避けるために穏やかな圧力を適用します。
  4. 顕微鏡切片のフィンを可視化し、microscalpel ブレード (図 2 a) の先端の上に作品を配置します。フィルター紙の小片の表面にフィンを含む microscalpel を配置します。
    注意: 切断組織におけるメラニン細胞の存在のためにこのステップはフィンの小さな黒い点 (図 2 b) として可視化できます。
  5. はさみやピンセット (図 2) を使用して、96 ウェル PCR プレートにフィンを含む、(図 2 D) ウェルあたり 50 mM NaOH 溶液の 25 μ L を含む濾紙を転送します。
  6. フラット底 96 ウェル プレート、PCR プレートのラベルによると井戸を番号を準備します。新鮮な 1 x E3 胚メディアの 200 μ L でいっぱい修正 P1000 ピペットを使用して、慎重に穏やかな圧力を使用してゼブラフィッシュ幼虫を収集し。同じ PCR プレート (図 2 e) としても番号で 96-well ティッシュの培養皿に幼虫を調剤します。
  7. フィルター ペーパーもソリューション (図 2 f) に浸漬するかどうかを確認します。Microscapel と 70% エタノール溶液に浸漬して交差汚染を防ぐために各カットの間ピンセットの刃をクリーンアップします。きれいなペーパー ティッシュ/ワイプでブレードを拭きます。
  8. 手順 2.1 2.7 を繰り返して、すべての胚がクリップされています。
  9. 遺伝子型の特定までは、28 ° C で 96 ウェル プレートで幼虫を格納します。
    注: 胚メディアは、2 日以内にプロトコルを簡単に完了できるので、変更する必要はありません。多くの時間が必要な場合、メディアの変更をお勧めします。

3. ゲノム DNA の抽出

  1. シール 96 ウェル PCR プレートおよび遠心フィルターのすべての書類を確認する 1 分 1,000 x g でサンプルが NaOH 溶液内で水中に沈みます。
  2. 組織溶解の 95 ° c 10 分のための 4 ° C に冷却後 5 分たちのサンプルを加熱します。
  3. 500 mm トリス-HCl、各サンプルに pH 8.0 6 μ L を追加します。渦。
  4. 簡単に遠心分離機で 1,500 × g、室温で 5 分間プレート。
  5. 1.5 μ L の PCR 反応あたり DNA 上清を使用します。
  6. 表 1-2に示すように、幼虫は、遺伝子を PCR を準備します。
    注: このプロトコルは、2 つのアプリケーションのテストされた: 明らかに agarose のゲルの9、およびヘテロ二本鎖融解アッセイ (HMA) 明らかに遺伝子型のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ)17を使用してを使用して遺伝子の PCR の反作用を多重化します。

4 キレート樹脂を用いた代替のゲノム抽出

  1. ろ紙クリップされたフィンを 96 ウェル PCR プレートに追加することによって完全なステップ 2.5 キレート樹脂 (スチレン-ジビニル ベンゼン共重合体ペア イミノ二酢酸イオンを含む) 5% の 30 μ L を含みます。
    注: このタイプの樹脂は、組織溶解し、高速かつ効率的な方法18PCR 用 DNA の準備のため使用されます。
  2. 示される 2.6 〜 2.8 の手順に従います。
  3. 96 ウェル PCR プレートをシールし、簡潔にすべてのフィルター ペーパーがキレート樹脂内に水没を確認するサンプルを遠心します。
  4. 組織溶解の 95 ° C 10 分のための 4 ° C に冷却後 15 分でたちのサンプルを加熱します。
    注: この手順により溶解や細胞成分を極性樹脂ビーズの後続バインド DNA および RNA 溶液中に残っている間。
  5. 簡単に遠心分離機の樹脂ビーズをペレットし、懸濁液中の DNA を取得するサンプルです。
  6. 3.5-3.6 ジェノタイピング手順を完了する手順に従います。

5. アプリケーション 1: マルチプレックス PCR の Agarose のゲルの分析に続いて

  1. WT 幼虫、ヘテロ接合体、ホモ接合体変異体の識別を有効にするマルチプレックス PCR 反応を設定次の表 1。96 ウェル サーマルサイクラーを使用すると、表 3に示すサイクリング条件を使用して PCR の反作用を実行できます。
    注: PCR の反作用は、任意他従来 PCR サーマルサイクラーでも実行できます。この例は、ペナらによって使用される PCR 戦略を説明します。9 aldh7a1 WT と同じ多重反応で 5 bp の挿入変異対立遺伝子を識別します。
  2. ナトリウム ホウ酸バッファー、1 とステンド グラスに 1% の agarose のゲルの準備 x GelRed。
    注: ホウ酸ナトリウム緩衝在庫 x 20 で 10 M NaOH、ddH2O、1800 mL 40 mL pH 8.5 ホウ酸の 76 g に調整および ddH2o. を使用して 2 L 最終巻を完了し
  3. 250 V で 15 分の 1 x ナトリウム ホウ酸バッファーでゲルを実行します。プロセスを容易にするために可能であれば、サンプルをロードする時間の短縮による高スループット機能を有効にするマルチ チャンネルの pipets と互換性のあるジェル システムを使用します。
  4. 異なる遺伝子型の識別を許可する紫外線 (UV) 光の下でゲルをイメージします。

6. アプリケーション 2: ヘテロ二本鎖アッセイを溶融

  1. ページ 12 1.5 mm スペーサー プレートと 15 サンプル櫛を使用して % ゲルを準備します。12.21 mL ddH2O、2.52 × トリス、ホウ酸塩、EDTA (TBE)、30% アクリルアミドの 10 mL、250 μ L の 10 mL の 10% アンモニウムの過硫酸塩 (AP) を使用して 2 つのページのゲルを準備し、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L。1 x TBE バッファーを使用 (0.089 M トリス-HCl、0.089 M ホウ酸と 0.002 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)) バッファーを実行することとします。
  2. 5 分 94 ° C で PCR の製品を加熱します。
  3. 4 ° C で 10 分間たち、氷の上の管を冷却します。
  4. PCR のサンプルあたり 10 μ L と分子量マーカーの 8 μ L を読み込みます。
  5. 150 V 垂直電気泳動システムを用いた分子量マーカーまで、または 1 時間ほぼ TBE ガラス板の足のラインに達すると 1 x でページを実行します。
  6. 異なる遺伝子型の識別を許可する紫外線の下でゲルをイメージします。

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結果

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遺伝子型によって、protocoll の効率を示したヘテロ接合体の十字の子孫 (aldh7a1+/ot100、 aldh7a1+/-としてここに示されて) (図 3 a- C)9。Aldh7a1ot100の突然変異体の対立遺伝子は、フレーム シフトと早期停止コドン9のための機能喪失につながるゼブラフィッシュaldh7a1遺伝子の最初のコーディング エクソン 5 塩基対 (bp) 挿入。4 プライマーは WT、ヘテロ接合体 (+/-aldh7a1)、および (aldh7a1-/-) のホモ接合体変異の遺伝子型を区別する 3 つの特徴的なバン...

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ディスカッション

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過去の突然変異とゼブラフィッシュの遺伝子を正確に紹介する編集ツールが採用されている遺伝子年5,6,7,8。病ゼブラフィッシュ モデルを実行すると、初期の幼虫や少年の表現型に9,12,13,14多く観察されます。ここで提示されたプロトコルでは、若い 3 dpf と幼虫のジェノタイピングを有効にする、小さなゼブラフィッシュ幼生尾のバイオプシーから PCR 用 DNA の抽出について説明します。遺伝子型の早期発見は、遺伝子型のホックを投稿が可能な9でない場合は特に、いくつ...

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開示事項

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

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著者は、まれな疾患モデルと機構 (RDMM) ネットワーク (カナダ協会の健康研究 (機構) とゲノム カナダによって拠出された) に感謝したいと思います。CK は、支給奨学金授与 (オタワ大学) によってサポートされます。DLJ は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金によってサポートされます。IAP はカナダ協会の健康研究 (機構) ポスドク ・ フェローシップ賞を受賞しています。作者に感謝、遺伝学協会許可からペナ、補足図 5 の適応を使用してこのプロトコルを公開するら。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ペトリ皿コーニング430167
マイクロメスワールド 精密機器500249
実体顕微鏡ニコンSMZ1500
トリカイン/エチル 3-アミノ安息香酸 メタンスルホン酸Sigma-AldrichE10521
96ウェル 組織培養プレートCostar3595
96ウェルPCRプレートフィッシャー14230232
NaOHフィッシャーS25548A 
トリスベース Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% Chelex 100 ナトリウム型Sigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
ホウ酸Sigma-AldrichB6768
Sub-Cell Model 192 systemBio-Rad 
30 % アクリルアミド/ビス溶液、37.5:1Bio-Rad 
GoTaq Green Master Mix、2XPromegaM7123
ペーパーワイプ(Kimwipes®使い捨てワイパー)Sigma-AldrichZ188956
1kb-plus分子重量マーカー Thermo ScientificSM1343
ヌクレアーゼフリーウォーター Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 システム (ハイスループットアガロースゲルシステム)Bio-Rad 
1704508縦型ゲル電気泳動システム Mini-PROTEAN Tetra Cell バイオ・ラッド 
170450816101581658004

参考文献

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タグ

PCR PCR

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