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方法論記事

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

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DOI:

10.3791/58083

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2018年8月24日

 , 
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

この記事について

サマリー

全血からの犬好中球を分離し、蛍光顕微鏡を用いたライブ好中球におけるネットの形成を視覚化する方法について述べる。ネット形成とシトルリン化ヒストン H3 を定量化するプロトコルについて述べる、蛍光顕微鏡を用いた (citH3) 式。

要約

病原体の侵入に対し、好中球は DNA のヒストンと抗菌タンパク質の細胞ネットワークである好中球細胞外トラップ (網) をリリースします。過剰なネット形成 (NETosis) 敗血症時に citH3 リリースは複数の臓器障害とマウスとヒトの死亡率に関連付けられて、その犬への影響が知られています。ここで、観察及び定量化 NETosis の全血から犬の好中球を分離する手法について述べる。デキストランの沈降によって生成された白血球リッチ プラズマが市販の密度勾配分離メディアで区切られ、顆粒球の収集細胞数および生存率試験。ライブの好中球におけるリアルタイムの NETosis を観察するには、側の透過物のセルとセルの非透過性蛍光核酸の汚れはリポ多糖 (LPS) またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) のいずれかを活性化好中球に追加されます。核の形態とネット形成の変化は、時間をかけて蛍光顕微鏡で観察します。体外NETosis co-3p324 細胞遊離 DNA (cfDNA)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 変更された二重 immunolabelling プロトコルを使用してが特徴です。ネット形成と蛍光顕微鏡を使用して citH3 式を客観的に定量化するネットし、citH3 陽性細胞が利用可能なソフトウェアを使用して盲検の方法で定量化します。この手法は、特定検定犬の好中球の体外容量 NETosis を受けることに。

概要

好中球が顆粒球短命の病原体の侵入に対する最初の防衛を担当です。伝染のサイトに募集、好中球は貪食、脱顆粒反応と活性酸素種 (ROS)1の生成による微生物を排除します。細菌やエンドトキシンの存在下で好中球リリース好中球細胞外トラップ (ネット)、細胞のクロマチンの構成は (MPO)2ヒストンとエラスターゼとペルオキシダーゼのような顆粒内蛋白で装飾されています。ネットでは、不可欠な抗菌特性を持っていますが、実験と臨床の証拠が増えている敗血症時にあまりに熱心なネット形成が複数臓器不全と死3,4、につながる可能性があります。5,6。

ネットは、犬同様の病態生理学的役割を再生可能性があります、ために、ネットの形成を減少または防ぐ治療上の介在は敗血症動物における新しい治療戦略として役立つかもしれない。このため、信頼性の高い手法を評価し、NETosis と犬の NET コンポーネントを数値化するために必要があります。NET コンポーネント (cfDNA) DNA ヌクレオソームなどは以前犬の好中球および臨床犬7,8,9からプラズマで評価されています。蛍光アッセイを使用して、ゴッグスと Letendre 発見健康犬8より cfDNA のハイレベルがある浄化槽犬。これらの技術は高度に客観的・定量的な NETosis のマーカーとして cfDNA とヌクレオソームの測定が非特異的 NETosing 好中球以外壊死細胞から得られるので。ここで好中球 NETosing ライブの挙動を調べる蛍光顕微鏡を利用した手法について述べる。また、ネットと MPO など犬の好中球10citH3 コンポーネントを主観的に定量化する二重反応を使用して修正されたプロトコルの詳細します。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアとカリフォルニア大学デービス校利用委員会によって承認された (プロトコル番号: 18338)。

1. 採血

  1. 21 G 針を用いた注射器吸引頭部または頸静脈いずれかから 10 mL の血液を描画します。
  2. 過剰な剪断応力を避けるためには、血液をヘパリン ナトリウム (75 USP) を含む尿管に転送する前に注射器から針を削除します。やさしく数回チューブを転倒させる抗凝固剤と血液の適切な混合を確実にします。氷の上にサンプルを置く前に血栓や赤血球凝集体の証拠を確認します。

2. 好中球の隔離

  1. 冷たい Dubecco のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (pH 7.4、二価のカチオン類なし) の等量と高血圧症血液を希釈します。(0.9% 塩化ナトリウム溶液中に溶けてロイコノ ストック属属) から 3% デキストランの 25 mL を含む 50 mL ポリプロピレン円錐管に希釈血液を 8 mL を転送します。集計と赤血球の沈降を許可する 30 分間室温で直立管を配置します。
  2. 5 mL 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブで密度勾配メディアの上にレイヤー白血球・血漿 (図 1) の 5 mL の慎重に。2 ソリューション11を混在させないよう注意します。
  3. 400 x g加速/減速を室温で 30 分間 0 (ブレーキなし) (A/D) セットでチューブを遠心します。
  4. 血清ピペット 5 mL を使用してプラズマと末梢血単核球 (PBMC) の層 (図 1) をバイパスすることにより顆粒細胞層を収集します。汚染を最小限にするたびに新しいピペットを使用します。
  5. 核 (PMN) 細胞層の 4 に 6 mL を 50 mL ポリプロピレン円錐管に配置します。赤血球集合体の少量は、多形核白血球層と共に吸気可能性があります、ので管の底で決済している赤血球凝集体を取り除きます 1 mL の血清ピペットを使用します。
  6. 冷たい純水 20 mL と残りの赤血球を溶解させます。複数回 30 〜 60 のチューブを軽く反転冷たい 1.8% 塩化ナトリウム溶液の等しい量を追加する前に適切な溶解を確認します。
  7. 4 ° C で 10 分間、0 A/D セット 112 x gで遠心分離機します。
  8. このペレットが赤表示されている場合は、赤血球溶解手順を繰り返します。血清ピペットを使い、慎重に上澄みを廃棄し、優しく DPBS (デキスト ロース 5 mM、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2および 1% ウシ血清アルブミン、pH 7.3) を 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。すべての再懸濁細胞を組み合わせるし、氷の場所します。
  9. 自動細胞分析装置を使用してセル数を数えるため、検定によって数を確認してください。必要に応じて、(1,000 rpm, 5 min) の収集を使用してスライド ガラスに Pmn を集中し、セルの合計数のうち好中球の数をカウントすることによって好中球の割合を決定します。
  10. Stroberらに従ってトリパン ブルー色素排除試験を実行することによって好中球の生存を確認します。12 100 %95 から、生存率をもたらすべきである分離を成功させると、好中球が 95% 以上にする必要があります。
  11. % 生存率と好中球 % 総セル数を掛けることによって好中球の濃度を決定します。分離を成功させるは、6 x 106/mL に 1.5 から好中球濃度を得られるはず。
  12. Ph 7.3 に調整 5 mM デキスト ロース、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2、および 1% ウシ血清アルブミンを含む DPBS で 1 x 106/mL の最終的な集中に好中球を希釈します。

3. ライブ好中球蛍光顕微鏡

  1. 多 L リジンの各ウェルに好中球 (1 x 106/mL) 400 μ L に場所 200 コーティング 12 ウェル培養プレートです。アドロイに 30 分の 37 ° C で井戸の底に付着する好中球を許可します。
  2. 1 μ m の 2 つの核酸の染料の一つ、汚れをそのまま膜細胞の 1 つ、1 つは細胞透過性膜 (材料の表を参照してください)、室温で 10 分間で汚れ、核酸のラベルを付けます。
  3. 100 μ g/mL リポ多糖 (LPS) (大腸菌O55 と好中球をアクティブにします。B5)、100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 肯定的な制御または 37 ° C で 180 分のネガティブ コントロールとして DPBS の相当量として
  4. GFP を使用して画像を取得 (励起: 470/22 nm、発光: 525/50 nm) とテキサス赤チャンネル (励起: 585/29 nm、発光: 628/32 nm) 次の時点で 40 倍の倍率で蛍光顕微鏡: 30、90、120、180 分。

4 純数量および蛍光抗体法を用いた純成分の検出

  1. 12 ウェル培養プレートのウェルに 18 mm 直径ポリ-D-リジン コーティング カバー スリップを慎重に配置します。井戸に適切にラベルを付けます。
  2. 種子の 100 に 200 μ L は、カバーガラスの上に直接好中球 (1 × 106/mL) を分離し、37 ° C、30 分で細胞を培養によってカバー スリップを遵守する好中球を許可します。
  3. 3.3 で説明したように、好中球をアクティブにします。200 µΜ と好中球を前処理によるネットの形成を阻害する Cl-アミジン (15 分、37 ° C) 李らによって前述の活性化の前に13実験で適切な車両制御 (DMSO) が含まれていることを確認してください。
  4. 微細鉗子でカバー スリップを慎重に取り外します。浅い井戸を作成し 4% の 2 〜 3 滴を配置するテスト チューブ スタンドにパラフィン フィルム シートを層ごとよく10の PFA。井戸に適切にラベルを付けるし、優しく PFA で満たされた井戸の上に逆さまカバー スリップを横たわっていた。20 分間室温で固定します。
  5. 次に 1 つの井戸から移動して 3 回 5 分 DPBS のセルを洗浄します。
  6. 直後に、好中球の活性化と固定 immunolabelling を実行できない場合は、カバー スリップの顔アップ吸収紙の上に配置することによって乾燥空気になるカバー スリップを許可します。さらに詳しい分析まで最大 1 週間 4 ° C でラベルの 12 ウェル培養プレートの表側のカバー スリップを格納できます。3 回の次のステップに進む前に 4.4 で説明されているように同じ技術を使用して 1 分の DPBS セルを洗浄します。
  7. セルを permeabilize 優しくカバー スリップ逆さまに置く 4.4 で説明されている手法を使用して 1 分の NP 40 1% のドロップ。ロッカー上で 1 分間 DPBS で 3 回を洗います。
  8. ランダムに各サンプルの数を割り当てる、ダイヤモンド ポイント マーカーを使用して、それに応じて、coverslips にラベルを付けます。
  9. 準備とラベル個々 ペトリ皿パラフィン フィルムと並び、(バッファー ブロッキング) フィルムに 5% ヤギ血清の 100 に 200 μ L を配置します。ブロック バッファーに、coverslips を逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート
  10. ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。
  11. 一次抗体の希釈 (1: 400 ウサギ ポリクローナル抗シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 5% ヤギ血清中)。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート
  12. ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。
  13. 二次抗体の希釈は 5% ヤギ血清に蛍光体 (レバレッジ) に共役。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
  14. 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
  15. ミエロペルオキシダーゼ (MPO) の同時検出 Li et al.によって説明するよう変更された二重反応プロトコルの次の手順に従います13
  16. パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。各カバー スリップ逆さまに置く 10% ウサギの 100 に 200 μ L 穏やかな揺動 (一晩、4 ° C、暗闇の中で) の下で血清。
  17. 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
  18. 50 μ g/mL 非ヤギ抗うさぎ Fab フラグメント暗闇の中のロッカーに室温で 2 時間のセルを孵化させなさい。
  19. 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
  20. 一次抗体 (1: 200 ウサギ ポリクローナル抗 MPO 抗体) 5% ヤギ血清を希釈します。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
  21. 5% ヤギ血清に蛍光標識二次抗体を希釈し、前述の 4.8 を孵化させなさい
  22. 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
  23. 干渉コントロールを作成するには、免疫ラベルの 2 番目の手順でいずれかの一次抗体の孵化を除きます。
  24. 300 で DNA を染色 nM の 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole、塩酸 (DAPI) 室温で暗闇の中で 5 分間。
  25. 暗闇の中のロッカーに 1 分の DPBS で 3 回を洗います。
  26. スライド ガラスに antifade フィルターとフィルターのドロップ (~ 50 μ l) を適用します。そっと逆さま coverslip 細胞とをマウントする前に余分なバッファーを削除する吸収紙の上のカバーガラスの端をタップします。メディアをマウントする必要があります、coverslip とスライド ガラスの薄い層を形成します。空気の泡を削除するには、非常を軽く押して、coverslip 微細鉗子で。
  27. 4 ° C で暗闇の中で一晩治すためサンプルを許可します。浸漬レンズと顕微鏡分析のためメディアをマウントを強化してください。暗闇の中で 4 ° C にサンプルを格納します。

5. 好中球細胞外トラップ定量化

  1. 盲目のオペレーターの集録および実験条件に顕微鏡画像を解析します。
  2. それぞれのチャンネルの下の実験で各 coverslip の異なった地域からランダムに 10 の画像を取る蛍光顕微鏡を使用すると、40 倍の倍率で。露出時間、明るさおよび各チャンネルのコントラスト画像の取得で一貫して保持されますを確認します。
  3. 利用可能なソフトウェア ImageJ (NIH) などを使用して画像を分析します。CfDNA、citH3、MPO (図 3 a, B) の共局在に基づくネットを識別します。ネットと各実験条件の 10 のランダムなフィールドにおける好中球の数を定量化します。リリース ネットの数字は比率として表現できます (ネット数: 好中球の合計数) 各実験条件のため。
  4. 細胞内 citH3 式の治療効果を評価するには、細胞内 citH3 と好中球の数とそれぞれのチャンネルで (の下で 40 倍の倍率で 10 のランダムな分野で細胞内 citH3 なしの好中球の数を数える図 3、赤い矢印)。細胞内 citH3 式は、細胞 citH3 細胞内 citH3 なしの好中球の数と好中球数の比として表現できます。

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結果

生きているセルイメージ投射のこのプロトコルを使用すると、調査官は核形態、プラズマ膜の完全性と生活の好中球における cfDNA の存在を観察できます。セルの非透過性核色素の汚れ破損した細胞膜と細胞内核酸を赤。別セル側の透過物の色素は、そのまま細胞膜と細胞の細胞内の核酸をラベル付けします。その治療に関係なく、すべてのままの好中球が緑表示し、刺激 (図 2 a) 後 0 に 30 分で特徴的な葉状核を展示します。PMA 処理好中球の核は、約 60 分葉状の外見を失い、cfDNA (図 2 b) のリリースまで脱凝縮したり続けますし始めます。LP、犬好中球のより遅くより生理学的覚醒剤通常されませんクロマチン decondensation または NETosis で 90 分まで電気刺激を与える (図 2 b)。120 分まで、LPS と PMA 活性化好中球は cfDNA に囲まれて見ることができます。...

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ディスカッション

セル側の透過物色素と細胞の非透過性染料を使用して生活の犬好中球の核形態と cfDNA リリースで変化を観察するためのプロトコルをご紹介します。このアッセイの主な利点は、できるネット形成のリアルタイム計測セル固定せずライブ好中球における高分解能顕微鏡によってしたがって、体外ネット形成を観察するためのシンプルで貴重なツールを提供します。以来、このアッセイは、NET コンポーネントの検出のための抗体を必要としない、種特異的な抗体の限られた供給に種の NETosis の勉強に最適です。この試金を使用して、著者を示した犬の好中球が組合又は PMA クロマチン decondensation を受ける前に NETosis13刺激。この手法の主な欠点は、それが NETosis のために特定ではないです。セルの非透過性色素は、壊死細胞の核酸または核酸分離好中球からリリースも汚れ、ために、cfDNA またはセルの非透過性陽性細胞はネットまたは NETosing の好中球として誤って解釈でした。また、その PAD4-阻害剤の Cl アミジンと前処理、PMA または LPS 活性化の好中球を含む...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

対応する著者モリス動物財団 (D15CA-907) によって資金を供給されました。研究は、カリフォルニア大学、デービス、馬の健康センター、コンパニオン動物保健センターからの資金によって支えられました (2016-24-F)。著者は、数字とギー グエンについて彼女のビデオで彼女の援助ジーナ Ng を認めたいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デキストラン Leuconostoc spp.シグマ31392分子量 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUSGE Life Sciences17144002
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水ThermoFisher ScientificA1285801With divalent cateions
Dulbecco'S Phosphate-Buffered SalineThermoFisher Scientific14190136Without divalent cations
E. coli O55:B5InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS113685 mM in DMSO ; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7578DMSO 中 1 mM; 無傷の膜を持つ細胞の染色
Surface-Amps NP-40Pierce28324
Poly-D-Lysine コーティングされたカバースリップneuVitroH-12-pdl直径 12 mm
抗シトルリン化ヒストン H3 抗体AbcamAb5103
非標識ヤギ 抗ウサギ Fab フラグメントJackson ImmunoResearch111-007-003特異性:IgG (H+L)
抗ミエロペルオキシダーゼ抗体DakoA0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)ライフテクノロジーズ株式会社D1306

参考文献

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