動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

サマリー

ポリソーム分離灌流マウスの心臓でプロファイリングを実行するためのプロトコルをご紹介します。心の灌流、プロファイリング、ポリソーム Mrna、Mirna、・ ポリソーム プロテオーム解析に関してポリソーム分数の解析法について述べる。

要約

タンパク質翻訳のダイナミックな変化の研究では、特殊なメソッドを必要とします。ここで虚血と再灌流ポリソームのプロファイリングと相まって分離灌流マウスの心臓を使用する新規合成される蛋白質の変化を調べた。タンパク質翻訳のダイナミックな変化をさらに理解する私たちは (ポリゾームまたはポリソーム) ゾル性細胞質のリボソームで読み込まれたともミトコンドリア ポリソームを回復し、mRNA とタンパク質の分布を比較して Mrna を特徴と、高効率分数 (多数リボソームが mRNA に付着)、低効率 (少ないリボソームが付着) ミトコンドリア ポリソームと非翻訳分画も含まれています。Mirna が翻訳されているが, 翻訳の効率を減らす Mrna に関連付けることも、分数の miRNAs の分布を調べた。グローバル ・虚血、再灌流の 30 分後と 30 分の終わりに、基底の灌流条件下で Mrna、Mirna、および蛋白質の分布を調べた。この分析を達成するために使用されるメソッドの紹介-特に、これとしてショ糖密度勾配からの蛋白質の抽出の最適化へのアプローチはないの前に記載されている-いくつかの代表的な結果を提供して。

概要

中心部は、(I) 虚血と再灌流 (R) ダイナミックなファッションでの傷害に応答します。ただし、応答の中にタンパク質合成に急性の変化に少し洞察力があります。これに対処するため行ったリボゾームとポリソーム、細胞質から並進規制要因の再分配を反映したタンパク質豊富に変更を識別するために¹をプロファイリング ポリソームの確立方法の利点と新しく合成されたタンパク質 (Nsp) の増加します。私の設定で/R、新しい Mrna²; の転写と一貫性がないタイム フレームでの蛋白合成の増加が発生しますまた、mRNA 発現および蛋白質量の不一致は、報告された³をされています。これらの理由から、タンパク質翻訳を反映して動的プロテオームの変化を分析することを選びました。これを行うには、我々 はポリソーム分数の mRNA を定量化し、ポリソーム分数のタンパク質組成を分析します。最後に、マイクロ Rna (miRs) Mrna の翻訳の可用性を調節するタンパク質翻訳^4、5の効率を妨げることができますので、我々 の分布を調べた miRs ポリソーム画に焦点を当て、私への応答/r.

マウス単離蛍光灌流モデルと持続灌流、30 分虚血流入なしと虚血後再灌流の 30 分, 30 分後の基底条件下で収穫された組織を使用決定しました。心臓組織を可溶化し、ショ糖密度勾配をポリソームを区切ってそれぞれプロテオーム解析と Mrna と PCR、マイクロ アレイ、miRNAs の選択的検出が続きます。このメソッドの組み合わせを表す NSPs、マイクロ Rna、mRNA の同時検出だけでなく、nontranslating の分数の間調節タンパク質、マイクロ Rna、mRNA の再配布を有効にするプロテオームを理解するための強力なアプローチ低効率ポリソームと高効率ポリソーム (図 1参照)。この過程の動的調節への洞察力は、神経: Eif2 など mTOR 因子のリン酸化の詳細な分析によって拡張されます。これらの個々 のステップは、今詳細に説明します。

プロトコル

すべての動物の研究は制度のガイドラインに従って実施されますされ、機関動物のケアと使用ヒマラヤスギ シナイ医療センター委員会によって承認されました。

1. 蛍光マウス心臓血流

1. マウスの心臓虚血と再灌流の蛍光灌流
   1. 管理腹腔内ペントバルビ タール ナトリウム 70 mg/kg (8 週齢、オス、C57BL6/j) の大人のマウスに。ピンチをつま先に撤退の欠如によって深い麻酔を確認します。
   2. 腹腔内ヘパリン 500 とており U/kg。
   3. 胸骨切開を介して胸を開きます。横隔膜を開き、前方腋窩軸に肋の国境に沿ってカットします。その後、胸郭を開く完全に前肢まで前方腋窩軸をカットします。後、心を可視化、上行大動脈を鉗子でクランプし、急速に中心部を切除します。死は、外れると出血によるものです。冷たいクレブスに中心を置く (塩化ナトリウム 6.9 g/L、KCl 0.35 g/L、NaHCO₃ 2.1 g/L、KH₂PO₄ 0.16 g/L、MgSO₄ 0.141 g/L、ブドウ糖 2 g/L、CaCl₂ 0.373 g/L)。
   4. 鈍い先端針で大動脈を cannulate し、一定の圧力モードでクレブス ソリューションと逆行性心臓を灌流します。
   5. 15 分間の安定期間後、30 分の 30 分間再潅流のグローバル ・虚血心を対象します。
   6. 15 分ベースライン灌流後、30 分の虚血、または 30 分再灌流後の心を収穫します。アトリア、切り落とすとスナップ凍結組織を液体窒素で。
   7. 使用するまで-80 ° C で保存します。

2. 組織の均質化、可溶化、およびショ糖密度勾配沈降

1. グラデーションの準備
   1. 100 mL のショ糖、食塩 2.5 M の 4 mL を混合の 2 解 (15% と 50%) を準備します。
      0.8 mL MgCl₂ 1.25 M;1 mL トリス-HCl 1 M, pH 7.5;15 g や 50 g のショ糖 (15%、50%、それぞれ);純水 100 mL に到達するにはキシレンシアノール (0.02 mg/mL) 15% 溶液の色に
   2. 各ソリューション (0.22 μ m フィルター) をフィルター処理します。
   3. グラデーションは、使用日各ショ糖液 40 mL を準備し、シクロヘキシミドを 100 μ g/mL の最終的な集中を達成するために各ソリューションに追加
      1. 15% と 50% の糖溶液との間のミックスを準備するのにグラデーション メーカーを使用します。
      2. 15% ショ糖密度勾配の 5 mL と左室を埋める
      3. 50% ショ糖密度勾配を持つ右の区画を記入します。
      4. 水道の蛇口を開き、マグネチックスターラーで 2 つの小さな区画をかき混ぜるにポンプのスイッチ
      5. 使用管は、薄い壁で超遠心分離管に流れる混合のショ糖液を許可する 2 番目のタップにリンク。最終巻は、約 10 mL になります。
   4. 4 ° C でグラデーションを続ける (必要な場合は一晩がより長くない)
2. 心臓組織の均質化
   1. (ショ糖勾配分別の変更) のフィルター処理された換散バッファーの polytron の新鮮なまたは冷凍の中心を均質化 100 mM KCl、20 mM Tris pH 7.5、5 mM MgCl₂0.4% を含む NP 40。ポリソーム構造、0.1 U RNase 阻害剤、プロテアーゼ阻害剤カクテル (50 mL の 1 錠) を維持するために 100 μ g/mL シクロヘキシミドにはが含まれます。
   2. ライセートを孵化に氷の 15 分。
   3. 不溶性物質を除去し、上澄みを集め 4 ° C で 15 分間 18,000 × gで遠心分離機します。
   4. タンパク質の定量、RNA の隔離と RNA 整合性の解析 (図 2参照) の 50 μ L をぜひご予約ください。
   5. グラデーションの上に上清 (500-100 μ L) を層し、の換散バッファーと管のバランスをとる。
3. 堆積と分数のコレクション
   1. 37,000 回転スイング バケツ ローターで 4 ° c で 120 分間遠心を実行します。メーカーによると、これは 228,000 x gで最大半径に対応します。
   2. 17 分 (各約 600 μ L 分画) として常時監視を 254 で吸光度のマイクロ遠心チューブ用の各グラデーションを収集 nm (OD₂₅₄)。
   3. 一部のコレクターのプログラムは次のよう。
      1. (グラデーションの前にチューブに含まれる液体に対応する) コレクションの最初の 3 分を破棄します。
      2. 4 ~ 19 分、17 分に 1 mL/分の速度で分数を収集します。
   4. それぞれを収集はすぐに氷で分数を配置します。彼らがすぐに処理されていない場合は、-80 ° c のサンプルを凍結します。典型的なグラデーションの UV デンシトメトリー トレースが収集される図 1に示します。

3. 分離と Mrna はポリソームと Nontranslating 分画の分析

1. MRNA の抽出
   1. 彼らはコレクションの後フラッシュ凍結された場合、氷上では、分数を解凍します。
   2. 新鮮な管に各画分の 200 μ L を転送します。
      注: この手順では、2 つ以上の連続した画分をプールできる一緒に。それは慎重にポリソームと非ポリソームの分数がちゃ OD₂₅₄グラフを分析後されるべきであります。
   3. 10 追加ルシフェラーゼ正規化の目的のために各サンプルに内部統制として RNA の ng。
      注: ルシフェラーゼ プライマーは、結果を正規化する内部統制として使用する必要があります。
   4. 各チューブに 700 μ L の RNA 抽出試薬 (フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の単相性ソリューション; 参照材料テーブル) を追加します。よく混ぜ、常温 (室温) 5 分管を孵化させなさい。
   5. 室温 2 〜 3 分間 15 s. 加温の 140 μ L のクロロホルムと渦を追加します。
   6. 遠心分離機の 4 ° C で 12,000 × gで 15 分のサンプル
   7. 慎重に上部の水相を新しいチューブに転送します。
   8. 分数の RNA 含量は高いため、各チューブにキャリアとして 10 μ g のグリコーゲンを追加します。
   9. 各チューブに 350 μ L のイソプロパノールを追加します。よく混合し、収量を高めるため 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
   10. 4 ° C で 12,000 × gで 15 分間遠心します。
   11. 上澄みを廃棄し、RNA のペレットを洗浄する 75 %700 μ L エタノールを追加します。
   12. 4 ° C で 7,500 × gで 5 分間遠心
   13. エタノールを削除し、10-15 分の乾燥ペレット空気。
       注: は、水の完全な可溶化をできなくなります過剰 RNA ペレットを乾燥します。
   14. RNase フリー超高純度 H₂o. の 50 μ L の RNA ペレットを再懸濁します
   15. 55 ° C で 10 分間のサンプルをインキュベートします。
   16. 各サンプルの 2 μ L を使用して品質と抽出された RNA の量を測定し、-80 ° C で保存
2. 逆のトランスクリプションと qPCR
   1. 逆のトランスクリプション cDNA 合成の 4 μ L を使用して 20 μ L 反応キット (材料の表を参照してください)。サンプルの数によるとスーパー ミックスを準備します。各管に必要なボリュームを転送し、各管に入力 RNA の 5 μ L を追加します。このボリュームは、Taq ポリメラーゼ労働条件の範囲に関連する修正ことができます。
   2. メーカーが推奨する次のプログラムでサーマルサイクラーにチューブを孵化させなさい: 25 ° C で 5 分、46 ° c、20 分 20 分逆のトランスクリプションおよび 95 ° C で 1 分の逆転写酵素の不活化
   3. QPCR をプライマーのペアごとに最適化されたプログラムを実行します。
      注: 分数で特定の Mrna の存在を検出するため等しいボリューム (隔離された RNA) の各画分からは逆のトランスクリプションの使用ください。
3. 結果の分析
   1. 興味の遺伝子と、ルシフェラーゼの Ct 値を使用して、デルタ Ct 値を計算するには
   2. (表 1) の異なる画分での mRNA の分布を視覚化するすべての画分に含まれる mRNA の総額の割合として各分数デルタ Ct 値を表現します。

4. 分離とポリソーム分数と分数の Nontranslating からの Mirna の解析

1. MRNA とマイクロ Rna の抽出
   注: このプロトコル変更がいくつかの製造元の指示に従います。
   1. グリコーゲンとスパイクの制御を解凍します。氷の上を保ちます。
   2. プールされたサンプルを 200 μ l 添加するマイクロ Rna 抽出試薬の 700 μ L を追加します。
   3. グリコーゲンの 1 μ g/μ L を追加し、ピペットを使用してそれを均質化します。室温で 5 分間インキュベートそれ。
   4. 1.6 10 制御スパイクで⁸倍の 3.5 μ L を追加し、それを混ぜます。
   5. クロロホルムと渦を 200 μ l 添加少なくとも 15 秒のためにそれ。
   6. 室温で 3 分間インキュベートします。
   7. 4 ° C で 15 分間、12,000 × gで遠心分離
   8. ピペットを使用して、新しい 1.5 mL チューブに上清を転送します。中間と下部のフェーズを破棄します。
   9. 上清に 1.5 x 量の 100% エタノールを加え、それを混ぜます。
   10. マイクロ Rna 抽出列に 700 μ L のこの混合物を転送し、15 の全速力で遠心分離機 RT で破棄フロースルー; s任意の残りのサンプルでこの手順を繰り返します。
   11. 列にバッファー 1 の 700 μ L を追加し、15 の全速力で遠心 RT; s流れを破棄します。
   12. 列にバッファー 2 の 500 μ L を追加し、15 の全速力で遠心分離機 RT; s流れを破棄します。
   13. 列に 80% エタノール 500 μ L を追加し、フルスピードで RT; で 2 分間遠心流れを破棄します。
   14. 脱帽新しい 2 mL のチューブ、蓋を開けるし、RT でフル速度で 5 分間遠心分離機のそれの列を転送します。流れを破棄します。
   15. 列と遠心分離機完全にそれは右で 1 分の溶出液氷の上速度または将来の分析-80 ° C で保存に RNAse フリー水の 16 μ L を追加します。
       メモ: 2 マイクロリットル各サンプルは、OD 解析に使用できます。
2. 逆のトランスクリプション
   1. 氷の上を準備します。各 20 μ RT-PCR の反作用の miRNA RT バッファーの 4 μ L、核酸の 2 μ L、総 RNA、2 μ L の酵素 RNAse 自由水の 3 μ L の 9 μ L を追加します。それを混ぜるし、簡単にスピンダウンします。
   2. 熱 Cycler を以下のように設定します。
      37 ° C、60 分;
      95 ° C、5 分。
      4 ° C を保持します。
   3. 熱 cycler からチューブを外し、RNAse フリー水を 200 μ l 添加します。-20 ° C で保存したり、リアルタイム pcr 法に進みます。
3. リアルタイム PCR
   注: このプロトコル 96 well プレートの形式に従います。氷の上の反応混合物を準備します。
   1. PCR 反応混合物を準備し、プロトコルによって受け入れられる範囲によると (上記 Mirna) から cDNA を追加します。バッチで複数の反応を用意できます。
   2. 各ウェルに 25 μ L の PCR ミックス + cDNA の合計を追加します。
   3. 光プレート シールを使用してプレートをシールします。
   4. 常温 1,000 × gで 1 分のプレートを遠心します。
   5. リアルタイムのサーマルサイクラーのプログラムは次のよう。
      15 分; 95 ° C の最初のライセンス認証手順
      3 ステップ サイクリング: 15 94 ° C で変性 s;30 55 ° C で熱処理 s;30 70 ° C で拡張子 s (蛍光データ コレクションを実行)。40 サイクルを追加します。
      融解曲線サーマルサイクラー既定によると。
4. 比較分析
   1. 正規化の例 (表 2参照)。
      1. SCM の最小値を見つけます。
      2. この最小値 SCM 値を正規化します。
      3. 利子 (MOI) および参照の遺伝子 (REF) の miRNAs の Ct 値からこの値を減算します。
      4. 2^-ΔCt式を使用してデータを分析します。

5. プロテオーム解析

1. ポリソーム分数からの蛋白質の抽出
   1. 3 最終的な分数に収集したショ糖分数を結合します。重い(4、5、6、7 のショ糖濃度が最も高いプールの分数で高効率ポリソーム; 勾配管の下部) として分数をマーク光(プールされた分数 8、9、10、11 で低効率ポリソーム; の中間、勾配管) と非翻訳(プールされた分数 12、13、14、15 最低の濃度のショ糖の; 勾配管の上部)。プールされた分数に対して蛋白質の試金を行います。
   2. トリクロロ酢酸 (TCA) の株式を 100% を準備し、暗闇の中で 4 ° C で保存します。100% の 60 μ L で 0.5 mL サンプルをミックス TCA と暗闇の中で一晩-20 ° C で孵化させなさい。
      注: は、1.5 mL 低蛋白保持管 (材料の表を参照) を使用します。
   3. 一晩インキュベートした後雪解けの氷と 15,000 × g、30 分破棄上清の 4 ° C で遠心分離機のサンプルを実行します。
      注: サンプルの総蛋白質の 100 μ g チューブ下部に表示されるタンパク質のペレットを与えます。
   4. -20 ° C のフリーザーでアセトンをチル済み。蛋白ペレットと 15,000 × g、15 分破棄上清の 4 ° C で遠心分離機に冷アセトン 0.5 mL を追加します。この手順を 2 回繰り返します。
   5. 空気は乾燥ペレットです。50 mM トリス塩酸バッファー (pH 8) の 360 μ L でペレットを再懸濁します。
      注: 必要な場合は、ペレットを再懸濁しますにパルス超音波発生装置を使用します。
   6. 0.1 M ジチオトレイトールが 40 μ L を追加 (最終濃度 10 mM) し, 0.15 M ヨードアセトアミド 45 分追加 50 μ L のシェーカーに 55 ° C で (最終濃度 17 mM) し、暗闇の中で 30 分間シェーカーで室温で孵化させなさい。
   7. トリプシン溶液を準備: 50 mM 重炭酸アンモニウムの 100 μ L でトリプシンの 20 μ g を再懸濁します。1:50 (w/w) で、トリプシン溶液量に応じたサンプルを加えるトリプシン: 蛋白比、pH が 8 を確認し、37 ° C でシェーカーで一晩インキュベートします。
      注: 追加 1 M 重炭酸アンモニウム 8 に pH をもたらすため。
   8. トリプシン消化したクールなサンプルでは、簡単にベンチの遠心分離機、遠心追加 10% ギ酸 pH 2-3 トリプシン活性をクエンチしサンプルの脱塩に進みます。
      メモ: サンプルの脱塩の μ 溶出プレートを使用します。
   9. 吸着の井戸の条件 3 回続いてエアコン 0.1% ギ酸の 200 μ L で 3 回真空を利用したメタノールの 200 μ L で 96 well プレートです。サンプルをロードし、サンプル洗浄 3 回 0.1% ギ酸の 200 μ L を使用してを実行します。低蛋白保持 0.5 mL チューブに 2 回 50 %acetonitrile/0.1% ギ酸の 100 μ L のサンプルを溶出します。
      注: 溶出サンプルゆっくりと最初に重力を使用して続いて低真空します。
   10. コンセントレーターを使用して乾燥するサンプル溶出液を蒸発させるし、いずれかを直接質量分析またはストアを運ぶ使用まで-80 ° c。
2. 質量分析法による解析
   1. 50-100 μ L の各ペレット (トリプシンのペプチドから成る) を再構成し、質量分析計に 1 μ L を注入します。
      注: は、LC ・ MS/MS 信号の最大強度を取得する再構成やインジェクションのボリュームを最適化します。私たちの場合は、最大信号 (総イオン電流;TIC) でスキャンの心に 2E9 1E8 の範囲にあった。
   2. トラップ列 C18 を使用 (300 × 5 mm、5 μ m、100 μ m 内径) が続いて C18 カラム (75 × 250 mm、2 μ m、100 μ m 内径) を用いたペプチド分離 275 ° C、2 にスプレー電圧 300 nL/分セット ナノ ソース キャピラリー温度で流れの速度設定と kV。
   3. 90 分 5-35 %b、95% B 7 分と 25 分 (a: 0.1% ギ酸/水とアセトニ トリルの b: 0.1% ギ酸) を 5 %b で平衡を保持している、3 分間 35-95 %b の線形グラデーションを適用します。MS2 CID モードを使用して各 MS1 スキャンから 15 の最高強度イオン スペクトルを取得します。3 質量分析法は、分析サンプルごとにレプリケートします。
      注: 最適化し、実験条件および特定の質量分析装置のあなたのサンプルに適したパラメーターを使用します。条件/パラメーター セクション 5.2 で説明します。使用され、私たちの研究室で最適化します。
3. タンパク質同定・定量
   1. 質量分析の分析の後に、生スペクトル ファイルを MSConvert ソフトウェア (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html) を使用して互換性のある mzXML ファイルに変換します。
   2. 検索条件での SEQUEST 検索エンジン (最新正規レビュー); UniProtKB/スイス人 Prot マウス データベースなどに変換されたファイルを送信します。トリプシンを使用して半酵素ダイジェスト (KR 後/-);最大 2 逃した亀裂;前駆体の質量範囲: 400 に 4,500 amu;静的な変更: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu;ペプチド質量許容差: 50 ppm;大容量タイプのフラグメント: モノアイソ。
      注: その他タンパク質データベース、検索エンジン、データ パイプラインを使用できます。例えばラット、マウスおよびヒトのデータベースよりも不完全であるためデータベースを使用して場合に、マウス (または人間) に対して検索を実行可能性があります、プロテオームのカバレッジを高めるためのデータベース。この場合、蛋白質名の冗長性を削除する必要があります。
   3. ポスト検索の分析を実行します。データを表示するフィルターを設定します。たとえば、95% あるいは 99%、すなわち、統計解析がサンプルに存在することの 95% あるいは 99% の確率を意味タンパク質だけが表示されますとして最小のタンパク質確率 (蛋白質のしきい値) を設定します。ペプチドのしきい値 (例えば95%) のフィルターを設定、すなわちスペクトルがペプチドを識別するかどうか決定する際に使用される最小の確率。タンパク質が存在するかを決定するペプチドの最小数を選択 (タンパク質の同定、最低限 2 ペプチドをお勧めします)。
   4. 質/量の識別された蛋白質を評価します。Proteotypic ペプチドが定量化のため使用されることを確認します。アイソ フォームが確認された場合は、特定のアイソ フォームにユニークなアミノ酸配列から成るトリプシン ペプチドの観測基地だを確認します。任意の「ような」または仮想的な蛋白質はどう比較を受けなければならない観測されたペプチドは知られている蛋白質に対応します。

結果

mRNA の解析
mRNA の結果は、各画分 (図 3 a); 特定の mRNA の分布として表現できます。定量化, polyribosomal 翻訳分数を結合および非翻訳分数 (図 3 b)、nontranslating の分数に変換する mRNA の豊かさの割合を提示に比較します。追加情報は、高効率ポリソーム分数低効率ポリソーム分数を個別に (または nontranslating 分数とは別) を調べることによって得られます。(どこ彼らは彼らのターゲット Mrna のタンパク質翻訳を妨げる) 低効率分数に富む Mirna を解析するとき、これは特に重要です。

代表は、翻訳と nontranslating の分画マウス心は虚と虚血/再灌流を行った後にその分布に比べて偽の変更は、

ディスカッション

ポリソーム プロフィール分析と、特定の mRNA の全体のトランスクリプトーム^6,7並進状態の分析によりタンパク質翻訳の研究。ローカル翻訳シナプトソーム⁸など検討する必要がある場合、それは大きな助けとだも。伝統的に、この方法は、モノとポリゾームとショ糖密度勾配をゲノムと結合することができるまたは目的の結果^6,9を取得するプロテオミクス技術に関連する Mrna の分離を含みます。例えば、私たちのグループによって実行される最近の調査は患者の虚血/再灌流障害を模倣した体外循環心で実行される転写後調節機構を明らかにしました。ポリソーム プロフィール分析のを活かして、我々 は CPB の手順²の後の心核符号化されたミトコンドリア蛋白質の翻訳で増加を示しています。

こ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
安楽死のための	ペントバルビタール	Vortech Phamaceuticals	9373
パリン	Sagent	103424	ランゲンドルフ準備
鉗子	ファインサイエンスツール	91110-10	、心臓を吊るすために使用される
ランゲンドルフシステム	Radnoti +自家製	n / a	カスタム吹きガラス、チューブ、ウォーターバスからなる「4つの心臓」システム
NaCl	Sigma	S7653-5KG	クレブス緩衝液およびスクロースグラジエント
KCl	Sigma	P5405	クレブス緩衝液および溶解緩衝液
KH2PO42	Sigma	P-5504	クレブス緩衝液
MgSO4	Sigma	M7774-500G	クレブス緩衝液
Glucose	Sigma	G5767	クレブスバッファ
CaCl2	Sigma	C1016-500G	クレブス緩衝液
ショ糖粉末	Σ	S0389-1KG	ショ糖勾配
MgCl2	Sigma	208337	ショ糖勾配および溶解緩衝液
トリス塩基	Σ	T1503-1KG	ショ糖勾配および溶解緩衝液
キシレン シアノール	Σ	X-4126	ショ糖勾配
シクロヘキシミド	Sigma-aldrich	239763	ショ糖勾配および溶解緩衝液
RNaseOUT	Life Technologies	C00019	溶解緩衝液用RNAse阻害剤
イゲパル CA-360 (NP40)	シグマ	I3021	溶解緩衝液
プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠、EDTAフリー	ロシュ	5056489001
チューブ、薄壁、超透明、13.2 mL、14 mm x 89 mm	ベックマン・コールター	344059
超遠心分離	ベックマン	LE-80K	グラジエントの超遠心分離
ローター	ベックマン	SW41	グラジエントの超遠心分離
バイオロジック LP (ポンプ)	バイオラッド	731-8300	グラジエントの分画
バイオフラク	バイオラッド	741-0002	グラジエントの分画
エッペンドルフ RNA/DNA LoBind 微量遠心チューブ、2 mLチューブ	シグマ	Z666513-100EA	グラジエント画分とRNA抽出
TRIzol 試薬	ライフサイエンステクノロジー	AM9738	RNA抽出
ルシフェラーゼ コントロール RNA	プロメガ	L4561	RNA抽出
クロロホルム	ッシャーサイエンティフィック	C606-4	RNA抽出
グリコーゲン、RNAグレード	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R0551	RNA抽出
イソプロパノール	シグマ	I9516	RNA抽出
エタノール	シグマ	E7023-1L	RNA抽出
iScript cDNA合成キット	BioRad	170-8891	逆転写
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	175-5122	定量PCR
miRNeasyマイクロキット (50)	Qiagen	217084	全RNA単離キット
miScript II RTキット (50)	Qiagen	218161	miRNA逆転写キット
miScript Sybr Green PCRキット (200)	Qiagen	の218073	キット miRNAのリアルタイムPCR発現分析用
Centrifuge 5424R	Eppendorf		1.5 mLまたは2.0 mLチューブを異なる温度で遠心分離します。最高速度 - 21130 x g
遠心分離機 5810R	エッペンドルフ		異なる温度でのリアルタイムPCRプレート遠心分離用。最大速度 - 2039 x g
My Cycler Thermal	Cycler Bio-Rad		逆転写用
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad		リアルタイムPCR解析用
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610	RNA単離の品質管理用
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear	バイオ・ラッド	HSP9641	リアルタイムPCR分析用
マイクロシール 'B' PCRプレート シーリングフィルム、接着剤、光学	バイオ・ラッド	MSB1001	リアルタイムPCRプレートシーリング用
研究用プラスシングルチャンネルピペット、グレー; 0.5-10 µL	Eppendorf	UX-24505-02	ピペッティング用
PIPETMAN Classic Pipets, P20	Gilson	F123600G	ペッティング用
PIPETMAN Classic Pipets, P200	Gilson	F144565	ピペッティング用
レイニン L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS ピペット 100-1000 & マイクロ;L	Gilson	17011782	ピペッティング用
	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R0551	総RNA単離効率を向上
Posi-Click 1.7 mL チューブ、ナチュラルカラー	Denville	C2170	RNA単離および保存; 試薬ミックス
サーマルサイクリングチューブ -0.2 mL 個別キャップ、標準0.2 mLチューブと光学的	Denville	C18098-4 (1000910)	逆転写反応
シャープ 10 精密バリアチップ	デンビル	P1096-FR	ピペッティング用
シャープ 20 精密バリアチップ	デンビル	P1121	ピペッティング用
シャープ 200 精密バリアチップ	デンビル	P1122	ピペッティング用
チップ LTS 1 mL フィルター	レイニン	RT-L1000F	ピペッティング用
miScript Primer Assay (200)	Qiagen	(miRNAにより変化します)	リアルタイムPCR解析用
グラジエントマスター ver 5.3 モデル 108	BioComp 機器		ショ糖グラジエントの調製用
トリクロロ酢酸	Sigma Aldrich	T6399
アセトン	Sigma Aldrich	650501
Tris hydrochloride	Amresco	M108
ジチオスレイトール	、フィッシャーサイエンティフィック	、BP172
ヨードアセトアミド	、Gbiosciences、	RC-150
、シーケンシンググレード、改変トリプシン、ブタ	、プロメガ	V5111、
炭酸アンモニウム	、BDH
ギ酸、オプティマLC/MS
	フィッシャーケミカル	A454
アセトニトリル、オプティマ LC/MS	フィッシャーケミカル	A996
タンパク質 LoBind チューブ 0.5 mL	エッペンドルフ AG	22431064
タンパク質 LoBind チューブ 1.5 mL	エッペンドルフ AG	22431081
HLB µ溶出プレート30 & micro;m	Oasis	186001828BA
SpeedVac濃縮器	Thermo Scientific	Savant SPD2010
sonicator	Qsonica	Oasis180
遠心分離機	Thermo Scientific	Sorvall Legend micro 21R
LC トラップカラム PepMap 100 C18	Thermo Scientific	160454
LC 分離カラム PepMap RSLC C18	Thermo Scientific	164536
質量分析計	Thermo Scientific	Orbitrap Elite イオントラップ質量分析計
MSConvert ソフトウェア	ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST ソフトウェア	Sage-N Research, Inc.