方法論記事

殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性

DOI：

10.3791/58106

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2018年8月23日

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

この記事について

サマリー

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ここでは、プロトコルを提案家フライ カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系を生成し、後で機能的、それにより代謝ペルメトリンの役割を特徴づけるピレスロイドを授与セルベースの MTT アッセイと体外代謝研究を行うことにより抵抗。

要約

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カルボキシルエステラーゼを介した代謝は、さまざまな昆虫の殺虫剤抵抗性に大きな役割を果たすと考えられます。いくつかのカルボキシルエステラーゼ遺伝子は、探検するために殺虫剤耐性での役割が残っているに対し、抵抗性イエバエ フライひずみの調整を発見されました。ここでは、我々 はカルボキシルエステラーゼの機能解析のためのプロトコルを設計しました。3 つの例の実験を紹介する: (1) 式とバキュロ ウイルス媒介昆虫ハスモンヨトウ frugiperda (Sf9) セル式システムによるカルボキシルエステラーゼ タンパク質の分離(2) の細胞ベースの MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-イル]-2, 5-diphenyltetrazolium ブロマイド) 異なるペルメトリン治療昆虫細胞の耐性を測定する細胞毒性アッセイ(3)の in vitro代謝の研究ペルメトリンに向かってカルボキシルエステラーゼの代謝機能を調査します。MdαE7 抵抗性イエバエから複製されたカルボキシルエステラーゼ遺伝子系統 ALHF を飛ぶし、Sf9 細胞感染の組換えバキュロ ウイルスを作成するために使用します。異なるペルメトリン治療に対してセル目は、MTT アッセイを測定しました。パーメスリン抵抗性制御グループ (猫組換えバキュロ ウイルス感染細胞と GFP 遺伝子組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の比較実験グループ (MdαE7 組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の高められた細胞トレランス治療は、それにより化学損傷から細胞を保護する殺虫剤の代謝で MdαE7 の機能を提案しました。それに加えて、カルボキシルエステラーゼ蛋白質は昆虫 Sf9 細胞で発現され分離体外代謝研究を行うこと。かなりの in vitro代謝効率 MdαE7 のペルメトリン、殺虫剤の代謝でカルボキシルエステラーゼの関与を示す直接の方が示唆し、飛ぶため殺虫剤抵抗性の家を授与します。

概要

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殺虫剤抵抗性は現在家はえ制御世界中1,2の主要な問題であります。殺虫剤抵抗性のメカニズムを容易にこの問題のより良い理解を決定するため、新しい戦略を効果的に防止したり、抵抗の開発3の拡散を最小限に努力。カルボキシルエステラーゼ、主要な解毒酵素の一つとして、多くの隔離と様々 な昆虫4,5,6の殺虫剤の代謝における役割のため注目を集めています。私たちの以前の研究は家のハエで複数カルボキシルエステラーゼを識別しているの発現量恒常耐性 ALHF 株にまで規制がありませんがまたペルメトリン治療7 への応答で高い誘導のレベルをすることができます。.ただし、殺虫剤の代謝におけるこれらのカルボキシルエステラーゼ遺伝子の機能的な特徴は、探検するために残ります。

初期の 1980 年代8の最初のレポート以来高蛋白質生産効率性真核生物のタンパク質のプロセッシング機能9バキュロ ウイルスを介する遺伝子発現システム....

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プロトコル

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1 式とバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系が付いているターゲット蛋白質の分離

  1. 方向家のハエからターゲット蛋白質の鈍終了 PCR の製品をクローンします。
    1. 緑色蛍光タンパク質 (GFP) の PCR プライマーとその系列と選択したベクトル (表 1) の特別な要件に基づく家フライ MdαE7 遺伝子をデザインします。
    2. 耐熱性、校正の DNA ポリメラーゼとステップ 1.1.1 からのプライマーを使用して 150 μ L の PCR 反応 (30 μ L 反応バッファーの 10 mM dNTPs、DNA ポリメラーゼの 1.5 μ L、家フライ テンプレート DNA、前方のプライマーの 7.5 μ L の 6 μ 3 μ L を実行、最終巻 150 μ L を水の逆プライマーの 7.5 μ L)。30 98 ° C まで PCR 反応を熱 10 98 ° C の 35 サイクルに続いて s s、53 ° C、30 s、および 60 のための 72 ° C s、および、2 分のための 72 ° C で最後の拡張)。
      1. PCR の製品の 150 μ L で 1% の agarose のゲルを実行します。
    3. シャープ、きれいなメスとゲルの agarose からターゲット DNA のフラグメントの物品税: 1317 bp MdαE7、858 の GFP の bp。次の製造元のプロトコル (....

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結果

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異なるペルメトリン トリートメント (MTT の試金) に向かって細胞生存率

MdαE7 組換えバキュロ ウイルス感染 Sf9 細胞 (実験群) と猫組換えバキュロ ウイルス感染 (感染するバキュロ ウイルス キット提供) 細胞 (群) のペルメトリンの細胞毒性を調べた。拡張セル許容範囲が MdαE7 強く発現細胞を用いたペルメトリンには、殺虫剤と化学損害からこうして保護セルに対してこのカルボキシルエステラーゼの代謝の役割をサポートします。我々 の研究は、異なるペルメトリン濃度に対する細胞生存率で (50、100、200、400 μ M) アセトニ トリルだけで細胞と比較して計算されました。結果 MdαE7 の発現細胞の生存率が有意に高かった (101.92% 86.00% に至るまで)(図 4 b) 制御の細胞 (67.59% に至る 81.43%) よりも(

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ディスカッション

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最近数十年で表現し、大量の蛋白質の生化学的, 機能的定量法と体外酵素の特性をこのように分離異種発現システムに広く使用されています。日には、大腸菌、 ・組成分析、 Sacccharomyces 酵母、ハスモンヨトウ frugiperdaなどいくつかの別のモデル システムは組換え蛋白質の表現との選択に適応されている、興味の蛋白質22,23,24,25の大規模な生成のための in vitroシステムが欠かせません。昆虫細胞に似た細胞内環境を提供し、いくつかの重要な真核生物処理機能を維持するために選ばれた我々 の研究家フライ カルボキシルエステラーゼを生成するバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系9. バキュロ ウイルスによる発現システムの.......

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Q5 ハイフィデリティDNAポリメラーゼNew England Biolabs inc.M0491L
QIAquick ゲル抽出キットQIAGEN28704
pENTR/D-TOPO クローニングキット、One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogen by life technologyK240020S.O.C medium and universal M13 sequence primers がこのキットに含まれていました。
PureLink HiPure Plasmid Miniprep KitInvitrogen by life technologyK210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM KitsInvitrogen by life technology11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection KitInvitrogen by life technology12562-019セルフェクチントランスフェクション試薬とガンシクロビルがこのキットに含まれていました
pENTR-CAT プラスミドInvitrogen by life technologyBaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kitに含まれ、濃度:0.5 ug/uL
熱不活性化ウシ胎児血清、認定Gibco by Life Technologies10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFMGibco by Life Technologies12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &Lysis BufferG Biosciences by A Geno Technology Inc786-411
SF-900 III SFM (1回;)無血清培地 コンプリートGibco by Life Technologies12658-019
Grace's Insect Medium, UnsupplementedGibco by Life Technologies11595030
ペルメトリン (異性体) 分析標準SUPELCO by Solutions WithinTM442748
メタノール (分析グレード)Sigma-Aldrich67-56-1
アセトニトリル(分析グレード)Sigma-Aldrich75-05-8
GHP Acrodisc 25 mmシリンジフィルター、0.45 μm GHP メンブレン (HPLC 認証)Pall Life Sciences21890388
Alliance Waters 2695 HPLC SystemWaters
T100 ThermalCycle Bio-Rad Laboratories Inc.
Nanodrop 2000/2000c 分光光度計ThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBioTek
1861096

参考文献

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  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al.

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タグ

Sf9MTT

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