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方法論記事

心の血管外免疫細胞の分離と同定

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DOI:

10.3791/58114

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2018年8月23日

 ,  , 
1Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (UHN), 2Dept of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Dept of Immunology, University of Toronto, 4Peter Munk Cardiac Centre, 5Ted Rogers Centre for Heart Research

この記事について

サマリー

このプロトコルを分離、識別し、定常状態や炎症の間にマウスの心筋に存在する免疫細胞を定量化するシンプルかつ効率的な手法を提案します。プロトコルは、フローサイトメトリーによるさらに分析することができます単一細胞懸濁液の生成のための酵素的及び機械的消化を組み合わせたものです。

要約

免疫システムは、健康な心臓の重要なコンポーネントです。心筋は、定常時および炎症の異なった形態の間に機能区分と異なる免疫細胞サブセットの豊富な人口に家。最近まで、心で免疫細胞の研究に必要な顕微鏡を使用または小さな未発達の消化力のプロトコル、重度の炎症の中に十分な感度を提供が、自信を持ってすることができませんでしたを識別する-キーですが-の人口安定状態でセルです。ここでは、簡便な合成酵素 (コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼや DNAse) と前に小を区別する蛍光標識抗体の血管内投与マウスの心の機械的消化について述べるが、やむを得ない血管内細胞の汚染物質。このメソッドは、識別、表現型解析と定量化、フローサイトメトリーで分析したまたは蛍光活性化細胞ソーティングまたは磁気ビードの分離のために更に精製できる分離の実行可能な細胞の懸濁液を生成します転写の解析または生体外で研究。キーのマクロファージと樹状細胞集団の中心部を区別するためにステップバイ ステップ フローサイトの例が含まれています。中規模実験 (10 心) プロシージャの完了には 2-3 h が必要です。

概要

心筋応力または損傷、虚血を含む (虚血再灌流や心筋梗塞) の異なった形態と非虚血性 (高血圧や心筋炎) も修復と保護、炎症細胞の募集を促進します。病原性のプロパティ。1891 年には早くもラコストは最初に発疹チフス、猩紅熱の1に感染した患者の心筋細胞の浸潤の存在を説明しました。ただし、心筋免疫細胞の詳細な研究に必要なより高度な診療技術の開発。その結果、ごく最近我々 は定常状態の間に本質的なメンテナンスの役割を持つ免疫細胞の多様な人口が心筋内に存在することを理解し始めています。

組織されているとまだ、炎症における免疫細胞を特徴付ける最も一般的な方法です。しかし、組織は、貴重な診断ツール、心の免疫細胞の研究での使用で重要な制限があります。心筋に存在する免疫細胞は総細胞の非常に小さい割合を表すし、比例して巨大空間でもっとまたはより少なく均等に分散します。同様に、ウイルス性心筋炎など、心筋の炎症のいくつかのフォームは、炎症の焦点のパターンを示します。つまりは心の免疫システムの正確な分析がしばしば組織学的サンプリング、バイアスを減らすためのコストの増加の高い学位を必要とします。また、組織は、細胞の識別 (例えばパラメーターの数) で使用可能な情報の非常に限られた量を提供します。細胞サブセット (表面マーカー、転写因子分泌分子など) 複数の式マーカーの使用を必要とする数が増え、フローサイトメトリーは、診療の最も強力なツールとして地位を確立して低コスト、高スループット。

診療技術の使用は多数細胞の単一細胞分析のできる効率的な消化力のプロトコルの開発に密接に依存します。細胞抽出の徹底的なプロトコルの開発は、心臓の免疫学の研究で機会の新しいウィンドウを開きます。消化、フローサイトメトリー、トランスクリプトームの組み合わせを介してマクロファージと樹状細胞の中心部に存在する主要な人口は特徴付けられる2,3をされています。安定状態で心臓の免疫細胞の最も豊富な人口が CD64+MerTK+ CCR2 または CD11c2の表現に基づいてさらに分けることができますマクロファージ。CCR2+に対し、マクロファージが成人の骨髄造血に属します大半 CCR2 の MHC-II の高または低のレベルを表現できる、-マクロファージが出生前の起源の主に。マクロファージは、修理4傷害または定常状態における電気的接続6のサポート中に破片5の除去など主要な機能を実行します。異なるフォームの炎症の時に Ly6CこんにちはMHC-IIlo CD64int単球の重要な流入発生、これは後に Ly6CこんにちはCCR2 分化+マクロファージ2,7.健常者の心筋に存在する細胞のかなり小さいが重要な人口樹状細胞8,9で構成されます。心臓従来 Dc (cDCs) の 2 つの主要なサブセットが最近特徴付けられる: cDC1 (CD103+ Dc)、cDC2 (CD11b+ Dc)。Dc は感染8に対して防衛で重要な役割を果たすが、促進炎症、心筋梗塞9特に中に自傷をすることも。

ここでは、単純なマウス心筋から心臓免疫細胞の分離法について述べる.メソッドは、分析、または流れの cytometry の並べ替えまたは磁気ビーズ濃縮により更に精製できる単一細胞懸濁液を得るためにセル ストレーナー濾過と酵素的及び機械的消化を組み合わせたものです。管外の心筋細胞の正確な測定は、心臓の血管の血流からの可能な汚染物を除去するために心筋灌流を必要があります。さらに、さらに撮影らプロトコル10に基づく血管内の汚染物質から心筋細胞を区別する使用ことができます免疫細胞の血管内ラベリングのオプションの手順を提案する.最後に、主要なマクロファージと cDC のサブポピュレーションを識別するために基本的な流れフローサイトメトリー解析を提案します。

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プロトコル

倫理ステートメント: このプロトコルがレビューおよび大学健康ネットワーク (トロント、カナダ) で動物ケア委員会によって承認された動物のケアに関するカナダの理事会に準拠して。

1. バッファー準備

  1. HBB バッファー (ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS)、2% の熱不活化ウシ血清、0.2% ウシ血清アルブミン) を準備します。10 mL の熱不活ウシ血清と HBSS の 500 mL にウシ血清アルブミン 1 g を追加します。フィルターは 0.2 μ m のフィルターを通して消毒し、4 ° C で保存
  2. FACS バッファーを準備 (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、2% の熱不活化牛血清、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、pH 8.0) 1 mM)。10 mL の熱不活ウシ血清と 500 mL の PBS に 0.5 M の EDTA の 1 mL を追加します。フィルターは 0.2 μ m のフィルターを通して消毒し、4 ° C で保存
    注: ソリューションは 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。

2. 白血球の循環のラベリング

  1. 無菌 1 μ g 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 μ L/マウスの最終的な注入量で希釈した抗体の抗マウス CD45 注入を準備します。28.5 G インスリン注射器にボリュームをロードし、光から離れた保ちます。
    注: は、(消化後染色; ステップ 4 を参照してください)、心内染色から血管 (静脈投与による染色) を区別するために 2 つの異なる蛍光標識抗 CD45 抗体を使用します。
  2. あらかじめ 5 分赤熱ランプに尻尾を公開することによってマウス (8-12 週齢) を温めます。
    注意: は、動物を過熱しません。ランプを安全な距離を保つ (> 30 cm)。
    1. 適切なデバイスを使用して胸骨の位置で動物を抑制します。公開し、人差し指と中指で尾の根元、親指と薬指で尾の半ば遠位領域を固定化した非支配的な手と尻尾を安定させます。
      注意: は、皮膚引っ張ることができると尾の先端であまりにも多くの力を適用されません。ベベルの静脈に上向きの針を挿入します。静脈を穿刺しやすいように針を常時静脈と平行にしてください。
      注記: 注射器に流れ込む血液が発生し、良い注入の印であります。針を 90 ° の角度に曲げ投与を容易にすることができます。曲げ針が危険を表すことができるよう、安全管理室に確認します。
    2. 200 μ L を尾静脈静脈内注入します。流体は、容易に流れるし、静脈を一時的に解除ください。
      注意: 抵抗を感じる場合は、液を押し込まないでください。これは、針の紛失のサインです。
    3. マウスを人道的に安楽死させる前に 5 分間循環する抗体を許可します。

3. 心を分離して消化

  1. CO2を用いたマウスを安楽死させる、または他の安楽死制度受け入れられたプロシージャ。
    1. CO2安楽死、CO2チャンバーにマウスを置き、毎分 (すなわち、商工会議所は 10 L、2 L/分で埋める場合) 室容積の 20% にフィル レートを設定します。呼吸が停止しているまで 2 分とモニター マウスを実行します。
    2. CO2オフにシャット ダウンし、追加の 1-2 分商工会議所を開く前に呼吸が停止していることを確認マウスを残してつま先ピンチ マウスがマウスの処理に進む前に死んだことを確認するを実行します。
  2. 70% のエタノールとマウスをスプレーします。腹部の皮膚を持ち上げて、胸骨まで腰のレベルで腹側正中初めに沿って切断することによってマウスを解剖します。腹部を開き横隔膜を公開する肝臓を移動します。
  3. 肺と心臓を刺さないように注意しながら、正中線の両側に、横隔膜、肋骨をカットします。
    1. 剥離による心臓当時は肋骨、左心房、右心房続いてカット最初を公開します。
      注意: は、この臓器に含まれている血液のフラッシュの効率が低下することができます、動脈や静脈、負傷者なしを確保、心房をカットするときに注意を使用します。
    2. 15-20 ml 21 G 針装備 60 mL の注射器を使用して冷たい PBS と冷 PBS の心臓を灌流します。優しく鉗子で心の底をつかみ、左の心室の頂点近くに針を挿入します。右心室の手順を繰り返します。適切な注入は、白い肺と淡い肝臓の結果します。
      注: 灌流は、血液凝固は、細胞を循環と利子の器官を汚染することができますを避けるために安楽死した後 5 分以内で実行する必要があります。
  4. 鉗子で心のベースを保持し、優しく心を引き上げて、主要な肺動脈と静脈、大動脈、心膜の袋を切断することによって心をデタッチします。
    1. きれいな糸くずペーパー タオルで優しく親指と人差し指の間心を保持することによって、心をきれいにし鉗子と心房と主要な動脈と静脈および他の汚染物質の残党をやってのけます。
      注: は、心房全体が削除され、肺や血管などの他の組織が存在しないこれらの組織が自分の居住者の免疫細胞を持っているを確認します。肺特に心筋内のそれらのより小さい人口をマスクすることができます大規模な免疫細胞の人口があります。
  5. 冷 PBS の 50 μ L で 5 cm のプラスチックの皿の中心を配置します。
    1. 表示部分がない、滑らかな整合性まで湾曲した解剖はさみを使用して心臓をミンチします。
      注: は、組織の損失を最小化するまな板中皿の含まれる領域で心を維持してください。
    2. 2 mL 遠心チューブ 800 μ L 冷たいダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) とにカーブタイプ鉗子を用いた thetrituratedheart 組織に転送します。
  6. 私、ヒアルロニダーゼ型私 - s、60 U/mL と DNase の 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase を追加-各サンプルに。
    1. 45-60 分間で 50 rpm ロッキング シェーカーで 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
  7. 消化力の渦のサンプルに簡潔に後 (20 s)、すぐに 4 ° C でサンプルを保つために氷の上
    1. 組織サンプルが均一、ピペット チップを詰まらせるれませんまで上下サンプルのピペット 1 mL pipettor を使用します。
      注: は、再現性を高める可能性がありますピペットに特定回数を定義します。心は最適な消化されない場合心筋の部分ピペットを妨害する可能性があります。遠心チューブに対してピペット先端を軽く研削と、組織の大きな部分を均質化に役立ちます。
  8. あらかじめ冷たい HBB の 1 mL を 50 mL の円錐管に 40 μ m セル ストレーナーを濡れています。
    1. フィルターに均質化サンプルを追加し、ゆっくり冷たい HBB の 12-14 mL を注いでを介して洗浄します。
    2. 4 ° C でラベルの 15 mL の円錐管にフィルターが適用されたサンプルを転送し、
  9. 4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離機サンプル上清を離れて吸い出しなさい。
    1. 各サンプルに 1 mL のアンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーを追加することで赤血球を溶解させます。ボルテックスによってサンプルを再懸濁します、5 分間室温でインキュベートします。
    2. 溶解が完了すると、5-8 mL の冷たいハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 溶血を停止するを追加します。
  10. 遠心分離機の 400 x「アウトドア 4 ° c で 5 分間のサンプル上清を離れて吸い出しなさい。
  11. 各サンプルとラベル付き 1.5 mL 遠心チューブへの転送に 1 mL の FACS バッファーを追加します。
    注: プロトコルを一時停止できるここで 2 h までの 4 ° C で保存のサンプル

4 流れの Cytometry の染色と分析

  1. 4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離機サンプル
    1. 非特異抗体の結合を減らすためには、1: 100 抗 CD16/CD32 および単球ブロック (1:20) を希釈サンプルあたり 50 μ L FACS 会計 (材料の表を参照)。15 分間室温でインキュベートします。
    2. 50 μ L のサンプル/FACS のため抗体希釈 (各抗体 1: 250) 会計を準備します。
      注: 生存率色素抗体カクテルで死んだ細胞を除外するために含めることができます。また、使用される (図 1CとD)、流れ解析による小型除外もあります。
    3. 洗浄せず抗体各サンプルし、ミックス マスター ミックスの 50 μ L を追加します。
    4. 暗闇の中で 30 分間、4 ° C でサンプルをインキュベートします。
  2. 洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 400 x gでサンプルごとのサンプルを 600 μ L FACS を追加します。
  3. 上清を吸引し、300 μ L FACS でペレットを再懸濁します。暗闇の中で 4 ° c のサンプルを保ちます。
    注: フローサイトメトリーを実行する前に 10 分以内で染色 DAPI など、いくつかの生存の染料が必要です。
  4. フローサイトメトリーによる分析 (図 1 および図 2を参照) 次の 3 時間以内。長い時間が必要な短期的固定低濃度パラホルムアルデヒドを使用して場合 (0.5-1 %pbs) 染色を維持するためにお勧めします。
    注: 開始フロー フローサイトメトリー分析の前に 40 μ m セル ストレーナー流れの cytometer の流体工学の妨害を防ぐためにサンプルのフィルターを適用することを勧めします。

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結果

日には、よい方法設計されていますない心筋細胞など、他のコンポーネントの心筋細胞から免疫細胞を分離します。したがって、CD45 続く単一セルおよび小型除外ゲート (図 1A) 免疫細胞群を識別するために、あらかじめゲーティング フローサイトメトリーによる心筋単一細胞懸濁液の分析が必要です。また、死んだ細胞を除外するには、生存の染色を実行できます。小さいサイズ排除と生存率染料染色死んだ細胞 (図 1Bと1 D) を除外するほぼ同等の方法を表します。それは細胞の実行可能性があります崩壊とを消化手順後すぐに染色抗体続行、いつも細胞懸濁液を 4 ° C に勧めします。通常、この手順は実行可能な免疫細胞の約 80-90% を生みます。

心筋の同定...

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ディスカッション

心筋の炎症や心筋炎、最も心血管疾患の機能であります。ただし、心筋はありません非病気の状態で、独自の免疫のコンポーネントを欠いています。定常状態の時に多くの免疫細胞は、心筋に存在し、保守と保護の不可欠な役割を果たします。細胞のこれらの多様な人口の特性はこのプロトコルで発表したものなどの方法なしで可能をでしょう。

心筋の機械的および酵素の消化力の組み合わせは、流れの cytometry または免疫ビーズ分離などの分析の他の方法と組み合わせて使用できる単一細胞懸濁液の分離を許可します。本法に関するいくつかの考慮事項考慮する必要があります。最初に、すべての私たちの分析は; 心筋内人口を参照してください。これら独自の特異性と専門的な組織として、我々 は我々 の分析から心房を除外します。第二に、使用される酵素の量は、他のソースからの酵素を使って消化力のセットアップに役立つ活動単位として表されます。ただし、酵素の最終濃度と消化の時間の empiric 最適化は推奨は高い制限酵素は、細胞量を大幅に削減でき、あまり消化大幅に生存率に影響を与えます。標識抗体の血管内投与を含む省略可能な手順は特にお勧め...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、カナダの協会の健康調査 (148808 148792) によって支えられた、SE に支えられ心臓・卒中財団、オンタリオ地方事務所、10 セントの行進財団、テッド ・ ロジャース センターの心研究 Peter Munk 人材賞」を受賞心臓センター。XCC 機構バンティング交わりを保持します。ラは、心臓と脳卒中/リチャード ・ Lewar 就労賞を保持します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸緩衝生理食塩水Wisent311-010-CL1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide NeedleBD305167
Hank'S Balanced Salt SolutionWisent311-511-CL1x HBSS
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA4503-50G
ウシ血清ΣB9433
0.5 M エチレンジアミン四酢酸BioShopEDT111
真空フィルター , 0.2 & micro;m Filtropur V50Sarstedt83.1823.001
28 G 1/2 1 cc インスリン シリンジBD329424
60 mL シリンジBD309653
Modified Eagle MediumWisent319-005-CL1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase ISigmaC0130from Clostridium histolyticum
ヒアルロニダーゼ I-SSigmaH3506
DNase-ISigmaD4513ウシ膵臓
細胞ストレーナー由来, 40 & micro;m ナイロンファルコン352340
塩化アンモニウムカリウム (ACK) 溶解バッファーロンザ10-546E
Alexa Fluor 700 抗マウス/ヒト CD11bバイオレジェンド1012221:250 希釈
APC/Cy7 抗マウス Ly-6cバイオレジェンド1280251:250 希釈
APC 抗マウス CD103バイオレジェンド1214141:250 希釈
ブリリアントバイオレット605抗マウスCD11cバイオレジェンド1173341:250希釈
PE抗マウスLy-6Gバイオレジェンド1276071:250希釈パシフィック
ブルー抗マウスI-Abレジェンド1164221:250
FITC抗マウスCD64(FcgRI)バイオレジェンド1393151:250希釈PE
/ Cy7抗マウスCD45レジェンド1031131:250 希釈
PerCP/Cy5.5 抗マウス CD45Biolegend1031321:40 希釈
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)Biolegend1013201:100 希釈
True-Stain Monocyte BlockerBiolegend4261011:20 希釈
FlowJo V10TreeStar Inchttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
マウス:Batf3-/-ジャクソン研究所JAX:013755
Dulbecco's バイオ希釈バイオ

参考文献

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