魚脳下垂体から質の高いプライマリ細胞培養の準備

サマリー

ここで準備し、メダカ (メダカ) からプライマリ下垂体の細胞培養を維持するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルの最適化条件はそれにより生理学的より意味のある結果を有効にする、魚の生理学的条件を模倣して考慮温度、浸透圧、pH などの重要なパラメーターを取る。

要約

一次電池文化は、制御された環境で隔離されたセルの携帯電話の特性と機構を研究する科学者によってよく使用強力なツールです。哺乳類と魚の生理学の広大な相違にもかかわらず、魚からの一次電池文化プロトコルはしばしば哺乳類培養条件、頻繁に唯一のマイナーな変更に基づいてください。環境の違い、体温だけでなく、浸透圧、pH、pH 緩衝能など血清パラメーターに影響を与えます。細胞培養媒体と同様の作業ソリューションは、細胞外液や血清をセルが適応の特性を模倣する意味が、それは問題の動物にこれらのパラメーターが調整されることが重要です。

現在のプロトコルには、めだか (メダカ) の最適培養条件がについて説明します。プロトコルが特定し、健康を維持する方法の詳細については、1 週間以上の下垂体細胞を解離を提供し、次の手順が含まれています: 1 めだか血血しょう、2 値に浸透圧の調整が見つかりました。 の調整、。通常メダカ温孵化の温度 (ここの水族館施設で)、および 3。温度変化が同じ他魚種に匹敵する値を pH と炭酸バッファーの調整。記述のプロトコルを使用して示された結果は、めだかの生理学的意味のある結果を促進し、非哺乳類の他の種からの一次電池文化の科学者たちによってリファレンス ガイドとして使用できます。

概要

細胞培養は、通常細胞生理学から創薬スクリーニングと発癌の¹に至るまでさまざまな生物学的質問に答えるためのエクセレント モデル システムを提供する分子の生物学的研究で使用される主なツールの 1 つです。初代培養細胞、酵素および/または機械的方法を使用して動物の組織から直接分離はしばしば生物学的反応は生体内での状況に近いかもしれません、細胞よりもっと生物学的関連と見なされます。一次電池文化の準備のためのプロトコルはセルが適応する特性を模倣し、生理学的意味のある結果を取得するために関心の種とセルの種類に対して最適化必要があります。

多数のプロトコルは、魚類細胞の培養条件を記述する類似したプロトコルは比較ではなく希少哺乳類細胞用培養条件を説明します。細胞、浸透圧、pH、温度の急激な変化に弱い、特に壊れやすい解離している最中です。市販の塩溶液と哺乳類の細胞培養用培地は pH バッファー システムと浸透圧の面で特に、魚類の最適化されていません。したがって、測定し、関心の種でこれらのパラメーターの関連する生理学的レベルの解決策を調整することが重要です。

初代の下垂体培養は、コイを含む複数の魚類の種から作られている (コイ)^2,3草鯉 (....

プロトコル

本研究では動物実験は生命科学、研究動物の福祉と介護に関する次のガイドラインのノルウェーの大学によって承認されました。

1. 溶液の調製

1. 正しく測定するための製造元の指示に従って osmometer および pH の計器を調整します。
2. Ca^{2 +}・ Mg^{2 +}の 500 mL を準備-無料ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) 7.75 (ステップ 1.2.1) を pH と 290 mOsm/kg (ステップ 1.2.2) 生殖不能のろ過 (ステップ 1.2.3) 前に浸透圧を調整します。
   1. 慎重に慎重にソリューションを攪拌しながら 1 M 水酸化ナトリウム溶液の滴を追加することによって校正された pH 計を 7.75 に pH を調整します。
   2. 校正 osmometer を使用して、ソリューションの浸透圧を測定し、マンニトール 290 mOsm/kg まで浸透圧を高めるために必要量を計算します。マンニトールの必要量を追加し、正しい調整のように、再び溶液の浸透圧を測定します。
      注: マンニトールの必要量は通常異なります異なるバッチ間測定、浸透圧に依存します。マンニトールの 1 つの分子は、1 浸透粒子を等しくなります。
   3. 無菌フィルター 0.2 μ m フィルターを用いた dPBS ソリ....

結果

このプロトコルはメダカの脳下垂体からの一次電池文化の準備を記述する、少なくとも 1 週間の文化で維持できる健康な細胞を提供しています。プロトコルは、めだか¹⁴生理関連値に基づいており、さらにメッキに組織採取から全体の手順中に 7.75 の pH, 290 mOsm/kg の浸透圧を使って大人の魚で下垂体組織に最適化されて細胞の培養 (図 1および図 2)。

このプロトコルによって生成される一次電池文化の実験から代表的な結果は、図 3図 4、および図 5で表示されます。ここで示された結果、遺伝子組換えメダカ ライ.......

ディスカッション

In vitro細胞培養システムは、右の方法¹で使用する場合異なる生物学的質問の茄多に答える研究者のための強力なツールを提供します。彼らはもともとの体内よりも、隣接セルへの接続を失っている解離細胞が異なる機能特性に取得したことを覚えていることが重要です。危険を冒しての in vitroの実験から得られた結果を誤って解釈されているように、興味の種および細胞の種類に一次電池文化のプロシージャの調整を検討することが重要です。標準培養プロシージャと使用されるソリューションも適度な調整が深く特定のセルタイプの培養条件を変えるに十分多い。

このプロトコルは準備し、温度、浸透圧、pH、および pCO₂ソリューションの使用のようにパラメーターを調整することによって達成することができます大人のメダカ脳下垂体からの一次電池文化を維持するための最適条件を記述します。この種の生理的条件に一致します。PH は温度に依存を異なる温度¹⁷在宅.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコ塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)	グマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)	D8537	1M NaOHでpH 7.75、マンニトールで290 mOsmに溶液を調整します。
L-15培地(Leibovitz)、L-グルタミンSigma(	メルク、ダムシュタット、ドイツ)	L5520	500ml培地、10 mM NaHCO3、4.5 mMグルコース、2 mMグルタマックス。マンニトールとフィルター溶液を使用して溶液を290 mOsmに調整し、0.2 µ2.5mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液を追加する前に、PES滅菌フィルターを使用します(詳細は以下を参照)。
NaOH	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5881	1 M 溶液を滴下して、dPBS と培地の pH を 7.75 に上昇させます。
NaHCO3	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5761	10 mM NaHCO3は、500 mL の培地あたり 420 mg に相当します。
D-マンニトール	シグマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)	63565	dPBSおよび培地の浸透圧を高めるために使用します。浸透圧290 mOsmに達するために必要な正しい量を計算します。
D-グルコース	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	G5400	4.5 mM D-グルコースは、500 mLの培地あたり405 mgに相当します。
GlutaMAX Supplement	Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)	35050-061	L-グルタミンの代替品で、安定性が向上しています。2 mM Glutamax は、500 mL の培地に 100x ストック 5 ml に相当します。
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)	P0781	ストック溶液10,000ユニットのペニシリンと10mgのストレプトマイシン/mL。2.5 mLのストック溶液を500 mL L-15培地(50 U / mLペニシリンと50 µに相当)に使用します。g / mLストレプトマイシン)。.
トリプシン II-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T7409	dPBS 溶液で 1 mg/mL を調製します。
トリプシン阻害剤I-S	型シグマ(メルク、ダムシュタット、ドイツ)	T6522	dPBS溶液で1 mg / mLを調製し、2 & micro;g/ml Dnase I(詳細は下記参照)。
Dnase I	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D5025	トリプシン阻害剤溶液(上記参照)に使用します。
0.2 &マイクロ;m ポリエーテルスルホン(PES)滅菌フィルターシステム	Corning Inc.(コーニング、ニューヨーク州)	431097	調整後のdPBSおよびL-15培地の滅菌ろ過に使用します。
ガラス底、ポリd-リジンコーティングされた35mm細胞培養皿	MatTek Corporation(マサチューセッツ州アッシュランド)	P35GC-1.5-10-C	は、下流の用途に応じてプラスチック皿に置き換えることもできます。
デュモン #5 ファイン フォーセプス	ファイン サイエンス ツール (CA)	11254-20	ストレート チップ
デュモン #5/45 ファイン	サイエンス ツール (CA)	11253-25	角度 45°C
先端 実体顕微鏡 SZ61	オリンパス (日本)		垂体の解剖に使用します。
Alegra X-22R Centrufuge	Beckman Coulter Inc.(カリフォルニア州ブレア)		冷却オプション付き(現行モデルXR-30と同様)。
ウォーターバス	Techne(スタッフォードシャー、英国)		温度を調整する可能性のあるウォーターバスなら何でもかまいません。
パスツールガラスピペットVWR	(NY)	612-1701	外径1.6 mm、使用前にファイヤーポリッシュとオートクレーブ。
ギャラクシーMiniStarテーブル遠心分離機	VWR(NY)	521-2844	どんな小さなテーブルcentrigueでもかまいません。
細い針/昆虫ピン	ファインサイエンスツール(CA)	26001-40	直径0.03mm。代わりに他の細い針を使用できます。
ワックスプレート			大きなシャーレに溶かしたパラフィンワックスを加えてカスタムメイド。

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