マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

Summary

ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。

Abstract

哺乳類の大脳皮質は特定の電気生理学的および生化学的性質、シナプス、それぞれ興奮性と抑制性のニューロンの多くの種類の構成され、生体内での機能しますが、彼らの基本的な機能と解剖学的組織細胞からネットワークの規模にはよくわかっていません。ここで脳皮質の細胞組織の調査のための広い領域にわたって蛍光標識細胞の三次元イメージング法について述べる.特定の種類のニューロンの蛍光の逆行性神経トレーサーの注射やトランスジェニック マウスにおける蛍光タンパク質の発現によってラベルです。ブロック脳サンプルなど北半球の固定後に準備、透明なクリア方法、組織で作られて、特定の細胞型の蛍光反応を受けます。大きな作動距離の対物レンズとモーターを備えられた段階装備共焦点または 2 光子の顕微鏡を使用して大規模な領域がスキャンされます。このメソッドは、マウス大脳皮質における細胞型固有マイクロカラム機能モジュールの定期的な組織を解決できます。プロシージャは、多様な脳の領域や他の複雑な組織に三次元細胞アーキテクチャの研究のために役立ちます。

Introduction

哺乳類の大脳皮質はそれぞれ特定の遺伝子発現パターン、電気生理学的および生化学的特性、シナプス接続は、細胞の種類、数が多いから成るし、生体内機能^{1,2 、3,4,5,6,7}。これらの細胞型を繰り返し構造に整理するかどうかがはっきりしなかった。視覚的方位選択性コラムや体性感覚の樽など、皮質カラム構造を繰り返しているが、細胞組織不明^8,9のままです。これらは特定の皮質領域内に存在であり、脳全体のシステムではないです。

新皮質層 5 のニューロンの大部分は、4 つの主要な種類に分類されます。サブ大脳投射ニューロン興奮性ニューロンの主要なタイプは、ポンス、脊髄、上丘など皮質下のターゲットへ軸索をプロジェクトし、したがって、皮質の主要な出力経路¹⁰を表します。皮質投射ニューロンの興奮性ニューロンのもう一つの主要なタイプは、皮質¹⁰を支配します。抑制的なニューロンはまた 2 つの主要なクラスを含む: パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞¹¹。

最近の分析は示す繰り返し構造^12,13,14に 4 つのセルの種類を分類しました。サブ大脳投射ニューロン^12,13,14と皮質投射ニューロン¹⁴は、直径 1-2 細胞の配向柱状を特定細胞型に整理します。パルブアルブミンとソマトスタチンを表現する細胞は、サブ大脳投射ニューロンの配向柱状で具体的にはなく、皮質投射ニューロン¹⁴の配向柱状を合わせます。配向柱状自身は定期的にフォーム六角形格子配列¹⁴およびマウス脳^12,14言語、視覚、体性感覚と運動の分野を含む複数の皮質にある整列します。人間の脳の¹³のエリア。マイクロカラムを個々 のニューロン同期された活動の展示し、同様の感覚の反応がある¹⁴。これらの観察は、レイヤー 5 セル タイプはまとめる機能モジュールを繰り返しの最初の知られている脳全体の組織を表すマイクロカラム格子構造を示しています。

配向柱状約 10 μ m の半径を持っていると約 40 μ m の空間的周期.また、配向柱状の向きは尖樹状突起、皮質¹⁴の彼らの位置によって変化に平行です。したがって、マイクロカラム システムは数十マイクロメートルの典型的な厚さと従来の皮質のスライスを使用して解析することは困難です。さらに、周期性の解析の脳領域と、したがって、共焦点顕微鏡の典型的な画像領域の広い範囲から三次元データを必要とするまたは 2 光子励起イメージング生体内では狭すぎます。

最近では、厚い組織^15,16をクリアする技術が開発されています。ここマイクロカラム システムを構成するマウス皮質層 5 の主要な細胞型の大型の三次元のイメージを取得するこれらのメソッドのアプリケーションについて述べる。逆行性ラベリングすることCrym egfpトランスジェニック マウス¹²と皮質投射ニューロンは、逆行のどちらかによりラベル付けされた強化された緑色蛍光タンパク質の発現によって、皮質下投射ニューロンが付きますラベリングやTlx3-cre/Ai9 マウス¹⁷の tdTomato 式で。パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞の免疫組織化学によるラベルです。(抗体スケール S) AbScale 法¹⁸ (を参照してください深い脳) SeeDB 法¹⁹他の実験に使用されている間、実験を汚す抗体が使用されます。これらのメソッドは、従来のイメージング方法上記の困難を克服し、層 5¹⁴の正確な細胞組織を明らかにします。

Protocol

すべて実験プロシージャ理化学研究所和光動物実験委員会と理化学研究所遺伝子組換え実験安全委員会によって承認され、理化学研究所脳科学の動物施設の制度のガイドラインに従って実行研究所。

1. イメージング室の準備

1. イメージング室¹⁹
   1. シリコーンゴム シートを使用して、様々 な厚さの約 5 mm ・床版の厚さの商工会議所を準備します。また、シャーレ、ガラスの下部 (図 1 a) を準備します。
2. スペーサーをスライスします。
   1. シリコーンゴム シートの厚さ 0.5 mm (図 1) を用いたサンプルを保持するスペーサーを準備します。

2. トレーサー注入法

メモ: は、ポンス (2.1) または丘 (2.2) に注射をください。丘へ注入しながら、視覚と運動の領域を含む広い脳領域のポンス ラベル サブ大脳投射ニューロンへの注入は、視覚野でサブ大脳投射ニューロンをラベル付けします。制御実験用蛍光標識したコレラ毒素サブユニット b. の代わりに生理食塩水を注入します。無菌状態の維持のため、プラスチックの手袋をエタノールで洗浄と滅菌装置を使用します。

1. 成体マウスの橋に注射をします。
   1. 蛍光標識したコレラ毒素サブユニット B の 1 μ L を描画 (25 μ g/μ L の PBS) 26 G ハミルトン注射器に。
   2. 注射器で噴射ポンプを配置します。
   3. 脳定位固定装置にマニピュレーターのツール ホルダーに注射器やポンプを配置します。マニピュレーター 12 ° 垂直軸から後方に傾けます。
   4. ペントバルビ タール ナトリウムを腹腔内に注入することによって (c57bl/6 j またはTlx3-cre/Ai9) オスかメスの成体マウスの麻酔 (60 mg/kg 体重) やイソフルラン (2-3%) を投与することによって。しっぽはマウスは完全に麻酔したことを示す、ピンセットでつままれてマウスの応答がないを待ちます。
   5. 脳定位固定装置にマウスを配置します。
   6. 感染症を防ぎ、頭皮の 10 mm を切る前とラムダが表示されるようにかみそりの刃を使用して髪を慎重に取り外します。ピペットを使用して 1% リドカインの 0.1 mL を管理します。前とラムダ、同じ z レベルできるように脳定位固定装置のマウスピースの垂直位置を調整することで頭の角度を設定します。
   7. 注射器の先端に近い前、脳定位固定装置にそれをスライドさせて、マニピュレーターの位置を調整し、マニピュレーターの位置を記録します。マニピュレーターのツール ホルダーを動かすことによって、注射器を撤回します。
   8. 移動マニピュレーター 5.4 mm 後方と 0.4 mm 横。先端が頭蓋骨にエントリ ポイントの近くにあるように注射器を進めます。注射器を撤回し、エントリ ポイントをマークします。
   9. マークの位置に直径約 1 mm の穴をドリルします。
   10. ヒント深さは 6.9 mm 前で測定するよりも、穴からシリンジの先端を挿入します。
   11. トレーサーの 0.2 μ L/分でポンプを使用の 1 μ L を注入します。
   12. 脳から注射器を削除します。
   13. 必要に応じて、微繊維性止血と瞬間接着剤の小さな断片と露出した脳をカバーします。
   14. 感染症を防ぐために、頭皮を縫合ピペット付属生理食塩水を使用して露出した脳をすすいでください。
   15. 脳定位固定装置から、マウスを削除します。通常は 1 h で 30 ° C でインキュベーターで麻酔から回復するマウスを許可します。放置しないでください、マウスまでそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。それは完全に回復した後マウスを他の動物の会社に戻ります。
   16. 3-7 日のマウスを維持します。
2. 成体マウスの上の丘に注射をします。
   1. 先端直径 30-50 μ m のガラス ピペットを準備します。
   2. ガラス ピペットをプラスチック管 (図 2 a) ハミルトン注射器に接続します。
   3. パラフィン液体ガラス ピペット、プラスチック製のチューブ、およびハミルトンの注射器を入力します。
   4. 注射器で噴射ポンプを配置します。
   5. マニピュレーターをガラス ピペットを置き、マニピュレーター 60 ° 垂直軸 (図 2 b) から後方に傾けます。
   6. 2.1.4–2.1.9 を実行します。マニピュレーターの位置は、1.4 mm 後方に,、ラムダの外側 0.5 ミリメートルです。
   7. 頭蓋骨に小さなプラスチック パラフィン フィルムを配置し、トレーサー溶液の約 1 μ L をつけます。すぐにガラス ピペットを進めるし、トレーサー溶液の少なくとも 0.5 μ L でそれを埋めます。
   8. ヒント深さは脳の表面から 3.0 mm、ガラス ピペットを挿入します。
   9. 0.2 μ l/min のポンプを使用してトレーサーの 0.5 μ L を注入します。
   10. ガラス ピペットを脳から削除します。
   11. 2.1.13–2.1.16 を実行します。

3. 固定・ トリミング

1. 注入ペントバルビ タール ナトリウム (60 mg/kg 体重) 腹腔マウス (c57bl/6 j またはTlx3-cre/Ai9、手順 2 で説明したトレーサー注入の有無。しっぽはマウスは完全に麻酔したことを示す、ピンセットでつままれてマウスの応答がないを待ちます。
2. マウスをマウス transcardially²⁰ 0.9% 生理食塩水を灌によって人道的に安楽死させます。
3. 灌によってマウス²⁰を修正 0.1 M リン酸緩衝液 (7.5) で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)。
4. はさみのペアを使用して記述されている²⁰として頭蓋骨を公開する頭皮をカットします。
   1. はさみのペアを使用して公開されているスカルの正中線をカットします。頭蓋骨鉗子を使用してを削除します。
   2. 前とラムダの位置をマーキングが必要な場合は、まず頭蓋骨の 1 つの半球を削除します。前と頭蓋骨、脳に残りのラムダの位置で脳に細いタングステン針を挿入し、残りの頭蓋骨を削除します。
      注: 脳は、4 ° C で PBS で格納することができます。
5. 抗体の抑制的なニューロンの汚損を実行するためには、スライスに脳サンプルをカットします。
   1. Vibratome に脳サンプルを配置します。
   2. 室温で PBS で厚 500 μ m までのスライスを切り 5 (AbScale 法) の手順に進みます。
6. 抗体染色が必要な場合はトリムに脳サンプル ブロック (3 mm 厚) かみそりの刃 (図 3) を使用して、手順 4 (SeeDB メソッド) に進みます。
   注: 脳に格納できる PBS 4 ° C でカットまたはトリミング後。抗体の汚損が必要ない場合 AbScale 法よりも時間が必要なために、SeeDB メソッドをお勧めします。

4. 抗体染色 (SeeDB 法) なしクリア

1. 0.5% α-チオグリセ 20 mL、20% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。
2. 0.5% α-チオグリセ 20 mL、40% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。
3. 0.5% α-チオグリセ 20 mL、60% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。
4. 0.5% α-チオグリセ 20 mL、80% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 12 時間インキュベートします。
5. 0.5% α-チオグリセ 20 mL、100% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 12 時間インキュベートします。
6. 0.5% α-チオグリセ 20 mL、80.2% (w/w) 果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 24 時間インキュベートします。
   注: は、慎重に変形を可能な限り小さく維持するサンプルを処理します。サンプルはすぐに不透明になることが示されるより長いサンプルを孵化しないで。
7. 80.2% 果糖液 (図 1 b) でいっぱい撮像室にサンプルを埋め込みます。必要に応じて、周辺ゴム接着剤の小さなピースを置くことによってサンプルを修正します。商工会議所が深すぎる場合は、サンプルを配置する前に商工会議所のフロア プレートを置きます。
8. イメージングの商工会議所にガラスカバー付きシャーレを置き、皿と水浸漬の目的距離の長い作業と共焦点または 2 光子顕微鏡を用いた画像に水を入れます。励起波長と放出フィルターは、表 1のとおりです。必要に応じて、電動ステージを使用します。

5. 抗体染色 (AbScale 法) をクリア

1. 表 2に説明されているように、試薬を準備します。
2. Sca/es 0 溶液 4 mL を含む 5 mL プラスチック チューブにヘラを使用してスライスを転送し、37 ° c (図 4 b) 穏やかな揺れで 12 時間のそれらを孵化させなさい。
3. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eA2 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 36 h のスライスを孵化させなさい
4. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eB4 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 24 h のスライスを孵化させなさい
5. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eA2 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 12 h のスライスを孵化させなさい
6. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除して 4 mL の PBS を追加し、室温で穏やかな揺れで 6 時間スライスを孵化させなさい。
7. ヘラを使って 2 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。
8. 穏やかな揺れで 37 ° C (図 4)、48-72 時間 AbScale 溶液 1 mL の一次抗体 (表 3) を孵化させなさい。
9. ヘラを使用して 5 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。
10. 穏やかな揺れで部屋の温度で 2 回 2 h の AbScale 溶液 4 mL で孵化させなさい。
11. ヘラを使って 2 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。
12. 蛍光標識二次抗体 (テーブルの材料、1: 100) 穏やかな揺れで 37 ° C で 48 時間 AbScale 溶液 1 mL 中にインキュベートします。
13. 慎重に AbScale 溶液 4 mL を含む 5 mL プラスチック チューブにヘラを使用してスライスを削除、室温で穏やかな揺れで 6 時間スライスを孵化させなさい。
14. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し AbScale 溶液 4 mL を追加し、室温で穏やかな揺れで 2 回 2 h のスライスを孵化させなさい。
15. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し、4% の 4 つの mL を追加 PFA と室温で穏やかな揺れで 1 h のスライスを孵化させなさい。
16. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除して 4 mL の PBS を追加し、室温で穏やかな揺れで 1 h のスライスを孵化させなさい。
17. ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eS4 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 12 h のスライスを孵化させなさい
18. スライド ガラスにスペーサーを配置、スペーサーでのスライスを配置し、Sca/eS4 ソリューションとスライスを浸します。カバーガラス (図 1) とスペーサーをシールします。
19. カバーガラスと共焦点または 2 光子顕微鏡を用いた浸水距離目標の長い作業イメージに水を置きます。必要に応じて、電動ステージを使用します。
    注: サンプルの深い部分は、ラベリングの偏りのないことを確認する表面的な部分に同様にラベル付けするかチェックしてください。
    注: テスト抗体の浸透は、表 3に示すです。

6. セル位置の決定

1. 各位置にスキャンした画像の三次元画像フィルター¹⁴ (図 5 a-5D) を使用して相関値を計算します。
2. (図 5) の相関値のピークの位置を決定します。
3. セル (図 5E) を検索するピークの周りの画像を調査します。

Results

我々 は/Ai9 トランスジェニック マウスのTlx3-creで tdTomato の発現による皮質投射ニューロンをラベルし、サブ大脳投射ニューロンを橋に CTB488 の逆行性のトレーサーを注入して可視化します。脳の左半球は SeeDB メソッドを受けたし、長い作業距離目的浸水を搭載した 2 光子顕微鏡を使用してスキャン (25 X、n. a. 1.1 作動距離 2 mm) と電動ステージ。401 の画像のスタック (512 x 512 ピクセル; ピクセル サイズ = 0.99 μ m) z ステップ = 2.8 30 スキャン位置のそれぞれで μ m が得られました。2 つの細胞の細胞体は脳の領域 (図 6)、および定期的な配向柱状 (図 7 a) を示した光学セクションの広い範囲にわたって表示されていた。さらに、(c57bl/6 j の背景を持つヘテロ接合体として維持される) Crym egfp

Discussion

我々 はマウス皮質層 5 の主要な細胞型の細胞型特異組織の大規模な三次元画像を取得するための手順を提示しています。従来スライス染色に比べると、メソッドは新皮質の三次元組織の決定に有用です。メソッドにより、広いから画像取り込みと深い脳領域は一般的な生体内の2 光子励起顕微鏡または従来の共焦点顕微鏡と比較してし、したがって、皮質細胞の包括的な分析を許可できます。組織。

このメソッドの重要なステップは、抗体浸透です。抗体のサブセットは貧しい浸透厚い標本 (表 3) を示し、したがって、AbScale メソッドには使用できません。本研究で使用される抗体と均一なラベルを取得するには、脳を 500 μ m のスライスにカットする必要があります。小さい抗体フラグメント、例えば、工場または F(ab') 2 フラグメントおよび/またはクリア方法^21,22,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crym-egfp トランスジェニックマウス	MMRRC	012003-UCD
Tlx3-cre トランスジェニックマウス	MMRRC	36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato マウス	ジャクソン研究所	JAX #7909
シリコーンゴムシート	AS ONE	6-611-01	0.5 mm 厚さ
シリコーンゴムシート	AS ONE	6-611-02	1.0 mm 厚さ
シリコーンゴムシート	AS ONE	6-611-05	厚さ3.0mm
シャーレ ファ	ルコン	351008
カバーガラス	松波	C022241
コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 488コンジュゲート	Invitrogen	C22841
コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 555コンジュゲート	Invitrogen	C22843
コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 594コンジュゲート	Invitrogen	C22842
コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 647コンジュゲート	Invitrogen	C34778
26 G Hamilton syringe	Hamilton	701N
インジェクターポンプ	KD Scientific	KDS 310	Pons インジェクション
インジェクターポンプ	KDサイエンティフィ	KDS 100	スーペリアコリキュラス注射
マニピュレーター	成重	SM-15
ペントバルビタールナトリウム	共立製薬	ソムノペンチル
イソフルラン	ファイザー
リドカイン	アストラゼネカ	キシロカイン注射 1% エピネフリン
ドリル	トーヨーアソシエイツ	HP-200
Avitene microfibrillar hemostat	Davol Inc	1010090
Alonalfa	Daiichi-Sankyo	Alonalpha A
Surgical silk	Ethicon	K881H
Incubator	UVP	HB-1000 Hybridizer
Glass Pipett	Drummond Scientific Company	2-000-075
電極プーラー	Sutter Instrument Company	P-97
Paraffin Liquid, light	Nacalai tesque	26132-35
生理食塩水	大塚	1326
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	26126-54
Tungsten needle	Inter medical	Φ0.1 *L200 mm
ビブラトーム	ライカ	VT1000S
50 mL プラスチックチューブ	ファルコン	352070
&α;-チオグリセロール	ナカライ テスク	33709-62
D(-) フルクトース	ナカライ テスク	16315-55
BluTack	Bostik	CKBT-450000
二光子顕微鏡	ニコン	A1RMP
水浸長作動距離対物レンズ	Nikon	CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
水浸長作動距離対物レンズ	Nikon	CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
電動ステージ	COMS	PT100C-50XY
フィルター	Semrock	FF01-492/SP-25
フィルター	Semrock	FF03-525/50-25
フィルター	セムロック	FF03-575/25-25
フィルター	セムロック	FF01-629/56
フィルター	クロマ	D605/55m
5 mL プラスチックチューブ	AS ONE	VIO-5B
2 mL プラスチックチューブ	エッペンドルフ
尿素ナ	カライテスク	35905-35
トリトンX-100	ナカライテスク	35501-15
グリセロール	シグマアルドリッチ	191612
D(-)-ソルビトール	和光	191-14735
メチル-&β;-シクロデキストリン	東京化学工業	M1356
&γ;-シクロデキストリン	和光	037-10643
N-アセチル-L-ヒドロキシプロリン	皮膚必須活性剤	33996-33-7
DMSO	ナカライ テスク	13445-45
ウシ血清アルブミン	シグマ アルブリッチ	A7906
Tween-20 (1.1 g/mL)	ナカライ テスク	35624-15
ヤギ抗マウス IgG (H+L) クロス吸着 セカンダリ抗体, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422
ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
ヤギ抗マウスIgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
ヤギ抗マウスIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
ロバ抗ウサギIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206
共焦点顕微鏡	オリンパス	FV1000
水浸長時間対物レンズ	オリンパス	XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
アンチNeuN	ミリポア	MAB377
アンチニューン	ミリポア	ABN78
アンチ CTIP2	アブカム	ab18465
アンチスタット 2	アブカム	ab51502
アンチ GAD67	ミリポア	MAB5406
アンチ GABA	シグマ	a2052
アンチパルブアルブミン	Swant	235
アンチパルブアルブミン	フロンティア研究所	PV-GO-AF460
抗パルブアルブミン	シグマ	P3088
抗パルブアルブミン	Abcam	ab11427
抗ソマトスタチン	半島研究所	T-4103
抗 c-Fos	CalbioChem	PC38