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方法論記事

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

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DOI：

10.3791/58077

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2018年11月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

この記事について

サマリー

大きな骨病変を修復するために設計された、新しいバイオマテリアルの数は骨の治癒を高め、骨移植に関連する合併症を克服することを目的と継続的に拡大しています。骨修復のためのバイオマテリアルの前臨床生体適合性テストのための学際的な戦略を紹介します。

要約

大きな非組合骨骨折は、整形外科で重要な課題です。自動車と同種骨移植は、このような病変を治癒に優れている、彼らの使用の潜在的な合併症があります。したがって、材料の科学者は、これらの問題を克服するために合成、生体適合性バイオマテリアルを開発しています。本研究では骨修復のためのバイオマテリアルの評価のための学際的なプラットフォームを提案する.我々 は骨の生物学と免疫学培養破骨細胞 (OC) と骨芽細胞 (OB) アッセイと骨修復、免疫原性、アレルゲン性のマウス モデル体内を含むプラットフォームを開発する専門知識を組み合わせます。実験を実行し、結果を要約、生体材料の生体適合性に関する報告方法を示します。特に、β-リン酸三カルシウム (β-TCP) リン酸ディスクのコンテキストで OB 生存・分化と鉱化作用と OC 生存分化をテストします。また、骨の治癒の初期段階に及ぼす影響を決定するための重要なサイズの頭蓋骨骨欠損マウス モデルにおける骨修復用臨床的に市販材料である β-TCP/コラーゲン (β-TCP/C) フォームをテストしました。並列実験マウスにおける免疫・ アレルギー反応を評価されます。我々 のアプローチは、骨の治癒と修復術に使用する生体材料の生体適合性を予測するために必要なパラメーターの範囲で骨生体材料の生物学的互換性のプロファイルを生成します。

概要

骨修復は血腫形成、炎症から始まる複雑なプロセス、カルスの形成と、1,2を改造します。ただし、潜在的な骨再生は骨破壊1,3のサイズに制限されます。例えば、大きな骨骨折外傷、癌や骨粗鬆症による癒すことができない、非組合骨折と呼ばれます。これらの骨病変は、健康な生理学的な骨の修復と再生を促進する治療を必要があります。現在、自家および同種骨移植は 220 万骨交換の手順と選択4のアプローチ毎年5。これらの手順は、高い成功率を持っている、しかし拒絶4ドナー サイト罹患率や感染骨の限られた可用性などの合併症がある可能性があります。骨再生のための新たな選択肢は、これらの課題に対処するために求められています。

天然または合成高分子、セラミックスや金属細胞と生体分子との組み合わせでのバイオマテリアルの設計は上昇6。生理学的骨治癒と生体材料のコンテキストで癒しの私達の現在の理解は機械的性質など複数の要因と循環と骨折部位7 から細胞を含む複数の局所的・全身的要因によって異なります ,8,9。骨再生のための生体材料は、10 osteogenicity、オッセオインテグレーションを促進することを目指して、理想的に生体適合性、生分解性多孔質 (栄養素、酸素、細胞遊走を促進) です。彼らはまた十分に痛みを和らげるために骨折部位をサポートする強力なする必要があります。さらに、炎症性因子は、癒しのプロセスを開始する必要があります。ただし、生体材料は、過剰な炎症やアレルギー反応を誘発する場合、これを制限または骨11,12の治癒を阻害します。したがって、学際的なアプローチは評価生体材料の骨修復のために開発されなければなりません。

本研究で提案する代表的な材料は、1) Orthovita Vitoss 第三リン酸カルシウムから成る市販海綿骨移植代用品である泡から成るナノサイズ純粋な β-リン酸三カルシウムの前臨床評価リン酸 (β-TCP) 粒子とタイプ 1 コラーゲン (C) (β-TCP/C フォーム) と 2) β TCP ディスク。ここでは、主骨芽細胞 (OB) を使用してこれらの生体材料の生体適合性のテストを示すし、破骨細胞 (OC) 試金、骨修復、T リンパ球増殖培養を含む免疫学的評価の体内モデルとサイトカイン産生と生体内での免疫原性とアレルゲン性、以前に報告された13。

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プロトコル

手順ケアと教育・科学・研究省オーストリアの実験動物の使用のすべてのガイドラインに従う BALB/c マウスで行われた、オーストリア文部省、科学の倫理委員会で承認されました。・研究。

1. プライマリ マウス OB 文化

  1. 新生児マウス頭蓋冠由来酵素消化を使用してから OB の分離
    1. 斬首で 1-2 日古い新生児子犬 (合計 60) を安楽死させるし、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 滅菌 1 ペトリ皿に頭を配置します。
    2. 滅菌はさみを使って皮膚をカットして、首の首筋で頭部を保持します。それをピアスで、calvarium を切開 (約 0.1-0.3 mm)、頭蓋底で頭の後ろに calvarium の下に挿入し、耳し abov 上の正面に後ろから横方向に頭蓋骨の縁に沿ってカットするはさみのペアで電子鼻橋 (図 1)。
    3. 滅菌フィルター分解酵素液 8 mL で切り裂かれた頭蓋骨を孵化させなさい (300 単位/mL コラゲナーゼ タイプ IV と 2.14 単位/ml 当期 II α 最小値必要な媒体 (α-MEM) に溶解) 200 揺れに揺れのインキュベーターで 10 分の 37 ° C で 50 mL の円錐管に最低。
    4. 最初の上澄みを廃棄し、消化液 8 mL を 3 回消化手順を繰り返します。各消化手順後セルを含む上清を収集し、50 mL の円錐管にそれを追加します。消化手順 (約 40 分) が完了するまでは、氷の水のお風呂にセルで 50 mL の円錐管を格納します。
    5. 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心分離機 (真空ポンプに接続するパスツール ピペット)、上清を吸引、1% と 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、α MEM を含む骨培 (BGM) 40 mL で再懸濁しますペニシリン-ストレプトマイシン液。4 組織培養プレート (10 cm) に細胞懸濁液 10 mL を加えます。
    6. 合流 (2-3 日間) まで 37 ° C および 5% の CO2の細胞を培養します。
    7. 合流、古い培地を吸引、1 × PBS (37 ° C) で一度組織培養皿を洗います。PBS を吸引し、1 x トリプシン溶液 0.5% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 各 10 cm 組織培養プレートに 2 mL を追加します。
    8. 5 分の CO2を 37 ° C、5% で 4 培養皿をインキュベートし、セルがプラスチックから切り離されるように倒立顕微鏡とプレートをチェックします。新鮮な BGM の 10 ml、50 mL の円錐管にすべての細胞懸濁液 (合計 8 mL) を転送します。5 ml の新鮮な BGM と同じ 50 mL のコニカル チューブへの転送の各プレートを洗います。
    9. 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心、上清を吸引、新鮮な BGM の 16 mL の細胞を再懸濁します。16 新しい 10 cm 組織培養 (分割 1:4) を含んでいる版 BGM の 9 mL を準備します。各プレートに細胞懸濁液の 1 mL を追加します。
    10. 1.1.6 の手順を繰り返します。1.1.8 を。
    11. 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心、上清を吸引、新鮮な BGM の 10 mL で再懸濁します。セルをカウントし、細胞濃度を計算します。
      注: この手順は、約 7.5 – 8.3 x 105セル/子犬を生成します。
    12. 4 ° C で 5 分間 300 × gで遠心、上清を吸引、凍結媒体含む 10% ジメチルスルホキシド (DMSO)、40% α-MEM と 50% で再懸濁します FBS。細胞懸濁液 1.5 mL を 2 mL バイアルあたり 2 x 10 の6セルの合計クリオバイアルに転送します。
    13. フラッシュは、液体窒素タンクで長期保存用液体窒素でバイアルを凍結します。1 年以内に完全な機能を確保するためのセルを使用します。増殖 (ステップ 1.2)、分化の評価にこれらのプライマリ OBs を使用 (ALP の試金: 手順 1.4。、1.5。) と生体材料の存在下で鉱化作用 (1.6 ステップします。)。共培養 (ステップ 2.3) で骨骨髄由来 OC 前駆体の成熟のためのこれらの細胞を使用します。
  2. OB 拡散の試金
    1. BGM コントロールの主な観測使用標準的な組織培養プレートを追加する前に 24 h の CO2を 37 ° C、5% で 24 ウェル懸濁培養プレートおよび生体材料のサンプルを懸濁液培養皿に 1 mL の 14 mm 径 β TCP ディスクをあらかじめインキュベートします。プラスチックに細胞接着を避けるため。
    2. 前培養液を吸引し、BGM でプライマリ マウス OBs を再懸濁します。24 ウェル培養プレート (1 mL/ウェル) に 4.4 × 104 OBs/cm2を前培養 β TCP ディスク 24 ウェル懸濁培養プレート、コントロール グループを追加します。OBs は、組織培養プレートや生体材料にアタッチされます。
    3. 37 ° C、5% CO2で 14 日間孵化させなさい。潜伏期間中に 2-3 日ごとに媒体を変更し、新鮮な BGM の 1 mL を各ウェルに追加します。
    4. OB 増殖を評価するために懸濁液の培養プレート上に成長した細胞からの信号を除外する新しい井戸に 7, 14 日に β TCP ディスクを転送します。
    5. 古い培地を吸引、BGM (37 ° C) の 0.5 mL を追加し、37 ° C、5% CO2で 30 分間培養皿を孵化させなさい。細胞増殖試薬 x 10 の 55 μ L を追加 (1:10 希釈) も文化に直接。空白セルを BGM の 0.5 mL と 10 倍の細胞増殖の試薬の 55 μ L を含む 3 つの井戸を準備します。37 ° C、5% CO2で 30 分のすべての版を孵化させなさい。
    6. 撤回し上澄みの 150 μ L を各ウェルから黒 96 ウェル プレートに転送し、560 nm 励起と 590 で発光蛍光を読み取る nm。サンプルの測定値から空白の測定値を減算します。
  3. OB の分化ならびに石灰化の試金
    1. BGM コントロールの観測使用標準的な組織培養プレートを追加する前に 24 h の CO2を 37 ° C、5% で 24 ウェル懸濁培養プレートとを避けるために生体試料の懸濁液の培養皿に 1 mL の 14 mm 径 β TCP ディスクをあらかじめインキュベートします。プラスチックに付着。
    2. 前培養液を吸引し、BGM でプライマリ マウス OBs を再懸濁します。24 ウェル培養プレート (1 mL/ウェル) に前培養 β TCP ディスクに 10 の4 OBs/cm2 x 8.8 24 ウェル懸濁培養プレート、コントロール グループを追加します。OBs は、組織培養プレートや生体サンプルにアタッチされます。
    3. BGM に置き換えて OBs の付加の後で BGM、50 μ G/ml アスコルビン酸および 5 mM の β-グリセロリン酸 24 h を含む骨無機培地 (ミリメートル) の 1 mL、37 ° C、5% CO2で 14 日間孵化させなさい。媒体の作りたての MM の 1 mL で 2-3 日を各ウェルに変更します。
  4. OB 分化セル lysates からアルカリ性ホスファターゼ (ALP) 活性評価
    1. MM の付加の後で 7 日、ALP 活性を測定するには、井戸から培養液を吸引、1 mL の滅菌 1 × PBS (37 ° C) で洗います。慎重に添付細胞培養プラスチックや生体材料に残り、-80 ° C でプレートを固定できるように PBS を吸引します。
    2. 24 h 後 (または最大 2 週間)、コントロール組織培養プレートと室温 (RT) OB の換散のため準備する生体材料懸濁液培養プレートを解凍します。生体材料のサンプル プレートに取り付けセルを除外する新しい懸濁液培養プレートに β TCP ディスクを転送します。両方のプレートに x のセル換散バッファー 1 ウェルあたり 75 μ L を追加します。400 揺れ/分でシェーカーの 5 分板を振る。
    3. 0.5 mL 遠心チューブにがれき撤去を RT で 6 分間 300 × gで遠心分離細胞ライセートを転送します。黒 96 ウェル プレートにサンプル細胞ライセート上澄みの 50 μ L を追加し、ALP バッファー (pH 10) ウェルあたり x 2 に溶解 200 μ M 6, 8-フッ素-メチルウンベリフェリルグリコシド酸 (DiFMUP) 蛍光基板から成るソリューションの 50 μ L を追加します。1 x セル換散バッファーと 2 x ALP バッファーの 1:1 の溶液 100 μ L を 2 つの空井戸を設定します。
    4. 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) に至るまで 0.5 から 1:1 溶液 1 x セル換散バッファーと標準曲線を生成する 2 x ALP バッファーに溶解 200 μ M、100 μ L/ウェルつき 8 基準を準備します。
    5. 15 分の 37 ° C で黒のプレートをインキュベートし、358 nm 励起と 455 発光蛍光を読み取る nm。参照基準からブランク測定値とサンプルの測定値を減算します。
    6. 蛋白濃度の比色定量法を用いたタンパク質の総量にセル lysates から ALP 酵素活性を正常化します。準備のウシ血清アルブミン (BSA) 蛋白質基準 0.05 – 2.5 からの範囲で標準的な曲線を生成するためのセル換散バッファー x 1 μ g/μ L 解散。
    7. サンプル セル lysates と重複で BSA 蛋白質の標準を準備します。96 ウェル プレートに 5 μ L のサンプル細胞ライセートや標準 BSA 蛋白質の 5 μ L を追加し、試薬 A の 25 μ L を追加 ' と 2 つの空白の井戸を試薬 b セル換散バッファー x 1 の 5 μ L で 200 μ L。15 分間常温プレートをインキュベートし、吸光度 690 を読む nm。参照基準からブランク測定値とサンプルの測定値を減算します。
  5. OB 分化細胞培養で ALP の汚損によって評価
    1. コントロール組織培養プレートの懸濁液の培養プレートの生体材料 MM 添加後 7 日培養 OBs の ALP を染色します。
    2. 井戸から培養液を吸引し、0.5 mL の 1x PBS (37 ° C) で置き換えます。PBS を吸引し、1 分間常温 10% ホルマリン 0.5 mL にそれらをインキュベートしセルを修正します。
    3. 使い捨てのピペットを使い、10% ホルマリンを吸引し、0.5 mL の洗浄バッファー (1 × PBS では 0.05 %tween20) を追加します。
    4. 10 mL の純水と渦を完全に溶解するまでに 1 つの 5-bromo-4-chloro-3-indolyl リン酸/ニトロ ブルー テトラゾリウム (BCIP/NBT) 基板タブレットを溶解します。ソリューションは、光から保護されて、2 時間以内に使用する必要があります。
    5. 吸引洗浄バッファーと BCIP/NBT 基質溶液 0.5 mL に置き換えるとインキュベート 10 分吸引のため暗闇の中で常温プレート染色液、0.5 mL の洗浄バッファーで置き換えます。
    6. 新しい井戸にステンド グラス β TCP ディスクを転送し、レコード ALP 染色に従来のフラット ベッド スキャナーで ALP 染色プレートをスキャンします。
  6. アリザリン赤 S (ARS) との汚損によって評価 OB 鉱化作用
    1. MM の付加の後のプライマリの OBs 14 日を含む井戸から培養液を吸引洗浄した吸引で 1 × PBS の 0.5 mL で 2 回、PBS と 10 %0.5 mL が 10 分間常温ホルマリンをバッファーを追加してセルを修正します。
    2. 使い捨てのピペットを使い、10% ホルマリンを吸引し、純水の 0.5 mL で 2 回洗浄します。
    3. 固定 OBs 40 mM アルス染色液 (pH 4.2) の 0.25 mL 純水に溶解し、100 揺れ/分でシェーカー上で 10 分間常温プレートをインキュベートを追加します。
    4. 使い捨てのピペットを使い、染色液を吸引、1 mL の純水ですすいでください。不特定を削除するこの手順 5-10 回繰り返すの汚損。
      注: 洗浄ソリューションは、色なしする必要があります。
    5. 超純水水を吸引し、1 mL の冷 PBS を追加します。10 分 100 揺れ/分でシェーカーの RT でプレートを孵化させなさい。
    6. PBS を吸引、新しい井戸にステンド グラス β TCP ディスクを転送およびレコード鉱化作用するフラットベッドスキャナーでプレートをスキャンします。
    7. 10% セチルピリジ ニウム塩化物溶液 0.25 mL を追加し、アルス色素を抽出する 100 揺れ/分でシェーカーで 15 分間室温でプレートを孵化させなさい。
    8. 1.5 mL チューブ、室温 5 分 17,000 × gで遠心培養上清を転送します。
    9. 1:10-1:20 の希釈倍率で抽出物を 10% セチルピリジ ニウム塩化物溶液と塩化セチルピリジ ニウムだけ 10% を含む 2 つの空白の井戸を含む 96 ウェル プレートにサンプル (300 μ L) を追加します。
    10. 7 アルス基準標準曲線を生成する 40 mM アルス染色液 (pH 4.2) 10% セチルピリジ ニウム塩化物溶液を希釈することによって、4 から 400 μ M に至るまでを準備します。
    11. 96 ウェル プレートに重複参照標準 300 μ L を追加します。
    12. ブランク、試料の吸光度を読み取り、520 で基準を参照 nm。
    13. 参照基準からブランク測定値とサンプルの測定値を減算します。

2. マウス OB OC 共培養成熟した OCs を派生させる

  1. 準備とウシ皮質骨スライスの滅菌
    1. 周囲の組織から骨のセグメントをきれいにし、海綿骨と骨髄を削除します。
    2. 24 h 50 ° C で骨を乾燥させます。
    3. 小さな塊に骨をスライスし、スライス (約 300-350 μ m 厚) にカット ダイヤモンドの刃で見た低速を使用して。
    4. 二次ディスク (1 cm2) に 300-350 μ m のスライスをカットします。
    5. 骨ディスク (1 cm2) をきれいにロック可能なガラスの瓶と蒸留水でいっぱいに入れます。超音波風呂に満たされたガラスの瓶を転送し、5 分は、この手順を繰り返します 3 回の超音波を照射します。
    6. 蒸留水を注ぐ、70% エタノールを追加し、5 分間超音波。
    7. 70% エタノールを注ぎ、100% エタノールに置き換えます。
      注: は、4 週間、4 ° C、100% エタノールで骨スライスを保存します。
    8. 生殖不能の条件の下でそれぞれの側に 15 分間の紫外線と骨スライスを照射します。常温無菌培養プレートにさらに使用するまで滅菌骨スライスを格納します。
  2. 骨髄 OC 前駆物質の分離
    1. 200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンのソリューションの腹腔注入による素朴な 8-12 週齢 BALB/c マウスを安楽死させます。
    2. マウスの大腿骨および脛骨の骨髄 OC 前駆体を分離します。
    3. 股関節で体に最も近いポイントから滅菌ハサミ脚を外し、膝と足首の関節で手足を切断、滅菌メスと鉗子軟部組織。骨端を切った。洗い流すし、1 mL の注射器に付いている 27 G 針を使用して細胞懸濁液を取得する 6 cm 滅菌シャーレに 1 mL の BGM で骨髄を中断します。
    4. 6 cm シャーレの BGM と同じ 50 mL の円錐管に伝達 5 ml を洗い、50 mL のコニカル チューブに細胞懸濁液を追加します。4 ° C で 350 x gで 5 分間遠心する BGM、1 nM 1,25-(OH)2を含む OC 分化培地 (DM) で細胞を再懸濁します-ビタミン D3 と 1 μ M プロスタグランジン E2 (1 mL/よく)。
      注: 1 つ BALB/c マウス 1 つ 24 ウェル培養プレートの OC 前駆体の十分な数を提供します。
  3. 生体マウス OB OC 共培養の準備
    1. セルを追加する前に、β TCP ディスク径は 14 mm や牛骨スライス (1 cm2) 1 mL に BGM の 24 h の CO2を 37 ° C、5% で 24 ウェル懸濁培養プレートで事前孵化させなさい。
      注: 牛骨スライスは、生理学的基質制御グループを生体材料の存在下での OC の分化を研究するため。
    2. 8.8 × 104セル/cm2プライマリ OBs 生体材料や制御骨 24 ウェル懸濁培養プレートまたは 24 ウェル培養プレートに上に BGM の停止を追加します。37 ° C と 5% CO2 24 時間で孵化させなさい。
      注記: OBs をプラスチックや生体材料や牛の骨に接続します。
    3. 24 h の骨髄 OC 前駆体主の OBs と 37 ° C、5% CO2で文化 5 日間培養分離された新鮮なを追加します。毎日作りたての OC DM で媒体を置き換えます。その後、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) OC 分化を評価するための OCs を染色します。
  4. OC 分化トラップの汚損によって評価
    1. 2.3.3, ステップから取得された、成熟した多核巨細胞の OCs を特徴付けるコントロール組織培養プレートと生体材料懸濁液培養プレートから培養液を吸引し、1 mL の 1x PBS (37 ° C) を追加します。PBS を吸引し、10 分間常温 10% ホルマリン溶液 1 mL にそれらをインキュベートしセルを修正します。
    2. 使い捨てのピペットを使い、10% ホルマリンを吸引 1 mL の 1x PBS で追加した繰り返しこの手順 3 回、PBS を吸引、1 mL のトラップ バッファー (pH 5) に置き換え、37 ° C、30 分で版を孵化させなさい。
    3. トラップ バッファーを吸引し、1:1 のアセトンと 100% エタノール 1 mL を追加します。30 秒すぐに使い捨てのピペットで吸引アセトン エタノール ソリューションと室温プレートを完全に乾燥、RT でプレートを孵化させなさい
    4. 染色液トラップ、準備 10 mg/mL ナフトール AS MX リン酸 N, N-ジメチルホルムアミド、ディゾルブ 0.6 mg/mL 速い赤紫のトラップ バッファーで塩し、ナフトール AS MX リン酸原液 0.1 mL を加える速い赤紫塩の 10 mL の原液トラップ バッファー。
    5. トラップ染色液 1 mL を加えると 10 分の 37 ° C でプレートをインキュベートし、染色液、トラップを吸引し、反作用を停止する超純水の 1 つの mL を追加します。
    6. 新しい井戸に染色後 β TCP ディスクと牛骨のスライスを転送観察光学顕微鏡を使用して赤いステンド グラス OCs (倍率: 10 X) およびトラップ + 3 以上の核の成熟した OCs を列挙します。

3. 重要な大きさのマウス頭蓋骨欠損モデル

  1. ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を皮下注射 (皮下) 麻酔のための 8 週間の古い BALB/c マウスに。
  2. 100 mg/kg ケタミン 5 mg/kg とキシラジン i. p. の混合物を持つマウスを麻酔、湿潤を保つため、低体温症を防ぐために全体の手順中に 37 ° C で加熱プレートにマウスの目にゲルや軟膏を追加します。足と尾のピンチによって麻酔深度を評価します。
  3. 耳の間の頭の上に毛を剃るし、7.5% ポピドン ヨード ソリューションと 70% エタノールで表面をきれいにします。
  4. 滅菌メス、calvarium を公開し、それをメスで削って右頭頂骨の上の頭蓋骨膜結合組織を削除すると耳の間の頭蓋骨の上に正中矢状切開を確認します。
  5. ワンランク上の右頭頂骨、ectocortex といくつかの endocortex をカットして生理食塩水を一定の灌漑下滅菌歯科トレフィンの直径 4 mm (2000 rpm) を用いた右頭頂骨の重要なサイズの欠陥を作成します。
  6. 硬膜への損傷を防ぐため、残りの endocortex を突破、慎重に頭蓋骨の骨を持ち上げて、ピンセットでそれを削除する小さな骨膜エレベーターを使用します。結果の欠陥は、円形、直径約 3.5 mm にする必要があります。
  7. 漬けで頭蓋骨の欠損を埋める (常温無菌 1 × PBS) 鉗子を用いた β-TCP/C 泡。
  8. 空欠陥を有する年齢をマッチさせた、偽否定的なコントロールの適切な数を準備します。
  9. 生体材料を場所において、2 つの反対ポイントで欠陥の端に組織接着剤の 0.5 μ L を入れてください。
  10. 非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。
  11. 麻酔下のマウスの次の手術を実行する前に無菌状態を維持するために冷滅菌剤ですべての手術器具をきれいに。
  12. 手術後の治療のためには、手術の回復期間中に適切な監視地区 37 ° C で乾燥した清潔な暖房プレートに動物を配置します。彼らが目を覚ますまで、呼吸数、体温、粘膜と 10 分毎の目の色を監視します。
  13. 食品と水の完全復旧まで他の動物から分離でケージに運営意識下マウスを転送します。ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を注入 72 h リターンの一日二回の手術後の鎮痛療法のサウスカロライナが檻にマウスを完全に回復します。
  14. 生体材料の有効性を判断するには、200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの溶液でマウス i. p. を安楽死させます。
  15. 8-12 週間後移植で鋭いハサミで euthanized マウスの首をはねます。
  16. 修正 4.5% の 30 mL で首のないマウスの頭は、ホルマリン固定組織に完全に浸透を保証する 1-2 週間をバッファリングします。
  17. 1 年間、70% のエタノールの長期的なストレージ 4 ° C でに頭を転送します。
  18. 使用マイクロ ct によりまたは骨再生を評価する標準化された頭骨病理組織学的手法で計算されました。:Microct の高解像度で死後のサンプルのスキャンを使用することが可能だ (90 kV、4 分) 2 D および 3 D 矢状および前頭平面で。
  19. 頭骨の組織学のためエタノールの等級を昇順でヘッドを退避し、メタクリル酸メチル グリコールに埋め込みます。
  20. ダイヤモンド見たグリコール メタクリル酸メチルに埋め込まれたブロックをカットし、約 80-100 μ m の厚さにセクションを挽きます。
  21. 新しい骨形成14を識別する Levai Laczko 染色骨標本を評価します。

4.体外免疫応答

  1. 素朴な 8 週間の古い BALB/c マウス i. p. 200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンのソリューションを安楽死させます。
  2. 右側にマウスを置き、左側に毛を剃る、70% エタノールで腹部の左側にある上、肌をきれい。
  3. 次滅菌はさみを使用して胃の上肋骨の後方左側にマウスの皮膚で長さ 10 mm、1 mm 深く切開を行います。
  4. 皮膚を開くし、腹膜を公開します。長いと 1 mm の深い無菌条件下ではさみを使って腹膜切開未満 10 mm を作る。
  5. 脾臓を公開する近位胃を押してください。
  6. 滅菌ピンセットで脾臓を優しく保持し、組織とそれ以下に添付の血管を切断することによって削除します。
  7. 10 ml 滅菌 PBS x 冷 1 の 50 mL チューブにそのまま脾臓を配置します。
  8. 2 滅菌鉗子または 2 滅菌ガラス スライドを使用して脾臓をミンチして単一細胞懸濁液を準備します。
  9. 破片を削除するには、1 mL シリンジのプランジャーを使用して冷 1x PBS で滅菌 40 μ m の細胞のストレーナー通過します。
  10. 50 mL の円錐管に 4 ° C で 10 分の 300 x gで単一細胞懸濁液を遠心分離、吸引、上澄みを廃棄します。その後、赤血球 (RBC) 換散バッファーの 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
  11. RT で 14 分の細胞懸濁液をインキュベートし、ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 媒体の 45 mL の追加によって反作用を停止します。
  12. 4 ° C で 10 分間 300 x gでセル換散後セルを遠心し、上澄みを廃棄します。
  13. RPMI 培 10% の脾細胞を再懸濁します熱非動化政府短期証券、1% ペニシリン ストレプトマイシン溶液、0.1% ゲンタマイシン、0.2% β-メルカプトエタノール、および 1% 非必須アミノ酸。
  14. あらかじめ細胞播種する前に 37 ° C、5% CO2で 24 h RPMI 培地を含む 96 ウェル無菌培養プレート内で β TCP/C の泡を孵化させなさい。
  15. 例えば滴定された番号で脾細胞を追加。 1.25 × 10、5、2.5 x 105と 5 x 10 の5RPMI 培地・添加物、前培養 β TCP/C 発泡の有無を含む 96-well ティッシュの培養皿の井戸に/well。
  16. 追加 10 μ G/ml コンカナバリン a (Con A) 適切な井戸を 100 μ L/ウェルの合計のための媒体に溶解し、37 ° C、5% CO2 72 h で孵化させなさい。
  17. ブロモデオキシウリジン (BrdU) アッセイと細胞増殖を測定します。細胞培養の 48 h で BrdU 標識溶液 10 μ L/ウェルを追加し、さらに 24 時間プレートをインキュベーションしています。
  18. 72 h で、上清を収集し、さらに使用するまで-20 ° C で保存します。
  19. 各ウェルに固定溶液 200 μ L/ウェルを追加し、固定の解決した吸引で 30 分間インキュベートします。抗 BrdU 抗体作業ソリューションの 100 μ L/ウェルを追加し、90 分間インキュベートします。
  20. 抗体溶液を吸引、すすぎ 3 回で 200-300 μ L/ウェル洗浄ソリューションの井戸洗浄ソリューションを削除します。
  21. 基質溶液 100 μ L を追加し、RT で 3-10 分の間孵化させなさい、450 で吸光度を測定 nm。
  22. インターロイキン 1 β (il-1)、インターロイキン 2 (IL-2)、インターロイキン 4 (IL-4) とインターフェロン γ (IFN-γ) を標準的な ELISA を使用して収集した上清中に測定します。

5. 高スループット腹腔内モデル

  1. 100 mg/kg ケタミン 5 mg/kg とキシラジン i. p. の混合物と女性の 6 ~ 8 週間古い BALB/c マウスを麻酔し、ゲルまたは軟膏を湿潤を保つため、低体温症を防ぐために全体の手順中に 37 ° C で加熱板の上にマウスを置くと目に追加します。足と尾のピンチによって麻酔深度を評価します。
  2. 腹部の毛を剃るし、7.5% ポピドン ヨード ソリューションと 70% エタノールできれい。
  3. 白線に沿って皮膚切開 8 mm 長い正中線を作るアルバ。メスを用いた腹膜に小さな切開を行います。
  4. 場所滅菌 PBS は腹腔内に β TCP/-c フォーム移植 (2 mm3x 2 x 2) を浸したまたは偽の年齢をマッチさせたコントロール マウスのための材料を追加なし。
  5. 腹膜の縫合、それぞれの吸収性と非吸収性縫合糸で皮膚します。
  6. 麻酔下のマウスの次の手術を実行する前に無菌状態を維持するために冷滅菌剤ですべての手術器具をきれいに。
  7. 手術後の治療のためには、手術の回復期間中に適切な監視地区 37 ° C で乾燥した清潔な暖房プレートに動物を配置します。彼らが目を覚ますまで、呼吸数、体温、粘膜と 10 分毎の目の色を監視します。
  8. 食品と水の完全復旧まで他の動物から分離でケージに運営意識下マウスを転送します。完全に回復したマウスをケージに戻ります。
    注: この手順は、最小限の痛みを誘発します。手術後の鎮痛療法は通常必要ありません。運営ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を注入動物は痛みの兆候を示す場合皮下または別の適切な鎮痛薬の痛みを軽減します。
  9. マウス 7 日後注入、200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン キシラジン i. p. の解決を安楽死させる
  10. 7 日後注入、洗浄液 1 mL を用いた腹膜キャビティ マウスの頭を押しと、左下腹部腹部に針を挿入、3 mL の冷 PBS の合計のための 25 G 針と注射器、近位を目指しています。
    注: 腹腔液は赤血球の無料する必要があります。
  11. 4 ° C で 5 分間 300 x gで腹腔洗浄液を遠心分離し、il-1、IL-2 と il-4 によるサイトカインの ELISA の測定のための-20 ° C で保存する腹水を収集します。
  12. 上清を吸引、1 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します、トリパン ブルー色素を用いた診断腹腔細胞をカウントします。
  13. 収集スライド ガラスに 5 x 10 の5セルの細胞懸濁液を乾燥させると差動細胞数のスライドを許可します。
  14. 光学顕微鏡を使用すると、合計で 300 のセルの最小値をカウントし、マクロファージ、好酸球、好中球とリンパ球との間を区別するため。

6. 亜慢性皮下モデル

  1. 100 mg/kg ケタミン 5 mg/kg とキシラジン i. p. の混合物と女性 6-8 週古い BALB/c マウスを麻酔、湿潤を保つため、低体温症を防ぐために全体の手順中に 37 ° C で加熱プレートにマウスの目にゲルや軟膏を追加します。足と尾のピンチによって麻酔深度を評価します。
  2. その裏にマウスを置くと、腹部の毛を剃るし、7.5% ポピドン ヨード ソリューションと 70% エタノールで剃毛の表面をきれいに。
  3. 8 mm 正中切開する白線に沿って皮膚をメスと、インプラントの PBS を使用して腹部のアルバは皮膚の下生体材料 (2 mm3x 2 x 2) を浸したまたは偽の年齢をマッチさせたコントロール マウスのための材料を追加しません。
  4. 非吸収性縫合糸で皮膚を縫合します。
  5. 麻酔下のマウスの次の手術を実行する前に無菌状態を維持するために冷滅菌剤ですべての手術器具をきれいに。
  6. 手術後の治療のためには、手術の回復期間中に適切な監視地区 37 ° C で乾燥した清潔な暖房プレートに動物を配置します。彼らが目を覚ますまで、呼吸数、体温、粘膜と 10 分毎の目の色を監視します。
  7. 食品と水の完全復旧まで他の動物から分離でケージに運営意識下マウスを転送します。完全に回復したマウスをケージに戻ります。
    注: この手順は、最小限の痛みを誘発します。手術後の鎮痛療法は通常必要ありません。運営ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を注入動物は痛みの兆候を示す場合皮下または別の適切な鎮痛剤。
  8. 注入のサイトを確認する準備ができたら、200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの溶液でマウス i. p. を安楽死させます。
  9. 8 週間後注入、周囲組織 (1 cm2) と移植部位を切除します。
  10. 一晩 4.5% ホルマリン溶液中組織を修正、パラフィンに埋め込む、4 μ m のセクションにカットします。
  11. 炎症またはマッソンのコラーゲン沈着および線維症のヒアリン ヘマトキシリンとエオシン (H & E) と 4 つの μ m パラフィン埋め込まれたティッシュ セクションを染色します。

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結果

Β-TCP 骨修復における生体材料としての有効性の評価、体外と体内のスクリーニング方法を使用しました。まず、OB 中単独でコントロール対応ベースラインと比較して β TCP ディスク レスポンスを測定しました。図 2は、文化の 7, 14 日目に β TCP ディスクに対して OB 生存率を示しています。代謝活性の高い細胞文化井戸から測定セル実行可能性は、組織培養プラスチック中、この生体材料は強化でも、OB の増殖を抑制することでもないことを示す β TCP ディスクとともに OBs の同じだった。

OBs をさらに評価するには、定性的、定量的アプローチを使用して分化のマーカーと ALP 活性を測定しました。図 2は、文化の 7 日後文化井戸 ALP 酵素活性を示します。媒体は一人で井戸の海底地震計...

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ディスカッション

骨の再生と修復のために開発された代表的な生体材料の生体適合性の前臨床評価のための学際的なアプローチを紹介します。我々 は OCs、海底地震計の応答をテストし、重要な骨欠損内に生体の治癒反応モデル マウスと同様、 in vitroとin vivo免疫応答。法データと生体材料学から派生した結論の要約の作業を示すを目指しました。当社の戦略が骨生体材料の生体適合性の貴重なプロファイルを生成することを示す.

一次電池の試金は、OB、OC 機能の評価に使用されました。OBs は、骨形成と生理学的修復します。実行可能なまま、差別化し、石灰化を誘導する必要があります。本研究では、石化する能力を持つ生理的分化細胞のマーカーとしてアルス、ALP、セル実行可能性の試金を実行する方法を示します。ベースラインを提供するだけで、培地と分化と OBs のプラスチックに無機化に最適化された骨の鉱化作用媒体 (MM)、アッセイするためのコントロールが含まれています。後者のコントロール グループは、生体材料の標準的な参照をしました。OC の評価、我々 は共同 OB...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究プロジェクトは、付与契約第 263363 の下で欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) から資金を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Biomaterials
β-リン酸三カルシウムディスク(β-TCP、14 mm)ディスクは、1150°Cの温度でマッフル炉で焼結されました。生産の詳細な説明は、Zimmer et al(doi:10.1002 / jbm.a.34639)にあります。サンプルをUV照射(片側15分)してから細胞培養に使用しました。
Orthovita Vitoss フォーム (β-TCP/C フォーム)Orthovita2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4200 mM グリシン、2 mM 塩化マグネシウム、2 mM 塩化亜鉛を超純水に溶解し、pH 10 に調整します。
骨成長培地(BGM)&-MEM + 10%熱不活化FBS + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン
細胞溶解バッファー:CyQuant 細胞溶解バッファー 20倍濃縮液Thermo ScientificC7027濃縮細胞溶解バッファーストックを超純水で20倍に希釈します。 
細胞生存率試薬: Presto Blue 細胞生存率試薬Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
DC protein assay kit IIBio Rad5000112DC protein assay kit には、試薬 A、試薬 B、試薬 S、および参照標準用の BSA が含まれています。試薬A'には、20 µL試薬S〜1000 µL試薬A. 
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-AldrichD8418滅菌フィルターDMSO(使用前) 
ディスパーゼII(中性プロテアーゼ、グレードII)Roche4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Phosphatase Assay Kit には、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸 (DiFMUP)、N,N-ジメチルホルムアミド、および 6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン (DiFMU) が含まれています。
ウシ胎児血清(FBS)Sigma-AldrichF7524
ホルマリン溶液中性緩衝液 10%Sigma-AldrichHT501128
グリシンSigma-AldrichG8898
塩化ヘキサデシルピルディニウム(セチルピリジニウム)一水和物Sigma-AldrichC9002
L-アスコルビン酸 2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物Sigma-AldrichA8960
塩化マグネシウム六水和物Sigma-AldrichM2670
MEM α medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
骨形成石灰化媒体(MM)&α;-MEM + 10%熱不活化FBS + 1%ペニシリン-ストレプトマイシン+ 50&マイクロ;g/mL アスコルビン酸 + 5 mM &β;-グリセロリン酸
ペニシリン-ストレプトマイシン  Sigma-AldrichP4333
リン酸緩衝生理食塩水 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
トリプシン-EDTA (0.5%)、フェノールレッドなし (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054濃縮した原液を1x PBSで10倍に希釈します。 
Tween20Sigma-AldrichP1379
超純水: 細胞培養水 パイロジェンフリーVWRL0970-500
洗浄バッファー0.05% Tween20 を 1x PBS に追加。
塩化亜鉛Sigma-Aldrich1.08816
β-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物Sigma-AldrichG5422
24 ウェル懸濁培養プレートGreiner bio-one662102
24 ウェル組織培養プレートGreiner bio-one662160
50 mL コニカルチューブGreiner bio-one227261
96ウェルブラックプレートGreiner bio-one655076
96ウェル透明プレートGreiner bio-one655001
遠心分離機:VWR Mega Star 600RVWR
CO2-インキュベーター:HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
使い捨てフィルターユニット FP30/0.2 CA-SGEヘルスケアライフサイエンス Whatman10462200酵素溶液の無菌ろ過用。
フラットベッドスキャナー:エプソンパーフェクション1200写真プソン
インフィニットM200プロマイクロプレートリーダーTecan
マイクロ遠心チューブ:エッペンドルフチューブセーフロック0.5 mLVWR20901-505
遠心チューブ:エッペンドルフチューブセーフロック1.5 mLVWR21008-959
カースウィップ(軌道および水平) エドマンド・ビューラー 
振盪インキュベーター GFL3032GFL 3032
シングルユースピペット:血清ピペットGreiner bio-one612301
滅菌器具(ハサミ、ピンセット、湾曲鉗子)
組織培養プレート(10cm)Greiner bio-one664960
マウス骨芽細胞-破骨細胞共培養
1α,25-ジヒドロキシビタミンD3Sigma-Aldrich179361000倍濃縮ストック(10 & micro;エタノール中のM 100%)
アセトンVWRケミカルズ22065.327
骨成長培地(BGM)&α;-MEM + 10%熱不活化FBS+1%ペニシリン-ストレプトマイシン
蒸留水カールロス3478.4
タノール(100%vol / vol)VWRケミカルズ20821.365
エタノール(70%vol / vol)VWRケミカルズ93003.1006
ファストレッドバイオレットLBソルSigma-AldrichF3381
ウシ胎児血清 (FBS)Sigma-AldrichF7524
ホルマリン溶液中性緩衝型 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM α Medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-ジメチルホルムアミドSigma-AldrichD4551
ナフトール AS-MX リン酸Sigma-AldrichN4875
破骨細胞分化培地 (DM)&-MEM + 10% 熱不活化 FBS + 1% ペニシリン - ストレプトマイシン + 1 nM 1,25-(OH)2-ビタミン D3 + 1 & マイクロ;MプロスタグランジンE2 
ペニシリン-ストレプトマイシン Sigma-AldrichP4333
リン酸緩衝生理食塩水 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
プロスタグランジン E2 (PGE2)ケイマン・ケミカル・カンパニー90030161000倍濃縮ストック (1 mM エタノール 100%)
酢酸ナトリウム三水和物Sigma-AldrichS7670
酒石酸ナトリウム二塩基性二水和物Sigma-AldrichS8640
滅菌器具(ハサミ、鉗子、メス)
TRAP緩衝液 pH 5.040 mM 酢酸ナトリウム、10 mM 酒石酸ナトリウムを超純水に溶解し、pH 5 に調整します。
超純水:細胞培養水パイロジェンフリーVWRL0970-500
24ウェル懸濁培養プレートGreiner bio-one662102
24ウェル組織培養プレートGreiner bio-one662160
50 mLコニカルチューブGreiner bio-one227261
遠心分離機:VWR Mega Star 600RVWR
CO2インキュベーター:HeraCell 240Thermo Scientific
Diamondウェーハブレード(10.2 cm x 0.3 cm)Buehler
Isomet低速鋸ビューラー
ペトリ皿(6 cm)Greiner bio-one628,161
スクリューキャップガラス瓶 20 mLCarl RothEXY4.1
使い捨て滅菌シリンジ 1 mLヘンリーSchein Animal Health9003016
使い捨てピペット:血清ピペットGreiner bio-one612301
滅菌針:皮下注射針 RW 27 G x 3/4''HenrySchein Animal Health9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq)Richter Pharma AG
麻酔:ケタミン(ケタミドール)、キシラジン(ロンプン)リヒターファーマAG / バイエルヘルスケア
コールド滅菌剤:SafeSept MaxHenry Schein アニマルヘルス9882765
エタノール(70%vol / vol)VWRケミカルズ93003.1006
眼軟膏:VitA POS 5 gUrsapharm
通常の生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム溶液)フレゼニウスカビ
リン酸緩衝生理食塩水1x(PBS)pH 7.4Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック 
ポビドンヨウ素溶液:Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 緩衝ホルマリンCarl Roth2213.6
組織接着剤:Histoacryl 5 x 0.5 mL B.ブラウン外科1050060
個人用保護具:手術用手袋、キャップとマスク、ガウンヘンリーシャイン動物衛生1045073、1026614、9009062、370406
滅菌器具(メス、はさみ、鉗子、針ホルダー)
滅菌針:皮下注射針RW 27 G x 3/4 ''および30 G x 1/2 '' ヘンリー・シャイン アニマルヘルス9003340、9003630
使い捨て滅菌シリンジ 1 mLヘンリー・シャイン アニマルヘルス9003016
加熱プレート:PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
滅菌ガーゼ綿棒ヘンリー・シャイン アニマルヘルス220192
滅菌使い捨てメス (Figur 20)ヘンリー・シャイン アニマルヘルス9008957
外科/歯科用ドリル:Implantmed SI-923W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH16929000
ハンドピースタイプS-IIのW&H Dentalwerk Bürmoos GmbH30056000
トレフィン、直径4 mmHager&Meisinger GmbH229040
灌漑チューブセット2.2 mW&H Dentalwerk Bürmoos GmbH4363600
骨膜エレベーター 2 mm / 3 mmヘンリー・シャイン アニマルヘルス472683
非吸収性縫合糸:ポリエステルグリーン、DS19、メット 1.5、USP 4/0 75 cmヘンリー・シャイン アニマルヘルス300715
in vitro 免疫応答
安楽死のための麻酔:ケタミン(ケタミドール)、キシラジン(ロンプン)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU(比色)アッセイキットSigma-Aldrich11647229001このキットには、BrdU標識溶液、固定溶液(FixDenat)、抗BrdU抗体溶液、洗浄バッファー、基質溶液が含まれています。 
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
培養培地 脾細胞RPMI 培地 + 10% 熱不活化 FBS + 1% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液 + 0.1% ゲンタマイシン + 0.2% ß-メルカプトエタノール + 1% 非必須アミノ酸
エタノール (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific 
GentamicinGibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック 
マウスIL-1βELISA レディゴー!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
マウス IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
マウス IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
マウス INF-γELISA MAX StandardBioLegend430801
非必須アミノ酸溶液Gibco、Thermo Fisher Scientific 
ペニシリン-ストレプトマイシン Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック 
リン酸緩衝生理食塩水 1x (PBS) pH 7.4Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック 
赤血球(RBC)溶解バッファー:BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640培地、HEPESGibco、Thermo Fisher Scientific 52400025
&β;-メルカプトエタノールGibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック 
50 mL コニカルチューブGreiner bio-one227261
96 ウェル組織培養プレートGreiner bio-one655180
遠心分離機: VWR メガスター 600RVWR
セルストレーナー 40 & マイクロ;mBD Bioscience352340
Infinite M200 ProマイクロプレートリーダーTecan
使い捨て滅菌シリンジ 1 mLHenry Schein アニマルヘルス9003016
滅菌手術器具(鉗子、スライドガラス)
<強力>ハイスループット腹腔内モデル
麻酔:ケタミン(ケタミドール)、キシラジン(ロンプン)リヒターファーマAG / バイエルヘルスケア
コールド滅菌剤:SafeSept MaxHenry Schein アニマルヘルス9882765
エタノール(70%vol / vol)VWRケミカルズ93003.1006
眼軟膏:VitA POS 5 gUrsapharm
IL-1&β;ELISA レディゴー!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
マウス IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
マウス IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
ポビドンヨウ素溶液:Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining KitThermo Scientific9990700細胞数の違い。
加熱プレート:PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
血球計算盤:ノイバウアーチャンバーカール・ロスPC72.1
非吸収性縫合糸:Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
吸収性縫合糸:ポリソルブCovidienSL-5628
サイトプシン用シャンドン遠心分離機Thermo Scientific
使い捨て滅菌シリンジ 1mLヘンリー・シャイン アニマルヘルス9003016
滅菌ガーゼスワブヘンリー・シャイン アニマルヘルス220192
滅菌針 皮下注射針 RW 27 G x 3/4インチと25Gヘンリー・シャイン アニマルヘルス9003340、420939
滅菌手術器具(メス、はさみ、鉗子、ニードルホルダー)
トリパンブルー溶液0.4%Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック 15250061
亜慢性皮下モデル
麻酔:ケタミン(ケタミドール)、キシラジン(ロンプン)リヒターファーマAG / Bayer HealthCare
冷滅菌剤:SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
エタノール(70%vol / vol)VWRケミカルズ93003.1006
眼軟膏:VitA POS 5 gUrsapharm
リン酸緩衝生理食塩水 1x (PBS) pH 7.4Gibco、Thermo Fisher Scientific 
ポビドンヨウ素溶液:Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 緩衝ホルマリンCarl Roth2213.6
加熱プレート:PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
非吸収性縫合糸:Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
個人用保護具:外科用手袋、キャップ、マスク、ガウンヘンリー・シャイン アニマルヘルス1045073、1026614、9009062、370406
使い捨て滅菌シリンジ 1mLヘンリー・シャイン アニマルヘルス9003016
滅菌ガーゼ綿棒ヘンリー・シャイン アニマルヘルス220192
滅菌器具(メス、はさみ、鉗子、ニードルホルダー)
滅菌針:皮下注射針RW 27 G x 3/4'' ヘンリー・シャイン動物衛生9003340、420939
10010023エマイクロシェーエト 1001002310010023105000641575003711140050151401221001002331350010マウス1001002310010023

参考文献

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