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方法論記事

魚脳下垂体から質の高いプライマリ細胞培養の準備

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DOI：

10.3791/58159

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2018年8月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, University of Oslo

この記事について

サマリー

ここで準備し、メダカ (メダカ) からプライマリ下垂体の細胞培養を維持するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルの最適化条件はそれにより生理学的より意味のある結果を有効にする、魚の生理学的条件を模倣して考慮温度、浸透圧、pH などの重要なパラメーターを取る。

要約

一次電池文化は、制御された環境で隔離されたセルの携帯電話の特性と機構を研究する科学者によってよく使用強力なツールです。哺乳類と魚の生理学の広大な相違にもかかわらず、魚からの一次電池文化プロトコルはしばしば哺乳類培養条件、頻繁に唯一のマイナーな変更に基づいてください。環境の違い、体温だけでなく、浸透圧、pH、pH 緩衝能など血清パラメーターに影響を与えます。細胞培養媒体と同様の作業ソリューションは、細胞外液や血清をセルが適応の特性を模倣する意味が、それは問題の動物にこれらのパラメーターが調整されることが重要です。

現在のプロトコルには、めだか (メダカ) の最適培養条件がについて説明します。プロトコルが特定し、健康を維持する方法の詳細については、1 週間以上の下垂体細胞を解離を提供し、次の手順が含まれています: 1 めだか血血しょう、2 値に浸透圧の調整が見つかりました。 の調整、。通常メダカ温孵化の温度 (ここの水族館施設で)、および 3。温度変化が同じ他魚種に匹敵する値を pH と炭酸バッファーの調整。記述のプロトコルを使用して示された結果は、めだかの生理学的意味のある結果を促進し、非哺乳類の他の種からの一次電池文化の科学者たちによってリファレンス ガイドとして使用できます。

概要

細胞培養は、通常細胞生理学から創薬スクリーニングと発癌の1に至るまでさまざまな生物学的質問に答えるためのエクセレント モデル システムを提供する分子の生物学的研究で使用される主なツールの 1 つです。初代培養細胞、酵素および/または機械的方法を使用して動物の組織から直接分離はしばしば生物学的反応は生体内での状況に近いかもしれません、細胞よりもっと生物学的関連と見なされます。一次電池文化の準備のためのプロトコルはセルが適応する特性を模倣し、生理学的意味のある結果を取得するために関心の種とセルの種類に対して最適化必要があります。

多数のプロトコルは、魚類細胞の培養条件を記述する類似したプロトコルは比較ではなく希少哺乳類細胞用培養条件を説明します。細胞、浸透圧、pH、温度の急激な変化に弱い、特に壊れやすい解離している最中です。市販の塩溶液と哺乳類の細胞培養用培地は pH バッファー システムと浸透圧の面で特に、魚類の最適化されていません。したがって、測定し、関心の種でこれらのパラメーターの関連する生理学的レベルの解決策を調整することが重要です。

初代の下垂体培養は、コイを含む複数の魚類の種から作られている (コイ)2,3草鯉 (ソウギョ idella)4金魚 (キンギョ)5レインボー ・ トラウト (オンコルヒュンクス)6、ヨーロッパのウナギ (アンギラ)7ティラピア (外部 mossambicus)8ゼブラフィッシュ (動脈分布)9と大西洋タラ (ガドゥス モルア)10。興味の種に孵化の温度を調整する、離れて加湿雰囲気で 7.5 7.2 から pH を有する興味の種の最適ではないことができる哺乳類のような条件下で細胞を培養がこれらのプロトコルのいくつか3-5% CO2を含みます。さらに、それは明白でなくこれらの一次電池文化のいくつかを準備するために使用されるソリューションの浸透圧が調整された場合、異なるソリューション間では安定です。

現在のプロトコル大西洋タラ10から初代培養前の仕事に基づいておりに孵化の温度、浸透圧、pH、および (pCO2) の二酸化炭素の分圧を含む pH バッファー システムの調整を含むめだか (O. 学) の生理。めだかは小さい (3-4 cm) の淡水魚、東アジア原産です。これらの日、それは比較的簡単に繁殖と多くの共通の魚の病気11に強いと、世界中の多くの研究所のモデル種として使用されます。ある 4-40 ° C11短い世代時間、透明な胚、性決定遺伝子12、および配列されたゲノムの13と同様、多くの温度許容値を含むモデルとしてめだかを使用していくつかの利点他利用可能な遺伝資源。

このプロトコルでは初代培養条件は、medakas は、魚の施設内に保管されている 26 の ° C の温度に合わせて最適化されています。さらに、浸透圧は 290 mOsm/kg 新鮮な水に住んでいるメダカのために食塩水に住んでいる大西洋タラから 320 mOsm/kg からは減り、めだかプラズマ14正常浸透圧に従っています。比較では、哺乳類のプラズマの代表的な浸透圧は 275-295 mOsm15の範囲内です。いろいろな温度で生活を魚し、哺乳類のものとは異なる魚の血液と細胞外液の pH とバッファー容量を作り、水との直接接触は、エラがあります。哺乳類の文化メディアには通常メディアが 37 ° C で加湿空気中 5% CO2の標準的な雰囲気に包まれた平衡時の pH は 7.4 前後の結果バッファー システムが含まれますPH は温度に依存し、減少温度16(水) で中性の pH 増加の値です。典型的な魚類 7.9177.7 から血漿 pH の範囲です。このプロトコルの最適化には、cod pH 7.75 めだか 0.5% から 1% に CO2を増やすことによって 26 の ° C で保管用に 12 ° C で保管のため pH 7.85 から削減が含まれています。

さらに、重炭酸塩の緩衝能が違う魚や哺乳類の。魚の鰓上 CO2の交換が簡単に水で pCO2肺18pCO2の小さい一部分だけです。温度または pCO2のいずれかを変更すると、pH および媒体のバッファーが変更されます。その結果、pH も哺乳動物細胞の培養に適して pCO2魚類細胞に最適です、したがって、文化メディアは魚の生理学的に関連する値を含むバッファー システム最適化必要があり、興味の特定の種。このプロトコルはメダカの脳下垂体からの一次電池文化の準備、培養温度、浸透圧、pH、および pH バッファー システムの一次電池を準備する際に考慮すべきその他の重要なパラメーターに加えて調整を含める方法をについて説明します非哺乳類の種からの文化。

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プロトコル

本研究では動物実験は生命科学、研究動物の福祉と介護に関する次のガイドラインのノルウェーの大学によって承認されました。

1. 溶液の調製

  1. 正しく測定するための製造元の指示に従って osmometer および pH の計器を調整します。
  2. Ca2 +・ Mg2 +の 500 mL を準備-無料ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) 7.75 (ステップ 1.2.1) を pH と 290 mOsm/kg (ステップ 1.2.2) 生殖不能のろ過 (ステップ 1.2.3) 前に浸透圧を調整します。
    1. 慎重に慎重にソリューションを攪拌しながら 1 M 水酸化ナトリウム溶液の滴を追加することによって校正された pH 計を 7.75 に pH を調整します。
    2. 校正 osmometer を使用して、ソリューションの浸透圧を測定し、マンニトール 290 mOsm/kg まで浸透圧を高めるために必要量を計算します。マンニトールの必要量を追加し、正しい調整のように、再び溶液の浸透圧を測定します。
      注: マンニトールの必要量は通常異なります異なるバッチ間測定、浸透圧に依存します。マンニトールの 1 つの分子は、1 浸透粒子を等しくなります。
    3. 無菌フィルター 0.2 μ m フィルターを用いた dPBS ソリューション。
      注: ソリューションは、少なくとも 3 ヶ月間の 4 ° C で保存することがあります。
  3. L-グルタミンと重炭酸塩、なし・ リーボヴィッツ (L-15) 培養液 500 mL を準備し、サプリメント (ステップ 1.3.1) 10 mm NaHCO3それ、4.5 mM グルコース (ステップ 1.3.2) および 2 mM 市販グルタミン (1.3.3 のステップ)。290 mOsm/kg (ステップ 1.3.4) への解決策を調整する滅菌フィルター (手順 1.3.5) ペニシリン ストレプトマイシン溶液 (ステップ 1.3.6) 2.5 mL を追加。
    注: ソリューションは、最低 4 週間は 4 ° C で保存する可能性があります。
    1. NaHCO3 10 ミリメートルのソリューションを達成するために培養液 500 mL あたり 420 mg を追加します。
    2. 4.5 ミリメートルのソリューションを達成するために培養液 500 mL あたりのブドウ糖の 405 mg を追加します。
    3. 2 ミリメートルのソリューションを達成するために培養液 500 mL のグルタミン溶液の 100 x の在庫の 5 mL を追加します。すべての溶質を溶解するまで攪拌します。
    4. マンニトール、osmometer (1.2.2 のステップで実行されます) を使用してで 290 mOsm/kg にソリューションを調整します。
    5. 0.2 μ m フィルターを用いた L-15 媒体の生殖不能のろ過を実行します。
    6. 生殖不能のろ過後 50 U/mL のペニシリンとストレプトマイシンの 50 μ g/mL に対応する、ペニシリン ストレプトマイシン溶液 2.5 mL を追加します。
  4. 1 mg/ml II S (1.2 の手順で準備) 変更された dPBS に溶解 (0.1%) のトリプシン型のトリプシン溶液 50 mL を準備します。2 mL の因数は、滅菌プラスチック チューブ、-20 ° C で使用するまで保管します。
    注: 2 mL の因数は-20 ° C で少なくとも 3 ヶ月間保存できます。
  5. 1 mg/ml (0.1%) トリプシン阻害剤型私-S、トリプシン阻害剤溶液 50 mL を準備し、2 μ g/mL (1.2 の手順で準備) 変更された dPBS で溶かした DNase でそれを補います。2 mL の因数は、滅菌プラスチック チューブ、-20 ° C で使用するまで保管します。
    注: 2 mL の因数は-20 ° C で少なくとも 3 ヶ月間保存できます。

2. 機器の準備

  1. 火細胞解離の先端を研磨ガラス ピペットを準備します。ヒントは 2 つの異なるサイズのカテゴリを作る (中オープニング 0.6-0.8 μ m と 0.4 – 0.6 の小さな開口部 μ m)、ピペットを同時に回しながら炎からの距離と時間でやって。(45 分の 105 ° C で固体モードを使用) して清潔なガラス容器、オートクレーブにガラス ピペットを配置します。
  2. スチロールの箱に氷を準備します。
  3. 解剖中に脳下垂体を転送し、氷の上 1.5 ml (1.2 の手順で準備) 変更された dPBS のプラスチック製のチューブを準備します。
  4. 準備 (準備手順 1.2 で) 変更された dPBS 10 mL で 15 mL チューブ細胞解離まで氷の上保管してください。
  5. 新鮮な準備やトリプシン、トリプシン阻害剤ソリューション (1.4 と 1.5 の手順で準備) の因数を解凍し、使用するまで氷のそれらを保ちます。
  6. 風呂の水を 26 ° C へ、脳下垂体の化学分解する前に必要な温度に達するまで水を許可する郭清を開始する前に設定します。
  7. 解剖と微細な針とワックス プレート魚を固定するため使用する微細鉗子を含め、使用中、前後は、70% エタノールですべて解剖ツールをきれいに。清潔な手袋を使用 (変更および頻繁にきれい) 細胞の潜在的な汚染を避けるために全体の手順中に。

3. 下垂体解剖と細胞解離

  1. 氷のスラッシュ (0 ° C) でそれを浸すことによって魚を安楽死させます。不可逆的な低体温症ショックを確保するため、少なくとも 1 分の氷のスラッシュに魚を残します。
    注: 数秒後の固定化と均衡の損失が発生します。魚は完全に氷の水で浸漬と後者は窒息につながる潜在的な皮膚火傷迅速かつ人道的な低体温のショックではなく、氷の上にないことを確認します。
  2. すぐに網で魚を解剖顕微鏡の下でワックス プレートに転送し、首をニードル パンチで脊椎を破壊します。
  3. (口の中) の上フロントと頭 (脳) の後ろの各側に 1 つの解剖の前に頭を安定させる 1 つの針を挿入することによって、微細な針を使用してワックス プレートに魚の頭を固定します。
  4. 解剖顕微鏡の下で魚を見るし、軽く斜め先端微細鉗子を使用して頭の上でスケールをこすり落とします。
  5. 慎重に頭の側から皮膚の下微細鉗子の斜めの先端を挿入し、頭骨の屋根を囲む鉗子にしっかりしたグリップを保持しながら、口の中の方向に鉗子をゆっくり移動によって頭蓋骨屋根を取り出します。
  6. 脊髄を完全にカット斜め先端に鉗子を使用して。
    注: 時間は重要な要因で動作するように効率的に、正確に時間を制限する過ごした、脳下垂体の解剖から皿にメッキパーツをセルまで。いくつかの練習後下垂体解離する 10 のまわりでだけの魚、あたり約 2-3 分を取る必要があります脳が既にさらされて下垂体を選ぶには s が必要があります。
  7. 慎重に下垂体を公開し、クリーンな鉗子先端部がストレートと口に向かって脳を裏返します。変更 1.5 mL dPBS を含むプラスチック製のチューブに下垂体を転送 (詳細については、手順 2.3 を参照してください) 氷の上に配置します。チューブに下垂体が正常に追加し、鉗子には何も残らないようにする顕微鏡下で鉗子の先端を確認します。
    注: を同時に準備している培養皿の数によっては、必要に応じて多くの脳下垂体を解剖します。親指のルールとして (これは下流のアプリケーションによって異なります) 細胞の適切な密度を持っている皿あたり成魚から少なくとも 10 の脳下垂体を計算します。
  8. 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機で脳下垂体をスピンダウンします。慎重に dPBS ガラス ピペットを使用してを削除して、脳下垂体が削除されないように注意してください。
  9. 脳下垂体を洗浄し、1-2 s の卓上遠心分離機でそれらをスピンダウンすると追加の 1 mL のトリプシン溶液を追加する前にガラス ピペットを使用する液体の大部分を削除 (1.4 の手順で準備) トリプシン溶液 1 mL を追加します。
  10. できれば穏やかな揺れでの 30 分の 26 ° C の水浴中でチューブを孵化させなさいまたははじくを潜伏期間中に何度かも。
  11. 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機で脳下垂体スピンダウン、すべて脳下垂体が管の下部にあるかどうかを確認します。ガラス ピペットのトリプシン溶液の大部分を除去し、トリプシンを不活化し、脳下垂体を洗う (1.5 の手順で準備) トリプシン阻害剤溶液の 1 mL を追加します。
  12. 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機でダウンそれらを回して管の下部に脳下垂体を収集します。ガラス ピペットと液体の大部分を除去し、(手順 1.5 で準備) トリプシン阻害剤溶液の 1 mL を追加します。20 分間、できれば穏やかな揺れ、26 ° c の水浴にチューブを配置またははじくをトリプシンを不活化する潜伏期間中に何度かも。
  13. L-15 培地 2 mL を追加し、それは細胞をメッキする前に適切な温度と pH をアクセスできるように、1% の CO2と 26 の ° C で少なくとも 10 分間インキュベートする中央ガラス底の 35 mm ポリ d リジン コーティングされた細胞培養皿を準備します。
    注: プラスチック製細胞培養皿を使用もできます。集中ガラス底の皿を使用しての主な利点は、セルがメッキパーツ領域が小さく、したがって、下垂体細胞の数が少ない、皿ごとに必要です。いくつかのダウン ストリーム アプリケーションは、ガラス底 (すなわち、いくつかのイメージング技術) をも必要があります。
  14. 15 mL チューブの冷却遠心分離機を機械的解離を開始する前に目的の温度に到達することを許可する 4 ° C に設定します。
  15. 収集回して管の下部に脳下垂体卓上遠心室温で 1-2 秒のために (ステップ 3.11) からトリプシン阻害剤溶液にチューブをダウン、すべて脳下垂体が前にチューブの下部に位置して確認慎重にガラス ピペットを使用してトリプシン阻害剤溶液のほとんどを削除します。
    注: 次の手順すべて層流ベンチ (LAF) のプロトコルのセル セルの汚染を避けるために仕事のため認定。
  16. 下垂体組織の部分に冷たい変更 dPBS (2.4 の手順で準備) の 1 つの mL を追加し、(手順 2.1 の準備) 火磨かれたガラス ピペットで (6-7 x) 上下組織部分を優しく吸います。
    注: 温度は重要な側面、4 ° C ですべてのソリューションをおくこれ以降、氷が可能なすべての手順を実行します。
  17. 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機の組織部分をスピンし、慎重に解離細胞 (約 1 mL) を含む dPBS の上部を氷上に置いた新しい 15 mL チューブに転送します。組織の部分が残っているチューブの下部に向かってピペットを移動しないでください。
  18. 手順 3.16-3.17 dPBS のすべての 10 mL が使用されるまで、一度に冷たい dPBS の 1 mL の細胞を分離します。解離の (追加 dPBS の最後の 3-4 mL) の中型の開始と終わりに向かって開口部が小さいとガラス製ピペットに切り替えるガラス ピペットを使用して開始します。まだ目に見えるがある場合、解離プロシージャの終わりに向かって組織部分はピペッティング解離の dPBS 2 の最後の手順の方の約 10 倍に増加、最終的に残存組織の部分を残します。優しく、細胞を再懸濁し、セルを泡の表面に添付するとき、それは細胞の損傷を引き起こす可能性があります泡を作成しないようにします。
    注: これはこのプロトコルの重要なステップであり、良い結果を達成するためにいくつかのトレーニングが必要です。
  19. 遠心分離機 (4 ° C に冷却済み) とスピン ・ ダウン 4 ° c. で 10 分の 200 x gで細胞の管をバランスします。細胞ペレットをされるチューブの側面をマークすることを確認します。
  20. 遠心分離機からチューブを慎重に取り外し、軽く遠心分離後直接空 15 mL プラスチック チューブにガラス ピペットで上澄みを転送します。必ず上澄みの大部分を削除するが、小さな (よく見えない) 細胞ペレットを失うことを避けるために注意してください。
  21. 慎重に L-15 培地の 50-100 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。
    注: この段階でそれはセルをカウントおよび/または (セル診断トリパン ブルーの存在下でカウント) などの生存試験を実行しますが、この目的のための細胞懸濁液の一部を使用しては、収量を下げることに注意してくださいすることが可能。皿の中心から外れた拡散セルのリスクが増えると大きなサスペンション ボリュームを使用しないでください。
  22. 慎重に (3.13 の手順で調製した) L-15 培地 2 mL を含む細胞培養皿の真ん中に解離細胞を点滴します。ガラス底のくぼんだ部分の外に広がる細胞を持っていることを避けるために、インキュベーターに移動する前に約 5 分の皿の底に沈むのセルを許可します。
  23. すべてのセルの徹底的にシンクし、皿の底を付けるように CO2を 26 ° C と 1% で皿を孵化させなさい。
  24. 30 分後に彼らが培養皿に接続されていることを確認するために顕微鏡で細胞を見てごらん。
  25. 26 ° C および 1% の CO2で細胞をインキュベートし続けます。
  26. 慎重に変更のほとんど (しかしすべてではない)、媒体ごとに 3-4 日。
    メモ: は、セルを邪魔し、ガラスの船底からデタッチそれらがより頻繁に媒体を変更しないでください。種まき後 1 週間以内、実験用セルを使用します。

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結果

このプロトコルはメダカの脳下垂体からの一次電池文化の準備を記述する、少なくとも 1 週間の文化で維持できる健康な細胞を提供しています。プロトコルは、めだか14生理関連値に基づいており、さらにメッキに組織採取から全体の手順中に 7.75 の pH, 290 mOsm/kg の浸透圧を使って大人の魚で下垂体組織に最適化されて細胞の培養 (図 1および図 2)。

このプロトコルによって生成される一次電池文化の実験から代表的な結果は、図 3図 4、および図 5で表示されます。ここで示された結果、遺伝子組換えメダカ ライ...

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ディスカッション

In vitro細胞培養システムは、右の方法1で使用する場合異なる生物学的質問の茄多に答える研究者のための強力なツールを提供します。彼らはもともとの体内よりも、隣接セルへの接続を失っている解離細胞が異なる機能特性に取得したことを覚えていることが重要です。危険を冒しての in vitroの実験から得られた結果を誤って解釈されているように、興味の種および細胞の種類に一次電池文化のプロシージャの調整を検討することが重要です。標準培養プロシージャと使用されるソリューションも適度な調整が深く特定のセルタイプの培養条件を変えるに十分多い。

このプロトコルは準備し、温度、浸透圧、pH、および pCO2ソリューションの使用のようにパラメーターを調整することによって達成することができます大人のメダカ脳下垂体からの一次電池文化を維持するための最適条件を記述します。この種の生理的条件に一致します。PH は温度に依存を異なる温度17在宅...

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開示事項

著者申告するものがあります。

謝辞

このプロジェクトはノルウェー大学生命科学許可番号 243811 と 244461 (養殖プログラム)、ノルウェーの研究評議会によって賄われていた。魚施設を維持するため生命科学のノルウェー大学ルルド ・ キャリオン タンに感謝しております。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコ塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)グマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)D85371M NaOHでpH 7.75、マンニトールで290 mOsmに溶液を調整します。
L-15培地(Leibovitz)、L-グルタミンSigma(メルク、ダムシュタット、ドイツ)L5520500ml培地、10 mM NaHCO3、4.5 mMグルコース、2 mMグルタマックス。マンニトールとフィルター溶液を使用して溶液を290 mOsmに調整し、0.2 µ2.5mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液を追加する前に、PES滅菌フィルターを使用します(詳細は以下を参照)。
NaOHSigma (Merck, Damstadt, Germany)S58811 M 溶液を滴下して、dPBS と培地の pH を 7.75 に上昇させます。
NaHCO3Sigma (Merck, Damstadt, Germany)S576110 mM NaHCO3は、500 mL の培地あたり 420 mg に相当します。
D-マンニトールシグマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)63565dPBSおよび培地の浸透圧を高めるために使用します。浸透圧290 mOsmに達するために必要な正しい量を計算します。
D-グルコースSigma (Merck, Damstadt, Germany)G54004.5 mM D-グルコースは、500 mLの培地あたり405 mgに相当します。
GlutaMAX SupplementGibco (Life Technologies, Paisley, UK)35050-061L-グルタミンの代替品で、安定性が向上しています。2 mM Glutamax は、500 mL の培地に 100x ストック 5 ml に相当します。
ペニシリン-ストレプトマイシンシグマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)P0781ストック溶液10,000ユニットのペニシリンと10mgのストレプトマイシン/mL。2.5 mLのストック溶液を500 mL L-15培地(50 U / mLペニシリンと50 µに相当)に使用します。g / mLストレプトマイシン)。.
トリプシン II-SSigma (Merck, Damstadt, Germany)T7409dPBS 溶液で 1 mg/mL を調製します。
トリプシン阻害剤I-S型シグマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)T6522dPBS溶液で1 mg / mLを調製し、2 & micro;g/ml Dnase I(詳細は下記参照)。
Dnase ISigma (Merck, Damstadt, Germany)D5025トリプシン阻害剤溶液(上記参照)に使用します。
0.2 &マイクロ;m ポリエーテルスルホン(PES)滅菌フィルターシステムCorning Inc.(コーニング、ニューヨーク州)431097調整後のdPBSおよびL-15培地の滅菌ろ過に使用します。
ガラス底、ポリd-リジンコーティングされた35mm細胞培養皿MatTek Corporation(マサチューセッツ州アッシュランド)P35GC-1.5-10-Cは、下流の用途に応じてプラスチック皿に置き換えることもできます。
デュモン #5 ファイン フォーセプスファイン サイエンス ツール (CA)11254-20ストレート チップ
デュモン #5/45 ファインサイエンス ツール (CA)11253-25角度 45°C
先端 実体顕微鏡 SZ61オリンパス (日本)垂体の解剖に使用します。
Alegra X-22R CentrufugeBeckman Coulter Inc.(カリフォルニア州ブレア)冷却オプション付き(現行モデルXR-30と同様)。
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シサプリメント 下

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