方法論記事

マウスで個別にアクティブとパッシブのふがいなさを測定

DOI：

10.3791/58048

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2018年8月10日

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1Mouse Genomics Resource Laboratory, National Institute of Genetics, 2Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Research Center for Global Agromedicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物のふがいなさには、人間 (アクティブな馴れ初め) にアクティブなアプローチで人間 (パッシブふがいなさ) に回避反応の減少と増加が含まれます。ここでは、3 つの行動テスト (アクティブふがいなさ、パッシブのふがいなさ、および滞在の手持テスト) マウスのアクティブおよびパッシブのふがいなさを別々 に測定するための詳しいプロトコルについて述べる.

要約

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家畜犬、実験用マウスなどは、ふがいなさは、人間がそれらを簡単に処理することが重要ですの高レベルを示します。ふがいなさには 2 つの行動のコンポーネント: 人間 (パッシブふがいなさ) と人 (アクティブな馴れ初め) に刺激を避けるために不本意。マウスでこれらのコンポーネントを定量化する我々 は以前ふがいなさアクティブ、パッシブのふがいなさの行動テストを開発し、人間の手に滞在する意欲それぞれ 3 分以内に完了するため。得られたデータは、世代あたり分析マウスの数が多いと選択的な繁殖のために使用されました。アクティブなふがいなさテストでは、人間の手とそれに従事する連絡先にマウスの動きを測定します。パッシブのふがいなさのテストは、人間のタッチをマウスに許容期間を測定します。宿泊の手持テストでマウスは人間の手に配置され、その手の親指を使ってゆっくりと触れた動物が手に残っている時間の持続期間を測定します。ここでは、テストについて述べるセットアップと装置の説明、適切なデータ分析を議論。最後に、我々 は結果を解釈する方法を説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

家畜の中に選択的な繁殖はそれらより人間1,2,3との生活に適応する飼いならされた動物の特性に変わった。「ふがいなさ」は飼いならされた動物で認められた一般的な行動特性です。動物のふがいなさの選択的な育成の研究では、家畜化の過程でその表現がどのように変わっているを明らかにします。有名な研究でキツネがふがいなさのため選択的に飼育し、ふがいなさの高レベルを展示したキツネのグループは確立された2。キツネはまた形態、再生、コート色、および生理学的特徴を含む他の表現型変更を示した。選択的繁殖マウスのふがいなさに、人気のある実験動物、家畜の中に様々 な表現型の変化のメカニズムを明らかに助けることができます。

ふがいなさには 2 つの行動のコンポーネント: 人 (アクティブな馴れ初め) と人間 (パッシブふがいなさ)4の回避の削減に積極的に取り組んでいます。以前の研究では、マウスのふがいなさレベルを特徴付ける 3 つの行動テストを設けて: アクティブなふがいなさ、パッシブのふがいなさと滞在の手持テスト5。最初のテストは、その人間と人間の手との接触時間の自発的な取り組みの待機時間を測定することによってマウスのアクティブなふがいなさを定量化するために設計されました。2 番目のテストは、人間の手に触れているに容認のどのくらいマウスを測定することによってパッシブふがいなさを定量化する設計されました。宿泊の手持テストは、人間の手によって穏やかになでて行動の回避を定量化する意図されていた。これら 3 つのアセスメントでは、オープン フィールド機器のみ、デジタル カメラとピンセットの大きなペアを必要があります。彼らは順番に大量の一日ごとに収集するデータを有効にする 3 分以内に完了できます。

以前の研究では、我々 の特徴し、近交系マウス系統の一連を使用してふがいなさ行動の比較: 10 の野生系統、1 つ日本高級マウス由来株および六つの研究室系統5。ほとんど飼いならされた野生株よりも有意に高い受動のふがいなさを示した菌株が、アクティブのふがいなさは 2 つのグループ間に差はなかった。これらの結果から我々 は実験室の緊張の創設者は、飼いならされたマウスの繁殖の歴史の中のアクティブなふがいなさではなく、彼らの受動のふがいなさが選択された主に締結。

次に遺伝的に異質人口6を生成する 8 つの野生のマウス系統を選抜育種を行った。得点の高いアクティブなふがいなさテストで、正常に動物はコントロール群と比較して継代のアクティブのふがいなさを増加しました。この結果は、テストが確実にマウスのふがいなさを測定表示。

ここでは、3 つの行動テストを用いた行動学的指標を測定するため包括的な手法について述べる。まず、我々 は、セットアップおよび必要な装置について説明します。次に我々 は、実験を実行するための手順を詳しく説明、ビデオを介して、データの収集と分析を開発したフリーウェアを使用してデータは言った。最後に、コントロール グループを選択的に繁殖させたマウスのプールを比較する代表的な結果を示す.

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プロトコル

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国立遺伝学研究所 (遺伝研) から動物実験ガイドラインに従ってすべての実験を行ったし、すべてのプロシージャは、動物のケアと使用 (承認品番 26-9) 遺伝研委員会によって承認されました。

1. 動物

  1. 選択的な育成
    1. 交差によって異種の株式 (WHS)6の野生由来マウスを作成 8 交 (MSM、HMI、BLG2、PGN2、KJR、冠動脈疾患、NJL、BFM/2) 任意の近親交配 (兄弟やいとこの間で合う)7を回避しながら。長い「お時間」を表示するマウスを選択することによって第 3 世代 (G3) で開始、選択的な育成を実施 (選択したグループ、ペアを交配の 16 家族) アクティブのふがいなさによるとテスト (手順 3.1 参照)。
    2. 非選択のコントロール グループ (交尾も 16 家族)を介して任意交配 G3 から以降を生成します。代表的な実験 (手順 3.1 3.3 参照) 3 つのふがいなさのテストを使用して両方のアクティブおよびパッシブのふがいなさのパターンを表示するのに選択した (S1) と非選択 (C1) ・ WHS マウス群から得られるマウスを使用します。実験では, グループ (S1 および C1) ごとの 10 の G15 マウスを使用します。
  2. 代表的です対象動物
    1. 3 週齢で両親からすべてのマウスを引き離すし、同腹子、テストまで木材チップを含む標準サイズ プラスチック製ケージを使用して、同性のグループでそれらを収容します。12/12 h ダーク/ライト サイクル (ライトの 6:00 から 18:00) と一定した温度 (23 ± 2 ° C) の下で遺伝研動物施設ですべての動物を維持します。
    2. 食料や水が利用できる自由であることを確認します。人間が通常アクティブなとき一日の部分の間に人間との相互作用を分析する光の期間中に年齢の 6 週間でマウスをテストします。
  3. プロトコルの処理
    1. シリコン チューブで覆われて大きなピンセットを使用して、彼らの尾によって優しくそれらを拾い、マウスを新しいケージに転送します。離乳時両親からそれらを分離し、実験の間に移動するピンセットを使用します。マウスのどれもがふがいなさテストの前に処理を受けるべきです。
    2. ふがいなさテストの直前に実験室にマウスを転送します。
    3. WHS マウスの間に男性の攻撃性を避けるためにテストの後、互いの雄マウスを維持します。

2. 機器

  1. オープン フィールド装置 (400 x 400 x 400 mm、灰色ポリ塩化ビニル) を使用します。
  2. オープン フィールドのクリップ ライトを用いたオープン フィールド (図 1) の上の 450 mm の高さで固定 (100 lux) の中立的な白色の電球を照らします。
  3. 850 mm 三脚 (図 1) を使用してオープン フィールド上に固定、市販のコンパクト デジタル カメラを使用してのすべての動作を記録します。
  4. パッシブふがいなさテスト (珍しい反応) 中に噛まれてから手を保護するためにゴム手袋の下に布手袋を着用します。
  5. ストップウォッチを使用してテスト期間を測定します。

3. テスト

注: 最初の 2 つのテスト (アクティブなふがいなさとパッシブふがいなさ) を 1 分ごとに、行った、1 分未満の滞在の手持テストを行いました。すべての 3 つのテストは、デジタル カメラを使用して記録オープン フィールド装置で行った。Iodophore 消毒手順は、任意動作研究する前にすべての apparats で実行する必要があります。

  1. ための手順アクティブのふがいなさをテスト
    1. デジタル カメラをオンにして録音を開始します。
    2. (ステップ 1.3.1 を参照) 大きいピンセットのペアを使用して尾でゆっくりマウスを拾うし、オープン フィールド機器の中心に家のケージから転送。
    3. ストップウォッチを起動します。
    4. 装置の左下隅に左の手を配置します。
    5. 手のひら上向きを維持し、ゆっくりと着実に指を移動マウスが人間に手を接続するようにします。すべての 4 本の指を小指から人差し指に移動する平均時間をする必要があります約 0.5 秒、サイクルが継続的に繰り返される運動。
    6. 約 13 cm/s、マウスのボディの側面から 10 cm で停止の平均速度でゆっくりと、ネズミのほうへ手を移動します。
    7. マウスは距離を移動しようとした場合に同距離を維持します。マウスが近づくと、同じ位置に手を維持し、少し指を動かし続けます。マウスは、腕を登るしようとする場合は、フリーハンドを使用してフィールドに戻ります。
    8. 1 分後にテストを締結、手を撤回し、パッシブふがいなさのテストに進みます。
  2. ための手順パッシブのふがいなさをテスト
    1. 同じ手順をアクティブなふがいなさテストがマウスの体から 10 cm を停止する代わりに、ゆっくりと指先でマウスをタッチします。
    2. マウスが離れて移動するまで、マウスに連絡、同じ位置で指を残します。マウスが連絡先を解除しようとすると、約 23 cm/s の平均速度で移動、それに従うし、タッチを再開します。
    3. 1 分滞在の手持テストを開始すぐにストップウォッチを再起動後にテストを締結します。
  3. ための手順宿泊の手持のテスト
    1. 尾大きいピンセットのペアを使用して、マウスを持ち上げ、左の手のひらにそっと置きます。オープン フィールド機器の床に近い手を保ちます。
    2. 0.5 秒/ストロークの手を離れるまでは、左手の親指を使用しての平均速度で、マウスをゆっくりストロークします。
    3. 3.3.1 - 3.3.2 の手順を繰り返します 3 x。
    4. 3 番目の試行後停止ビデオ録画。すべてのふがいなさテストは結論今。
  4. 後実験手順
    1. マウスの重量を量るし、大便と小便のオープン フィールドで左の数をカウントします。
    2. マウスを個別にマークを介して耳パンチ。
    3. 装置および実験者の手袋を 0.2 %iodophor 消毒剤に浸したペーパー タオルで拭いてください。
    4. 乾燥したペーパー タオルで装置をクリーニングします。

4. 行動分析

注: 録画する tanaMove バージョン 0.01 (Windows 7)、行動分析 (図 2) のためのイベント記録ソフトウェアを使用してにとどまった。ソフトウェアは、自由に利用できる (補足材料 1)と私たちのウェブサイト (http://www.mgrl-lab.jp/MGRL_software.html) から。テスト条件に盲目であった者は、すべての映像を記録しました。すべての行動学的指標の時間を 0.1 の単位で測定しました。得点中オブザーバーはキーボードで適当な文字を押す (手順 4.1 参照) に指定した動作を指摘します。

  1. ビデオ解析用キーの割り当て
    1. 各動作インデックスのキーを割り当てます。各行動インデックスの適切なキーを使用しては、4.3 の手順で自動的にデータを集計する重要です。
      注: この研究で使用される割り当ては図 3のとおりです。
  2. ビデオ分析
    1. 各録画 3 倍異なる行動学的指標 (図 3 b) を分析します。セルフ グルーミング行動は得点はないです。コンピューターの内蔵スピーカーは、ビデオのタイマー音を聞くために点灯していることを確認します。
    2. TanaMove を起動します。
    3. ドラッグし、tanaMove のウィンドウに分析されるべき動画ファイルをドロップします。ファイルが読み込まれ、データ ファイル [の .csv]ボックスでファイル パスと出力される CSV の名前が正しいことを確認します。
    4. 準備ボタンをクリックします。これは、割り当てられたキーを入力する新しいウィンドウをアクティブにします。
    5. ビデオのファイルを開始する [再生] ボタンをクリックします。ビデオのファイルを一時停止するのに [停止] ボタンをクリックします。
    6. マウスを観測すると、「に向かって」または匂いを嗅ぐに立ってを含めて手に近づいては、 Aキーを押します。マウスがアクティブな馴れ初めテスト中に手へ向かうことがなく"locomoting"を観察するとは、 Rキーを押します。
    7. キーを押しますWの少なくとも 0.3 s (ウィンドウで少なくとも 3 つ間隔) タイマー音が 60 のとき s。
    8. 左の手に入ったビデオ後パッシブふがいなさテストの分析を開始します。マウスを観測するに向かってまたはパッシブふがいなさテスト中に向かって手なしで旅行、マウスを観測手とRのキーに近づいては、 Aキーを押します。
    9. キーを押しますWの少なくとも 0.3 s (ウィンドウで少なくとも 3 つ間隔) タイマー音が 60 のとき s。
    10. キーを押しT 「滞在」マウスが観察される一方宿泊の手持テストで。
    11. 宿泊の手持のテストの後、ビデオ観測を停止する停止ボタンをクリックします。
    12. [戻る] ボタンをクリックし、CSV データ出力の新しいファイル名を入力します。
    13. 割り当てられたキーを入力する新しいウィンドウをアクティブにする準備ができてのボタンをクリックします。
    14. ビデオ映像を再起動してアクティブなふがいなさテストの観測を開始 [再生] ボタンをクリックします。
    15. マウスは「連絡」すべての自主的な接触行動が含まれています人間観察、診断アクティブふがいなさの中に、ジャンプした後の手のひらに着陸など、偶然ではない連絡先は、 Tキーを押します。
    16. キーを押しますWの少なくとも 0.3 s (ウィンドウで少なくとも 3 つ間隔) タイマー音が 60 のとき s。
    17. マウスは、パッシブのふがいなさのテスト中に、体を触るに実験者を使用できるときは、 Tキーを押します。
    18. キーを押しますWの少なくとも 0.3 s (ウィンドウで少なくとも 3 つ間隔) タイマー音が 60 のとき s。
    19. ビデオを停止する停止ボタンをクリックします。
    20. [戻る] ボタンをクリックし、CSV データ出力の新しいファイル名を入力します。
    21. 割り当てられたキーを入力する新しいウィンドウをアクティブにする準備ができてのボタンをクリックします。
    22. ビデオ映像を再起動してアクティブなふがいなさテストの観測を開始 [再生] ボタンをクリックします。
    23. 「ジャンプ」のアクティブな馴れ初めテスト中にマウスが観察されるときは、 Jキーを押します。
    24. キーを押しますWの少なくとも 0.3 s (ウィンドウで少なくとも 3 つ間隔) タイマー音が 60 のとき s。パッシブふがいなさテストの観察を開始します。
    25. 「ジャンプ」のパッシブふがいなさテスト中にマウスが観察されるときは、 Jキーを押します。
    26. 60 でタイマーの音を聞くと、ビデオ観測を停止する停止ボタンをクリックして s。
    27. [戻る] ボタンをクリックし、CSV データ出力の新しいファイル名を入力します。
  3. データを集計します。
    1. 補足 2. xlsmファイル (補足資料 2) と同じフォルダーにすべての生データ ファイル (CSV) を保存します。
    2. 補足 2. xlsmファイルを開き、集計ボタンをクリックします。
    3. 結果を別のファイルとして保存、ふがいなさ動作のさらなる分析のために使用します。

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結果

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以前アクティブな馴れ初め6の高レベルを示した生産 miceandsuccessfully マウスでアクティブなふがいなさの選択的な育成を実施しました。15番目の世代 (G15) でマウスの選択および非選択のグループのテストは、図 4に示すふがいなさの代表の結果。選択したグループからマウス得点高いアクティブふがいなさテストでは、コントロール マウスよりも人間の手との接触のかなり長い期間を出展します。この接触時間は選択的な育成のために使用されるインデックスです。2 つのグループを見出し、歩行、または期間 (図 4 a表 1)、ジャンプで有意差はなかったが、選択したマウスはパッシブふがいなさテストでは、時間のかなり長い期間の人間との接触を容認に高い得点コントロール マウスよりも。さらに、選択したマウスは、大幅に短い歩行とジャンプ (表 1

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ディスカッション

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代表的な結果は、アクティブなふがいなさ、パッシブのふがいなさ、および滞在の手持テストから 9 つの行動学的指標をカバーします。選択した間のスコアの比較群ふがいなさに明らかな違いを明らかにしました。これらの結果を示す 3 つのテストがマウスのふがいなさを測定するため有効であります。

動物のふがいなさレベルは、経験的に定量化することは困難ことができます。いくつかの方法は、鹿、マウス、ラット8,9,10のふがいなさを評価するために開発されています。ただし、これらのメソッドには、個別にアクティブとパッシブのふがいなさが定量化しなかった。以前の研究では、マウス5のふがいなさを定量化するための 3 つのふがいなさテストを開発しました。アクティブなふがいなさテストのスコアを使用して、選択的な育成実験を行ったし、された積極的に正常に繁殖マウスを飼いならす

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業によって支えられた科研費研究 (費) 次のように: 15 H 05724、01491、16 H と 15 H 04289。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オープンフィールド装置O'原 &株式会社。OF-3102400回;400回以上;400mm、灰色がかったポリ塩化ビニル
コンパクトデジタルカメラリコー株式会社CX-5自社生産はラ
テックス無垢手袋AS ONE BioLab、IKG-8002
ストップウォッチセイコーSSBJ018
ヨードフォア除菌剤エコラボ合同会社(クレアジャパン)CL-4123ミクロ・クレーネ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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