逆方向に加圧ポーチ内全体の人間の心の decellularization

サマリー

このメソッドにより、高浸透圧刺激とイオン洗剤最小限オルガン マトリックス破壊の灌流に基づく単純なプロトコルを使用して複雑な固体器官の decellularization です。流れのダイナミクスと細胞残骸の流出のリアルタイム モニタ リングと加圧のポーチの中の人間の心の新しい decellularization 技術が装備されています。

要約

末期心不全患者のための究極のソリューションは、臓器移植です。しかし、ドナー心は限られて、免疫抑制は必須であり最終的に拒絶反応が発生することが。機能を作成して、自家バイオ人工心臓は、これらの課題を解決できます。足場と細胞から成る心臓の立体組織自動製造は 1 つのオプションです。マイクロおよびマクロ アーキテクチャと同様に、組織固有の構成と自然な足場は、人間や豚などの大型動物から decellularizing 心によって取得できます。Decellularization は、3 D の細胞外マトリックスと血管系を維持すると、後で timepoint で「cellularization」を許可する細胞の残骸洗浄を含みます。複雑な器官の血流 decellularization を見つける私たちの小説を生かすことが可能、内部加圧ポーチ、逆にそれらを配置することによって非可移植性の人間の心を decellularize により「生理」手法を開発しました。制御圧力下での配向。加圧ポーチを使用する目的は、閉めたままにしておくと心筋灌流を改善する大動脈弁に圧力勾配を作成します。流動ダイナミクスと流体の流入と流出の破片の両方を監視することができました decellularization 中細胞の残骸除去の同時評価は単純な心臓の修復のいずれかを使用ことができる足場を生成するため (例えばパッチとしてまたはバルブ足場) または全体器官足場として。

概要

心不全は、患者の高い死亡率に します。末期心不全の究極の治療法の選択肢は、同種移植です。ただし、移植ドナー臓器不足のため長い待ちリストがある、患者の顔移植後慢性臓器拒絶反応^1,2生涯免疫抑制からその範囲のハードルします。患者さん自身で脱人間サイズ心の再作成によって生体機能心細胞がこれらのハードル³を回避できます。

主要なステップ「エンジニア リング」で心が適切な血管および実質の構造、構成および配置をガイドするには関数と足場の作成と配信の細胞の組織。適切な枠組みの存在下で足場に播種された細胞環境を認識し、その臓器の一部として予想される関数を実行します。我々 の意見では、脱臓器細胞外マトリックス (dECM) には理想的な足場の必要な特性が装備されています。

本質的な血管を活用し、複雑な全体器官 decellularization 達成できる順行または逆行性灌流⁴繊細な 3 D 細胞外マトリックスと血管^{2、維持しながら携帯電話のコンポーネントを削除するには 5,6,7}。それは生体内で、養分分布と廃棄物の除去⁸の機能血管系バイオ エンジニア リング全臓器だけで重要です。Decellularization 冠動脈灌流ラット⁴、または豚^{4,7,9,10,11 から脱心の作成に効果を発揮する実証されています ,12,13}, と人間^5,7,14,,1516。まだ、バルブ、心房および他の「薄い」地域の整合性は苦しむことができます。

人間サイズ脱心臓の足場豚圧力制御^{7,9,10、11,12}または注入流れ率コントロール^13,を使用して得られる¹⁷および圧力を使用して人間のドナーから^5,7,14,15を制御します。人間のドナー心の decellularization 発生する縦方向^5,,1516または 60 mmHg¹⁴で制御圧力の下で 16 日間で 80-100 mmHg で制御圧力の下で 4-8 日間.順行、圧力制御 decellularization の下では、大動脈弁能力は、冠灌流効率と大動脈のルートで安定した圧力を維持する上で重要な役割を果たしています。我々 の以前の仕事では、decellularization プロシージャしたがって最後⁹の足場の整合性の中に心の向きが、冠灌流効率の影響を及ぼすことを明らかにしました。

私たちの以前の仕事⁹の続きは、として全体心 decellularization を改善するために膜のようなポーチを追加する前記斬新なコンセプトを紹介します。加圧袋は、反比例指向の内部と大動脈のルートで 120 mmHg で制御圧力の下で人間の心の decellularization について述べる.このプロトコルには監視フロー プロファイルと冠灌流効率と細胞の破片の除去を評価する decellularization プロシージャ全体の流出媒体のコレクションが含まれます。生化学的アッセイは、手法の有効性をテストするのには、実行されます。

プロトコル

すべての実験は、テキサス心臓研究所から倫理委員会ガイドラインに従います。

1. 臓器準備

注: 寄付の LifeGift、テキサス州 (http://www.lifegift.org) の非営利臓器調達機関連携人間の心移植には適していない研究承認の同意を得て使用されました。

1. 心を調達するには、心に 30,000 の U ヘパリン静脈内注入します。安全にカニュラ大動脈にカニューレを縫合し、固定灌流線を接続します。下大静脈 (IVC) 右心を発散するために穴を開けます。左上肺静脈や左心耳、左心室を発散するためにカットします。
2. 心術のヘパリン生理食塩水 1 L を吹き込みます。血管や周囲の組織添付ファイルから心を解放する他の肺静脈、上大静脈 (SVC) と大動脈弓枝を解剖します。アイスの食塩でよくヘパリンの心に浸します。
3. 寄付された人間の心検査 (前方と後方に,図 1)。解離性のトレイに中心を置き、構造上の損傷または解剖学的奇形の検査します。肝臓や肺移植のため調達された、中心部は短い下大静脈や左心房後壁の不在の場合があります。
4. 心房中隔欠損症 (ASD)、心室中隔欠損 (VSD)、またはバルブ (肺、大動脈弁、僧帽弁、三尖弁) 奇形 - 可能な欠陥の内部検査を実行します。
5. 中隔欠損が存在する場合は、適切な縫合糸 (図 2 a、2 b) で修正します。肺動脈 (PA) 流出濁度測定による decellularization の進行状況を監視する中隔欠損の修正です。隔欠損症の補正は左右短絡を削除します、したがって、PA からの流出は、冠静脈洞を介して冠循環での流出を表しています。
6. 2-0 絹糸 (図 2) と優れたと劣るの上大静脈を結紮します。
7. その後穿刺のメイン PA (図 2 D) から大動脈 (Ao) を解剖します。
8. Ao と PA に (図 3) 容器の直径に基づいてコネクタを挿入し、2-0 絹縫合糸 (図 4 a) で安全を確保します。
9. 肺静脈開口部のいずれかを使用してチューブ (図 4 b) 左心房と左心室 (LV) (図 3)、方行を挿入します。
10. Ao と流出の行 PA (図 3) の 1 つには、コネクタに輸液ラインを接続します。
11. 準備された心を逆向きでポリエステル ポーチ (逆さまに) 配置します。
12. 灌流コンテナーに心でポーチを配置し、蓋 (図 4) を閉じます。
13. (コンテナーの直径に基づいて) ゴム栓のそれぞれのポートにそれぞれの線を接続し、(図 4および図 5 b) のポリエステルの袋を密封するために灌流容器のふたにそれを挿入します。
14. 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (136 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄蒸留水、pH 7.4 で 1.8 mM KH₂PO₄ ) 流出 PA からラインを確認するゴム栓の注入ポートを介して灌流します。左に挿入
15. この流れを使用すると、血管の血液の残留痕跡器官をきれいにします。流れを見られない場合は、彼らは緩いかもしれない接続線を締めます。

2. システムのセットアップとオルガン Decellularization 手順

1. バイオリアクターをアセンブルして縦方向 (図 5) を配置します。灌流システムには、パーソナル コンピューター (PC)、比例・積分・微分 (PID) 制御、Ao 注入の蠕動性ポンプ、灌流型バイオリアクター、LV による固定 (2 L 吸引ボトル底の圧力ヘッド コンテナーが含まれていますsidearm)、および圧力ヘッド容器から余分な水分を排出し、ペンシルバニア州から流出を収集する蠕動性ポンプ
2. ゴム隔壁、輸液ライン、圧力ヘッド ライン、PA 流出ライン、バイオリアクター ドレイン線を灌流型バイオリアクター (図 5 a) の上に置かれたゴム キャップ表面ポートに接続します。
3. 大動脈ルートで測定 120 mmHg の一定圧力の下で心を decellularize します。LV の平均圧力は、全体 decellularization プロセス全体で 14-18 mmHg 内する必要があります。
4. 次のように心を decellularize: 高張液 (500 mM NaCl)、低張液 (20 mM NaCl)、ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (1 %sds) ソリューションの 120 h の 2 h の 4 h と 1 × PBS (図 6 a) の 120 l の最終的な洗浄。
5. 吐出し圧力一定制御 (120 mmHg) の下で心を decellularize します。Ao に輸液流量は心に依存しは、平均では、高張液 98.06±16.22 mL/分、低張液 76.14±7.90 mL/分、SDS の 151.50±5.76 mL/min と PBS 185.24±7.10 mL/分。高張液の 23.36±5.70 L、9.13±1.26 L 低張液の各試薬消費量の平均値します。
6. SDS 灌流末まで 1 %sds (心重量のグラム当たり 1 L) の最終 60 L を循環させます。図 6 aは、データ収集のためのエンドポイントを引き出す decellularization プロセスのタイムラインを示しています: モニタリング (Ao と PA) および流出コレクション (PA と非 PA 圧力ヘッドから decellularization の間) の流れ。
7. SVC と下大静脈を結紮、それは仮定する合理的な実際の冠動脈灌流 (図 5 b) の結果は、すべての流体が PA から収集されました。Ao に直接注入溶液の流量による PA 外液の流量を割って冠灌流効率を決定します。
   冠動脈灌流効率 = (%)。
8. 透明な底の 96 ウェル プレートのウェルあたり 200 μ L をロードして 280 吸光度を読み PA と LV と重複して注入ソリューションから得られる出納の比較分析を行う nm。正規化された値の最高を与えるため経験的を選択した異なる値を試した後、吸光度値が見つかりました。
9. コントロールとして、きれいな注入された試薬の濁度を使用します。流出液の濁度は、細胞の残骸のウォッシュ アウトを表し、プロセスのトラッキング ツールとして decellularization 中に即座に定量化することができます。
10. 1x PBS の 10 l、最終洗浄中に 500 mL の滅菌中和 2.1% 過酢酸酸溶液、PBS で 0.1% 過酢酸酸ソリューション (v/v) につながる、10 n NaOH で中和を追加します。このソリューションを使用して、足場を滅菌します。

3. 脱心の評価

注: decellularization 後、代表的な心は冠動脈造影画像・生化学アッセイに使用されます。

1. 冠動脈の血管の厳守を調べる代表的な decellularized の人間の心の冠動脈造影検査を実行します。簡単に言えば、メイン右と左冠動脈冠動脈入口部カニューレを通して造影剤の注入後、人間の心を脱することが、イメージ透視装置を使用して。
2. 残りのデオキシリボ核酸 (DNA)、グリコサミノグリカン (GAG) と脱組織 SDS レベルを評価する 19 の地域からサンプルを取得する decellularized の心臓を解剖します。心室から心のベースを削除し、4 つの等しいセクション (図 6) に心室を解剖します。前部と後部の右心室 (RV)、前部と後部左心室と心室中隔 (IVS) に各セクションを分割します。頂点を含む組織がサンプリングの左心室と右心室に解剖しました。
3. DNA、ギャグおよび SDS 試金 (湿重量の 〜 15 mg) のための組織サンプルをカットします。
4. 65 ° C で 3 時間 1 M NaOH でサンプルの消化によって二本鎖 DNA (dsDNA) を抽出し、7 10 x トリス EDTA (TE) バッファーと 1 M 塩酸 (HCl) を使用して pH を調整します。
5. DsDNA アッセイ キットを用いた標準的な子牛の胸腺 dsDNA の定量化 (材料の表を参照してください)。蛍光マイクロ プレート リーダーを使用して重複のサンプルを読む (480 nm および 520 放射で励起 nm)。死体 (脳死 %) を各組織に dsDNA 濃度を比較することによって decellularized の心の中の残留 dsDNA の割合を計算します。
6. 3 時間の 65 ° C でパパイン抽出溶液 (0.2 M リン酸ナトリウム EDTA 二ナトリウム塩、システイン塩酸バッファー、酢酸ナトリウム、パパイン) で組織サンプルの消化によってソリューションに硫酸化ギャグを取得します。グリコサミノグリカンのアッセイ キットを使用して (重複) でギャグ コンテンツを測定します。
7. 温水真空とメジャーの乾燥重量で SDS 試金のためのサンプルを凍結乾燥します。乾燥に各サンプルに純水 200 μ L を追加し、ソリューションに残留の SDS を抽出する均質化します。クロロホルムにこの SDS ソリューションとメチレン ブルー溶液 (0.01 M 塩酸の 1 L のメチレン ブルーの 12 mg) を混ぜます。SDS は、メチレン ブルー色素に結合して有機層の分離されます。
8. 蛍光マイクロ プレート リーダーを使用して吸光度を読む (655 nm) 基準と残留の SDS を計算する重複のサンプルの。組織の乾燥重量にこの SDS 値を正規化します。
9. Decellularization 後の携帯電話の削除を確認する非線形光学顕微鏡 (NLOM) と人間の心の厚い部分 (すなわちLV、RV および中隔) から画像のサンプル。NLOM セットアップは、私たち以前の出版物^18,19,20の詳細です。NLOM は、外因性の汚れや色素²¹を使用せずイメージ セル、エラスチン、コラーゲンとミオシン繊維の 2 光子蛍光 (TPF) と第二高調波発生 (SHG) チャネルを通じて私たちをできます。

結果

120 mmHg の一定の圧力下で順行大動脈送血法を 7 日間 decellularization 後、は、人間の心は、半透明 (図 6 b) をなった。心は、生化学 (DNA、ギャグおよび SDS) 分析最終 decellularized 製品を評価する (図 6) のための 19 のセクションに肉眼的解剖されました。

Decellularization プロセス全体にわたって注入流量、圧力など様々 なさまざまなソリューションが一定に保たれました。徐々 に 96.68±23.54 から灌流液として 80.59±12.41 mL/分 (16.64%) に減少した Ao (図 7 a) に流量は高張から低張に変更。対照的に、流量は 110.61±14.40 mL/分 (54.3...

ディスカッション

私たちの知る限り、これはフロー率および細胞残骸の取り外しの時間経過モニタリングと加圧のポーチの中の人間の心の反転レポート decellularization に最初の研究です。心膜のようなポーチは、decellularization プロシージャ全体で安定した心の向きを保持します。水没しポーチの中の全体の心を反転脱水を防ぐことができ、とき (心重量) から大動脈に過大な負担を最小限に抑える、従来直立蛍光灌流 decellularization 方法⁹と比較して。これは、順番に、大動脈弁の能力が保持されます。

最大 decellularization の効率を達成するため、冠血管抵抗が低適切で一貫した流体全体の心筋血流を確保するため必要があります。全体心 decellularization モデルで逆行性血流を使用して、流体は心室に蓄積し、ターンでは、冠動脈の血管抵抗が増加し、流体の流れを制限内圧を高めます。にもかかわらず、大動脈弁はそのまま、心室キャビティは生理漏れにセカンダリを塗りつぶし、順番心室壁が圧縮されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-0 シルク縫合糸	Ethicon	SA85H	上大静脈と下大静脈の結紮に使用される縫合糸
1/4" x 3/8" コネクタ、ルアー付き	NovoSci	332023-000	大動脈と肺動脈の接続
Masterflex プラチナ硬化シリコーンチューブ	コール・パーマー	HV-96410-16	心臓室/静脈
の注入および流出ライン	スミス・メディカル	MX452FL	血管系を流れる溶液用
ポリエステルポーチ (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)	フィッシャーサイエンティフィ	01-812-17	脱細胞化中に心臓を封じ込めるための心膜様ポーチ
スナップウェア スクエアグリップ キャニスター	スナップウェア	1022	1リットル 心臓の灌流に使用される
容器 ブラック ラバー ストッパー	VWR	59586-162	シールするため灌流容器
蠕動ポンプ	ハーバード大学装置	881003	流入ラインを通じて流体を汲み上げ、流体を排出するため
2 L アスピレーターボトル ボトムサイドアーム付き	VWR	89001-532	溶液/灌流液保持用
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit	Life Technologies	P7589	dsDNA
Calf thymus standard	Sigma	D4522	DNA標準
Blyscan グリコサミノグリカン アッセイキット	バイオカラー株式会社	ブライスキャン #B1000	GAGアッセイキット
プレートリーダー	Tecan	Infinite M200 Pro	分析アッセイ用
GE蛍光透視	ゼネラル・エレクトリック	OEC 9900 エリート	血管造影
Visipaque	GE	13233575	造影剤