方法論記事

ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析

DOI：

10.3791/58088

⸱

2018年8月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

走査型電子顕微鏡および NMR による脂質結合ネクロトーシス従来および共焦点の生細胞顕微鏡イメージングなどの MLKL を介した膜破断の法を述べる。

要約

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ネクロトーシスはし、混合系統キナーゼのようなドメインの pseudokinase、MLKL の破裂や permeabilize 血しょう膜を活性化するタンパク質キナーゼ 3 (RIPK3) を相互作用する受容体の活性化によって引き起こされるプログラムされた細胞死経路.ネクロトーシスは自己免疫、感染症や心血管系疾患や脳卒中、神経変性、がんを含む複数の疾患に関連付けられている炎症経路です。ここでは、ネクロトーシス膜破裂の死刑執行人として MLKL を特徴付けるために使用できるプロトコルについて述べる。我々 はネクロトーシス従来および共焦点蛍光顕微鏡を用いた生細胞イメージングを用いた細胞およびプラズマへの細胞質から MLKL の再分配を一緒に明らかに電子顕微鏡を用いた固定細胞プロセスを視覚化します。血しょう膜の大きな穴の誘導の前に膜。MLKL を介したネクロトーシスの推定される変調器を識別するために脂質を用いた核磁気共鳴 (NMR) 分析体外を提案します。本法に基づき、特定定量的脂質結合の好みホスファチジルコリン イノシトールリン酸 (PIPs) 膜ターゲットとネクロトーシスに透過に必要な MLKL の重要なバインダーとしてします。

概要

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ネクロトーシスの遺伝的要素を識別する生理・疾患1,2,3,4,の5ネクロトーシスの含意をテストするための動物モデルの使用を促進しています。RIPK3 または MLKL のノックアウト マウスは、そのネクロトーシスは人生3,6の必須ではないことを示唆開発および大人の恒常性で最小限の含意を持っていた。さらに、特定の種は動物7,8ネクロトーシスの非本質的な役割をサポート、RIPK3 または MLKL のいずれかの遺伝子を含まない。その一方で、研究室に誘導される様々 な病態とノックアウト動物モデルに挑戦、炎症、免疫、ウイルス感染9,10,ネクロトーシスの重要な役割が明らかに11,12。

ネクロトーシスは異なる免疫センサー信号によっていくつかの方法で実行されるすべての RIPK31,13,14の活性化に繋がる。アクティブな RIPK3 化順番 MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 をアクティブにし、、11,12,13,14,15,16,17,18。ほとんどが勉強した、おそらく最も複雑な方法は、RIPK3 の活性化につながる死受容体血管を結紮を分割するか apoptosis かネクロトーシス1を誘導するシグナル伝達複合体の下流の組成に基づくです。ネクロトーシスはすさまじいが好まれている RIPK1 を介したシグナル伝達機構と RIPK319,20の関与の結果です。この結果は、カスパーゼ 8、ベイでネクロトーシスを保持ネクロトーシスの推定される内因性阻害剤の薬理学的抑制遺伝的削除に簡単に優先されます。RIPK1 に結合し、RIPK3 がアクティブになります。ネクロトーシスをアクティブにする別の方法は、従事し、TIR ドメインを含むアダプター誘導インターフェロン-β (TRIF)21を介して RIPK3 をアクティブにする Toll 様受容体 TLR3/TLR4 シグナル伝達を介してです。まだネクロトーシスで死ぬことの別の方法は、直接従事し、RIPK322をアクティブに DNA センサー台の活性化です。

MLKL N 末端ヘリックス バンドル (NB) ドメインと規制ブレース地域3によってリンクされている C 末端 pseudokinase ドメイン (psKD) から成る細胞内蛋白質であります。正常細胞の MLKL はどこ RIPK314と非アクティブな複合体であると考えられる細胞質にあります。ネクロトーシスの活性化は、psKD、および NB とブレースの3,15,23で可能性のある追加のサイトの活発化のループの MLKL の RIPK3 のリン酸化をトリガーします。リン酸化は、RIPK314から解離による MLKL の構造変化を誘導します。不十分な理解の構造変化は、psKD24からブレースを解放します。2 本のヘリックスが含まれ、ブレースは、C ターミナル螺旋形25推定三量体に MLKL の重合を仲介します。ブレースの N 末端ヘリックスは、膜透過24,26のために不可欠である NB ドメインを阻害します。分離、NB ドメインは細胞膜透過とネクロトーシス16,24,27を誘導するために十分です。NB の pro necroptotic 活性は、マウス胚性線維芽細胞 (mlkl-/- MEFs) MLKL 欠損で再構成されました。NB は優先的に従事するリン脂質ホスファチジルイノシトール 4, 5 二リン酸 (PIP2) 脂質結合ドメインです。ブレース重合が PIP2極性基24NB の弱い相互作用を介して細胞膜と MLKL の採用を促進する前記 MLKL の活性化の段階的な機構を提案する.膜では、NB は、PIP2のため非アクティブな MLKL 内のブレースによってマスクされます追加の高親和性結合サイトの規制の露出を経る。全体的にみて、PIP2と NB の複数の相互作用は、これらのイベントの分子メカニズムが解明されていないが膜の破断につながる不安定します。

ここで我々 はネクロトーシス24の死刑執行人として MLKL の機能を特徴付けるために使用する特定のメソッドを示しています。特に、我々 は MLKL, NB, ブレース (NBB) ブレース阻害によって規制されており膜破裂とネクロトーシスを誘発する強制二量体化してアクティブになることができますの最も最小限のドメインに焦点を当てます。強制薬物誘発性 FKBP を介した二量体化住セルイメージ投射とネクロトーシスになる細胞の電子顕微鏡観察のために結合した発現システムについて述べる。さらに、NBB フォスファチジルイノシトール (PIPs) との相互作用の in vitro NMR 分析を示す.

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プロトコル

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1. クローン作成および細胞ラインの生成

  1. PCR 増幅 NBB 領域のアミノ酸残基 1-140 (NBB140) は、人間 MLKL cDNA からのフレーム標準的な制限の酵素に基づくクローニング重合ドメイン 2 x FK506 結合蛋白質 (2xFKBP または 2xFV) と金星蛍光に対応します。タンパク質にドキシサイクリン (Dox) - 誘導型レトロウイルスベクター NBB140を取得する pRetroX-TRE3G - 2xFV-金星 (表 1、図 1 a B)。
  2. 主mlkl-/-またはripk3-/- mlkl-/-マウス胚性線維芽細胞 (MEFs) 抗原 SV40 大きいトランスフェクションによって緑の実験室で利用できるそれぞれのマウスから得られた不滅のものプラスミドを表現します。不死化細胞の [〜 1-2 週間、DMEM 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 ミリメートル L グルタミン、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウムと 37 ° C、5% CO2標準的な組織で非必須アミノ酸と、維持する、文化のインキュベーター。
  3. SV40 不死化mlkl-/- MEFs 逆テトラサイクリン制御トランス (情報を頼むこと) を変換-レトロ ウイルス ブラストサイジン抵抗性遺伝子 (私たちの変更されたプラスミド) を含んでいるプラスミッドから表現を含むおよび 1 のための御馳走情報を頼むこと28を安定に発現する細胞を選択する 5 μ g/mL ブラストサイジンで週間。
  4. キメラの MLKL を含む Dox 誘導 retroviral ベクトルの情報を頼むこと表現する MEFs を変換 (pRetroX NBB140-2xFV-金星-プーロ) 導入後 1 週 2 日の 4 μ g/mL ピューロマイシンを選択し、。

2 MLKL を介したネクロトーシスの生きている細胞の顕微鏡観察

  1. Mlkl-/- NBB140を表現する MEFs プレート-2xFV-(まあ 1 mL/) 24 あたり 50,000 セルの密度で金星もプレートと一晩インキュベート (図 2A)。生細胞染色自動細胞計数 (材料の表を参照) を使用します。
  2. Dox で 12 時間のセルを扱う (0.5 μ g/mL) NBB140の発現を誘導するために-2xFV-金星。
  3. 25 nM 膜不浸透性緑色蛍光に加えてネクロトーシスと 25 nM FKBP dimerizer (Dim) を誘発する標準 DMEM で (材料の表を参照) を染める (1.2 を参照してください)。NBB140によって彼らの膜の整合性が損なわれると、ネクロトーシスになる細胞蓄積染料-破断を介する。3 通または 4 連でアッセイを実行します。
  4. ネクロトーシス シングルまたはデュアル カラー イメージング システム (材料の表を参照) を使用して、監視するには、哺乳類の組織培養のインキュベーターでありそれぞれのイメージング ユニットに船を配置します。
  5. ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください) し今後スキャンをスケジュール [タスク リスト] タブを選択します。
    メモ:このプロトコルは、単一のカラー システムを用いたイメージングが、同様のソフトウェアがデュアル カラー システムで利用できます。
  6. [プロパティ] タブで「物理的なレイアウト」タブで「高速蛍光」「トレー、容器、スキャンの種類」、および「スキャン パターン」を選択します。
  7. 「スキャン時間」をクリックしてして「タイムライン」ウィンドウおよび [合計数時間ポイントと獲得 (通常 1 取得毎 0.5 h 6 h、12 h にまたは高速動力学ネクロトーシス 5 分毎の 1 h) 周波数のを追加し、"アプリを選択することにより画像の取得を開始ly"(赤いボタン)。
  8. ネクロトーシス イメージ解析ソフトウェアを用いた定量化 (材料の表を参照してください)「オブジェクト カウント新しい解析固定セグメンテーション背景レベルしきい値と」,「作業ウィンドウ」から選択することでホバリングを決定できる、バック グラウンド地域分析で使用されるいくつかのイメージの上にマウス カーソル。
  9. 現在のイメージを使用してプレビューを選択することにより蛍光物体を確認し、必要に応じて、しきい値レベルを修正します。
  10. 「起動新しい分析」タブを開いて、蛍光グリーン カウントを統合、「時間の範囲」を選択、井戸分析する"分析ジョブ名"を入力し、押して"OK"を選択します。
  11. アクセスはそれぞれジョブ名をダブルクリックすると、外部のグラフ作成ソフトウェアで詳細な分析グラフ/エクスポート] ウィンドウからエクスポート「分析ジョブ」タブからのデータを分析 (材料の表を参照してください).
  12. 緑蛍光陽性 (+ ve) としてデータ数/mm2を量的または合流によってカウントを正常化し、蛍光グリーン + ve のカウント ・合流としてデータを表現します。
  13. 必要に応じて、エンドポイントでは、実験的、100 細胞を染色 nM 膜側の透過物の緑色蛍光の染料 (材料の表を参照してください)。エンドポイントでグリーン蛍光/グリーン蛍光比として %necroptotic のセルにデータを正規化します。

3. 生きているセルの共焦点顕微鏡イメージング膜採用の MLKL によって透過

  1. Mlkl-/- NBB140を表現する MEFs プレート-2xFV-ガラス (0.5 mL/ウェル) ウェルあたり 20,000 セルの密度で金星 4 よく顕微鏡室 30 分の 37 ° C で PBS で 50 μ g/mL のフィブロネクチンで前処理を下にし 〜 12 h (インキュベート図 2B)。
  2. Dox とセルを扱う (0.5 μ g/mL) NBB140の発現を誘導する 〜 12 時間-2xFV-金星。
  3. 25 を含む新鮮な培地 (1 mL/ウェル) と孵化によってネクロトーシスを誘発する nM NBB140を誘導するために薄暗い-2xFV-金星の活性化と細胞膜への転流。
  4. ディスクの回転レーザー環境制御と、63 装備倒立スタンド上に構築された共焦点顕微鏡でチャンバーを配置 1.4 NA 目的と好みのソフトウェアを使用して取得をイメージングを開始 (材料の表を参照してください)。
  5. ソフトウェアを初期化、YFP フィルター構成 (励起波長 515 nm) の「フォーカス」アイコンを選択します。
  6. 視野と焦点面を見つけるし、「明確なフォーカス」タブを用いた集中メンテナンスに従事します。
  7. 取得を開始するには、フィルターの構成、適切な EMCCD カメラの露出時間と発達のゲイン、および間隔や取得の長さを含めてタイムラプス集録パラメーターの代入に続く「キャプチャ」タブを選択します。
  8. 蛍光 NBB140の細胞の再分配を監視-2xFV-金星蛋白質を修めればネクロトーシス画像すべて 10 515 nm レーザー (映画 1) を用いた EMCCD カメラで s。
    注: 退色は蛍光タンパク質のイメージングと懸念です。金星はフォトブリーチング29より耐性の蛍光タンパク質のひとつです。退色しやすい蛍光タンパク質を使用する場合の画像すべて 30 秒以上イメージングの時間ポイントの間の信号の回復を許可します。
  9. 膜協会 NBB140を監視する-2xFV-ネクロトーシス、中に金星画像すべて 10 のサンプル作製 3.3 の全内部反射蛍光 (TIRF) を自動の全反射スライダーを搭載した顕微鏡を用いた顕微鏡と100 x 1.4 NA 目的、EMCCD カメラ (ムービー 2)。3.5 – 3.7 の手順に従いますが、顕微鏡室のサンプルと下部のガラスの厚さによると全反射フォーカス タブ内で全反射角度を調整します。
    注: LCK C RFP のような膜マーカーは、全反射解析における細胞膜局在のコントロールとして使用する場合があります。
  10. ガウス関数 (マー アルゴリズム) の負正規化された二次導関数との畳み込みによって品質を向上する画像処理を実行します。

4. 電子顕微鏡観察

  1. Mlkl-/- NBB140を表現する MEFs プレート-2xFV-プラズマ コーティングの 150 mm で 500 万セルの密度でヴィーナス培養皿の細胞し、インキュベートする 12 h (図 3)。
  2. ドキシサイクリンで細胞を治療 (0.5 μ g/mL) NB1 140の発現を誘導するために-2xFV-12 h 金星。
  3. NBB140を誘発する-2xFV-金星の活性化と 25 と細胞膜への転流 5 分 homodimerizer の nM。今回は、ネクロトーシス住セルイメージ投射で観測された速度から確立されます。
  4. メディアを取り出し、10 mL の 2.5% グルタールアルデヒド、2% パラホルムアルデヒド 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファー ph 7.4 (cacodylate バッファー) 37 ° C に加温を使用してセルを修正
  5. キサゲ加工によりサンプルを収集し、500 x gで 10 分間のサンプルをスピンします。上清を捨てます。
  6. 1.5% フェロシアン化カリウム 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファーと四酸化オスミウム還元 2% で 1.5 h のサンプルを後置します。四酸化オスミウムは、コントラストを提供するために広く TEM で染め色剤です。SEM のネクロトーシスを受ける細胞の前に予備的な分析として TEM を使用しました。
  7. 500 x のg、後にバッファーに洗口液で 5 分間超純水で 5 回サンプルをリンス (4.6 を参照)、水およびエタノール自動プロセッサによる。上清を捨てます。
  8. SEM のための 1% ウラニル酢酸と鉛アスパラギン酸 - 重金属染色31以前固定試料を染色します。
  9. アルコールとプロピレンの酸化物ソリューションの傾斜シリーズを通してサンプルを脱水します。
  10. 硬質レジン32レジン ブロックを取得するサンプルを埋め込みます。
  11. 分析の正しい領域を決定する 0.5 μ m の厚さのセクションをカットします。
  12. サンプルは導電性金属 (イリジウム) の超薄膜をコートします。
  13. イメージし、サンプル (図 3) を分析します。5 で定量化, 露出した細胞と樹脂ブロック表面の低倍率の画像がスキャンされた keV の電子顕微鏡を用いたします。
  14. SEM で撮影した各画像間で細胞を可視化するまたは 1 つの連続したイメージ30に複数フィールドのビューに参加する利用できるイメージング ソフトウェア。100 セル可能性があります使用して、好みのソフトウェアで高解像度のモンタージュを生成することによってこの方法でネクロトーシスになる細胞の割合を評価する約 (材料の表を参照してください)。
    注: SEM による壊死の形態を得点事前壊死、または壊死の表現型の進行と正常な細胞機能を比較します。これらの機能は、微絨毛の消失、平坦化、10 に至る細胞破裂膜変化 nm サイズやオルガネラ構造のゾル性細胞質のセル領域の少なくとも 30-40% の損失で 1 μ m から。

5. 脂質結合核磁気共鳴 (NMR) 分光法による MLKL

  1. 15N 標識 NBB1 156標準タンパク質の発現及び精製前述24を準備します。
  2. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol アンモニウム塩 (PI 18:0) と 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) アンモニウム塩 (18:1 PI) 冷たい CHCl3各 1 Mg/ml の最終濃度 500 μ L の 500 μ g を溶解します。
  3. 1 mg/mL 18:0, 18:1 PI 室温で 1 分間超音波処理水お風呂で超音波を照射または氷-水混合物の 5 分まで。
  4. 分注 1 mg/mL 18:0, 18:1 PI 個々 の NMR 滴系列 (図 4) のきれいなガラス瓶に。ガラスの空気タイトな注射器を使用して有機溶媒中で転送脂質。
    1. 1 mg/mL 18:1 PI の 132 μ L 分注 (モル質量 880.137 g/mol =) CHCl3の最終的な再懸濁量 125 μ M の濃度で 1,200 μ L。
      注: 5 mm NMR 管用のシリアル希薄をボリュームの準備 > 1,000 μ L と最終的な NMR サンプルのボリューム > 500 μ L。3 mm NMR 管用のシリアル希薄をボリュームの準備 > 300 μ L と最終的な NMR サンプルのボリューム > 150 μ L。
  5. 分注 1 mg/mL ブタ脳の 20 の L-α-ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸アンモニウム塩: 9:1 CHCl3/メタノール/H2O (脳 PI (4, 5) P2) きれいなガラス瓶に。
  6. アルゴン (Ar) や窒素 (N2) ガラス瓶壁に飛散することがなく有機溶媒を蒸発させるための適度な流れのガス流れの下でバイアルを配置します。5 ~ 30 分は通常 10-200 μ L 有機溶媒量十分です。
  7. ガラス下部に大型のピンセットを使用して真空フラスコを Büchner のバイアル ゴム栓で密封し、真空ラインに接続されているプラスチック製のチューブを接続を配置します。残留有機物を削除する一晩穏やかな真空下でフラスコを避難させます。
  8. 不活性ガスと脂質膜の因数をオーバーレイ、密閉ふた付きシールし、長期的な貯蔵のための使用 1 ヶ月以内または-80 ° C の-20 ° C で保存します。
  9. 洗剤なし NMR サンプル バッファーを準備 (-Det) を含む 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O と洗剤 (+ Det) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, を含む 10% D2O、0.34 mM n-ドデシル-β-D-maltopyranoside (DDM)。
  10. 望ましい集中を実現し、10 分間超音波処理を交互に 30 分間水浴の超音波脂質膜とガラスの瓶に Det バッファーに続いて検査 + 追加。
    注: 超音波処理のサンプルを暖かいことがあります。最終的なタンパク質サンプル調製前に 15 分間室温に冷却することができます。
  11. 脂質界面活性剤ミセルの + 1:1 混合物の超音波を使用して望ましい集中シリーズ Det バッファーのシリアル希薄を実行します。125 μ M の脂質の濃度を最低 15.6 μ M 脂質 0.34 mM DDM は、31.3 μ M、62.5 μ M が得られます 3 つの繰り返し。
  12. コントロールを準備し、タンパク質と - Det で添加物の NMR サンプルを参照し、+ Det バッファー、それぞれ。タンパク質と脂質の各希釈添加物 + Det バッファーを追加します。
    注: 15N NBB156, タンパク質は 40 μ M の最終的な集中に追加され、システイン残基の減少を維持する重水素 2 mM ジチオトレイトールで補われます。
  13. (5.4 の手順でメモを参照してください) 5 mm または 3 mm の NMR チューブにサンプルの適切なボリュームを転送します。
  14. 手動で NMR 装置でサンプルをロードまたは SampleCase ローダーなどの自動化プラットフォームの手配します。
  15. 2 D 1H-15N 相関スペクトル最適化横緩和スペクトロス コピー (作成) のいずれかとして続いて品質管理として1H プロトン スペクトルの標準パルス プログラムを使用して複合の NMR スペクトルを取得または25pxn-1 異核複数量子コヒーレンス (SOFAST HMQC)33。
    注: 3 mm NMR チューブの使い方 1 h-15N 作成 (~ 3 h) または1H-15N SOFAST HMQC (〜 90 分) の 64 件のスキャンが必要です。スキャン 5 mm NMR チューブで番号は半減します。
  16. 処理された 2D NMR スペクトル解析またはその他のソフトウェアのユーザーに選択の CARA リポジトリ34に追加できます。
  17. 注釈を付けると各蛋白質の状態の 3 つの分散であると解決ピークの 2次元 NMR 共鳴ソフトウェアを分析します。各 NBB156 (図 5A) を含むバッファー条件ごとに六つのピークのピーク振幅を記録します。
    1. キャラを使用してバッチ統合リストを準備します (クリックしてメイン メニューの見出し"スペクトル |セットアップ バッチ リスト". の)すべてのスペクトルの収集、単一のピークのアサインファイルを使用して解析 (をクリックしてメイン メニューの見出し"ピーク |実測をインポート". そして 6 総ピーク、内で定義された、各蛋白質の状態 3 を持つユーザー定義の .peaks ファイルを選択)。
    2. 設定を調整 ("インテグレーター |ピーク モデル」の「チューニング...)X 幅 0.06 ppm と Y 幅 0.30 ppm (をクリックしてメイン メニューの見出し「インテグレーター |ピーク モデル」の「チューニング...)2 つのメニュー選択 (1 最終的な出力を記録する前に。メイン メニューの見出しをクリックして「インテグレーター |"バッチ リストを統合) (2。メイン メニューの見出しをクリックして"ピーク |統合テーブルをエクスポート)」(図 5B)。
      注: 残留 M21、V53 と L105 バックボーン アミド共鳴は NBB156閉じブレース状態に割り当てられています。開くブレース状態は、残基 G130 と A141 のバックボーン アミド共鳴とイプシロン プロトン側鎖の共鳴 W133 3D NMR 実験24使用に割り当てられました。
  18. 標準試料の 3 つ開くブレースの振幅の平均、2 つの参照を関連の正規化係数を計算によって異なる磁石またはサンプル条件から直接の比較のためのサンプルを正規化します。NBB156共鳴ゼロ (表 2) に正規化係数と設定負振幅を使用してのスケールの振幅を計算します。
    例: 1) 異なる磁石からのサンプルを比較: マグネット A、NBB156+ DDM とマグネット B、NBB156DDM。2) 洗剤の比較: 0.34 mM DDM と 1.7 mM DDM。
  19. 縮小率の閉鎖またはオープン-ブレースすべてスペクトルの最小-最大振幅の範囲で割って収集無料 NBB156と完全に開くブレース NBB156で適切な参照を含む各共鳴の計算します。洗剤です。
  20. 脂質濃度の関数としてプロットの正規化された NMR 振幅と異なる条件で (図. 5 C) 開くブレース NBB156の割合を比較します。
    注: また、脂質濃度に対して閉じブレース構造の割合の分析が行えます NBB156に脂質結合を比較します。我々 は、それはより速いために分数よりよいレポート完全に従事し脂質による元の分析を好みます。

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結果

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最小限切り捨てられた MLKL 構築、NBB140の発現誘導を介して可能にされている生きているセルの規制ネクロトーシス実行を可視化する-2xFV-金星。このコンス トラクターは、膜透過を誘導する能力を維持し、FKBP カセット (2xFV) Dim 誘起重合を介して活性化します。我々 を観察して生細胞顕微鏡イメージング、監視速度論的 (5 分ごと) 細胞不浸透性の緑色蛍光 DNA 結合色素 (図 6A) の取り込みによるネクロトーシスを定量化します。この誘導システムは非常に堅牢とmlkl-/- MEFs の完全なネクロトーシスは NBB140をエクスプレス Dox 虫の細胞の点心を介した重合時 ~ 1 h 内観察できる-2xFV-金星 (図 1A).我々 はこれらの条件を高速動力学ネクロトーシスと呼びま...

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ディスカッション

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膜破断24の推定死刑執行人として MLKL に関与する、我々 を組み合わせた技術のためのプロトコルを提供します。MLKL を介したネクロトーシスを調節する制御ネットワークを解読する、に加えてこれらのテクニックがない独立して使用できる他適切な生物学的システムを特徴付けるため。実質的に言えば、これらのテクニックは、中-低スループット探索ツールです。

我々 は日常的に NBB140の住セルイメージ投射を使用している-2xFV-金星-ネクロトーシスとネクロトーシス変異と小分子化学を使用して MLKL の規制を機械論的に解剖する他の MLKL 構造による仲介プローブ。特に、我々 や他のグループを示している人間、NBB の最小限の領域を含む MLKL のマウス構成ことができますひとネクロトーシスとマウス細胞株を仲介します。1 つは MLKL を介したネクロトーシスを支配する注意点は TNF、smac 模倣およびカスパーゼ阻害の組み合わせによって上流の刺激時に観察される種間の交差反応を防ぐこ...

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transactivator plasmidLlambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidin S HydrochlorideサーモフィッシャーサイエンティフィックBP2647100 CAS#3513-03-9
細胞死定量化および生細胞顕微鏡
ドキシサイクリンClontech631311 CAS# 24390-14-5
B/B ホモ二量化器 AP20187宝635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16サーモフィッシャーサイエンティフィックS7578
NMR
15 N 塩化アンモニウムケンブリッジ同位体研究所NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
重水素化DTT ケンブリッジ同位体研究所DLM-2622-1
酸化重水素Sigma Aldrich617385-1 CAS#7789-20-0
n-ドデシル-&β;-D-マルトピラノシドアナトレースD310 CAS#69227-93-6
L-&α;-ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート(脳、ブタ)(アンモニウム塩)Avanti Polar Lipids840046X CAS#383907-42-4
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール(アンモニウム塩)(18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS#849412-67-5
1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホ-(1'-ミオイノシトール) (アンモニウム塩) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLRまたはZOOMEssen BioScience, Inc.生細胞顕微鏡イメージング
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher ScientificElectron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comイメージング解析
FEI MAPSサーモフィッシャーサイエンティフィックhttps://www.fei.com/software/maps/EM解析
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comNMRデータ収集
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ NMRデータ解析
Slidebook3i (Intelligent Imaging Innovations)https://www.intelligent-imaging.com/slidebook共焦点顕微鏡

参考文献

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