方法論記事

導出とイヌの卵巣間葉系幹細胞の分化

5.3K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/58163

⸱

2018年12月16日

 ,  ,  ,  , 
1The School of Agricultural and Veterinary Studies (FCAV), Jaboticabal, São Paulo State University (UNESP), 2CRRF, Université de Montréal, 3FZEA, University of São Paulo, 4FMVZ, University of São Paulo

この記事について

サマリー

ここで、分離、拡張、および犬の卵巣組織から間葉系幹細胞の分化の手法について述べる。

要約

間葉系幹細胞 (MSCs) の金利は、分離、拡張、および文化の容易にするため過去 10 年間増加しています。最近、研究はこれらの細胞を持っている広い分化能力を実証しています。卵巣は、MSCs が豊富です、それは頻繁、生物系廃棄物として卵巣摘出手術後破棄されるため細胞ベースの治療のための有望な候補を表します。隔離、拡張のための手順を説明し、細胞選別の必要なし、犬の卵巣由来の分化技術。このプロトコルは、臨床試験のこれらの高い微分可能セルの幅広い適用性のため再生医療のための重要なツールを表し、治療を使用します。

概要

幹細胞に焦点を当てるを過去 10 年間強力な再生医療の治療法の発見の集団の目標によって支えられている研究努力で大幅に増加している発表された研究の数です。幹細胞がある 2 つの主要な定義のマーカー: 自己改修と分化。間葉系幹細胞は正規の組織の売り上げ高し、分化1胚性幹細胞と比較した場合の制限のより強い能力を持っています。最近では、多くの研究は、MSCs の分化の広い範囲を示しているし、の議論の下でトピックがすべて2胎児および成体幹細胞の違いが存在するかどうか。

卵巣表面上皮は、コミットされていない細胞の層、比較的少ない差別化、表現両方上皮と間葉系マーカー3、さまざまな種類の細胞に分化する能力を保持します。環境シグナル4。卵巣の幹細胞の正確な位置はよく知られている; ないです。しかし、逃げずに bipotential 前駆細胞が生殖細胞5に上昇を与えることが提案されている.これらの細胞が間質起源6を持っているまたはまたは卵巣表面7に近位に存在する、免疫学的研究、仮説を立てた。迅速な接着と細胞の人口の選択セルの人口を明確に特定するという仮説を検証する実験が設計された以来、間葉系幹細胞は、細胞接着8で重要な役割を果たす多くの受容体を表現、自然の中に間葉系として characterizable。最近、私たちのグループは、MSCs の迅速な接着9電池の精製された人口を得るために、文化の最初の 3 時間で培養皿のプラスチック表面への密着性の能力に基づく卵巣組織からの派生を報告しました。ここでは、卵巣組織から間葉系幹細胞分離法の開発について述べる.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

この実験は、犬の滅菌プログラムで手術後寄贈 4 雑種メス犬の卵巣を行った。この実験は UNESP-FCAV (プロトコル番号 026991/13) の動物の使用の倫理委員会で承認されました。

1. 実験準備

  1. 準備またはダルベッコ滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) カルシウムやマグネシウムなしの 500 mL を購入します。
  2. 準備、コラゲナーゼの DPBS 1 mL に酵素 40 μ g を混合することによってソリューションをストックします。0.2 μ m のシリンジ フィルターを使用してフィルターを適用し、-20 ° C で 2 mL 因数を格納
  3. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 低グルコース 10% 胎児血清と抗生物質の 1% から培地を準備します。
  4. 滅菌材料を集める: ハサミ、鉗子、培養フラスコ料理・ チューブ ・ 10 mL と 5 mL のピペットです。
  5. 標準的な細胞培養実験装置を使用して: 生物学的安全キャビネット (BSC)、5% CO2と 38 ° C、および遠心分離機に設定セル文化インキュベーター。
  6. きれいに BSC: 70% に滅菌手袋をはめた手で UV ライトを使用して、エタノール。

2. 卵巣から幹細胞の分離

  1. 手術後、ラボに到着するまで円錐管で氷の上の PBS で卵巣を維持します。
  2. 10 mL の PBS で 2 つの 100 mm ペトリ皿を埋めます。
  3. チューブから卵巣を削除し、PBS で最初のシャーレにそれらを転送します。動きの混合で洗ってください。
  4. 優しく卵巣を取得し、別皿に。滅菌ピンセットとはさみ、約 1 mm サイズの非常に小さな部分に、ティッシュをミンチします。
  5. 35 mm ペトリ皿の卵巣組織を転送し、コラゲナーゼの 2 mL を追加します。もう少し組織をミンチします。
  6. ペトリ皿を 38 ° C で 3 時間のためのインキュベーターで置き、円形の動き 20 分毎でシャーレを軽く振る。
  7. 3 時間後に、インキュベーターからペトリ皿を削除します。
  8. 15 mL チューブに料理の内容を転送します。増殖培地 5 mL を追加します。
  9. 軽く遠心分離前にチューブを反転します。2100 x g で 7 分間削除でチューブに上清を遠心し、増殖培地 3 mL にペレットを再懸濁します。
  10. T25 ボトルにペレットを転送します。5% でインキュベーターでボトルを配置38 ° C 3 時間で CO2 。
    注: プロシージャの最も重要な部分は、インキュベーションの 3 h 後メディアを変更することです。
  11. インキュベーターからボトルを外し、残りの組織とメディア。新鮮な増殖培地 3 mL をボトルに追加します。
  12. メディアごとの 48 h を変更し、細胞の合流のためのびんを調べます。
    注: プロシージャの主な手順は、図 1に観察できます。

3. 卵巣から幹細胞の拡大

  1. セルの通路
    1. セルが合流点に達したら、ボトルからメディアを削除します。
    2. PBS の 3 ml ボトルを洗います。PBS を削除します。
    3. 1.5 mL のトリプシンおよび 3 分の 38 ° C でインキュベーターでボトルをデタッチする細胞を助けてボトルを軽く入れを追加します。
      注: 電池が合流点約 5 - 7 初期めっき後 d に達する必要があります。
    4. 増殖培地 3 mL を追加し、内容を円錐管に転送します。
    5. 2100 x gで 7 分間削除でチューブに上清を遠心し、増殖培地 1 mL を加えます。
    6. 優しく管の内容をホモジナイズしてください。
    7. カウントのインキュベーターにセルでチューブを入れてセルを実行するサンプルの 10 μ L の因数を取る。
    8. 場所 10 μ、検定にミックス。
  2. セルをカウント
    1. 顕微鏡の対物レンズ 10 倍を使用し、検定のグリッド行に焦点を当てます。
    2. 5 つの小さな正方形 (図 2) のセルをカウントします。
    3. カウント数を 50,000 ミリリットルあたりのセル数を推定するに乗算します。

4. 卵巣からの間葉系幹細胞の分化

注: 分化アッセイのヒルらに規定されたガイドラインに従って行われました。9。

  1. 好評につき、3 通、4 ウェル培養皿を用いた種子 1.0 × 104セルです。
  2. 拡張メディアの 1 つの mL を追加します。
  3. 円形の動きが付いている皿を振ちましょう。
  4. 24 h 後、培地を望ましい分化メディアに置き換えます。
  5. 骨、脂肪細胞、軟骨細胞分化誘導メディア 30 d で細胞をインキュベート、メディアの交換すべて 3 d. 特定の分化キットはそれぞれこれらのアッセイのため使用されました。
  6. 神経因性の系統分化誘導メディア、メディアの交換すべての 3 d と 10 d の細胞を孵化させなさい。ここで使用するメディアには、DMEM 低血糖 2 mM バルプロ酸、1 μ M ヒドロコルチゾン、10 μ M フォルスコリン、塩化カリウム 5 mM、5 μ G/ml, インスリン, 200 μ M ブチルヒドロキシアニソールが含まれています。
  7. 内胚葉前駆体の 5 d は内胚葉メディア試薬製造元の指示に従って、孵化させなさい。
  8. 始原生殖細胞系への分化、14 d、メディアの交換すべて 3 d で誘導メディア内のセルを孵化させなさい。ここで使用されるメディアに DMEM, 10 %fbs, ピルビン酸ナトリウム 1 mM、10 ng/mL LIF、1 mM 非必須アミノ酸、2 mM L グルタミン、5 μ g/mL インスリン、0.1 mM β-メルカプトエタノール、60 μ M のプトレシン、20 μ G/ml トランスフェリン、10 ng/mL マウス表皮成長因子、1 ng/mL の人間が含まれています。塩基性繊維芽細胞成長因子 40 ng/mL 人間グリア細胞由来神経栄養因子と 15 mg/L ペニシリン。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

犬の卵巣から幹細胞の分離:

卵巣の MSC 分離手順は、図 1のとおりです。手術、組織のミンチ、コラゲナーゼの消化力、メディア変更文化の初めの後の 3 時間後、急速なプラスチック接着特性と推定される MSC 人口が犬の卵巣組織から正常に分離された.収穫された細胞は培養皿のプラスチック表面に付着かつ典型的な MSC のような形状 (図 3) と形態学的に均質な単一層文化へと成長しました。

卵巣の MSC のキャラクタリゼーション In Vitr...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここ MSCs が卵巣摘出後生物系廃棄物をある犬の卵巣組織から分離でき、証拠を提供します。卵巣に多くの細胞のタイプを見つけることができます、という事実のために、プラスチックは、線維芽細胞のような形態の単分子膜の成長細胞を正常に選択への急速な遵守に基づいて MSCs を選択するプロトコルを提案しました。

MSCs の骨髄からの派生の最初レポートは文化11; の最初の 48 時間の間に、MSCs のプラスチック付着能に基づいていたただし、それ報告されている、このメソッドを分離する異種集団表現型と機能的には、少なくとも骨髄12の可能性。本培養法はまたプラスチック接着能力によってセルを選択し、望ましいセルを並べ替えを必要としない、多くの細胞型が組織から間葉系細胞を分離します。仮説のより同質な人口になる迅速な接着と細胞の人口を選択した場合、間葉系幹細胞は、細胞接着8で重要な役割を果たす多くの受容体を表現、という事実のために、信頼性の高い MSC プロ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、卵巣を提供する親切 UNESP-FCAV で犬の滅菌プログラムを認めます。この作品は、FAPESP (プロセス号 2013/14293-0) と岬からの補助金によって支えられました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DPBS サーモフィッシャー14190144
コラゲナーゼ Iサーモフィッシャー17100017
組織フラスココーニングCLS3056
DMEM 低グルコースサーモフィッシャー11054020
FBSサーモフィッシャー12484-010
TrypLE expressサーモフィッシャー12604021
StemPro脂肪形成分化キットサーモフィッシャーA1007001
StemPro 軟骨形成分化キットサーモフィッシャーA1007101
StemPro 骨形成分化キットサーモフィッシャーA1007201
STEMdiff 決定的内胚葉キットStemCell5110
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャー15070063
CD45AbD セロテックMCA 2035S
CD34AbD セロテックMCA 2411GA
CD90AbD セロテックMCA 1036G
CD44AbD セロテックMCA 1041
ネスティンミリポアMAB353
β-チューブリン ミリポアMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG- FITCAbD セロテックSTAR80F
IgG- FITCAbD セロテックSTAR120F

参考文献

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17(2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145(2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391(2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事