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方法論記事

バイオパニングから T7 バクテリオファージの量的な PCR

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DOI:

10.3791/58165

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2018年9月27日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Pharmaceutics and Drug Delivery, College of Pharmacy, University of Texas at Austin

この記事について

サマリー

再現性の高い、正確で、時間効率的な定量的 PCR (qPCR) を列挙するメソッド T7 バクテリオファージを次に紹介します。プロトコルはバクテリオファージ DNA 調製法、PCR 反応の準備、qPCR サイクリング条件、qPCR データ分析明確にについて説明します。

要約

このプロトコルでは、ファージの選択実験を (すなわち、 「バイオパニング」) から T7 ファージを列挙する定量的 PCR (qPCR) の使用について説明します。qPCR DNA を定量化する蛍光ベースのアプローチは、ここで、それはバクテリオファージの粒子のためのプロキシとしてバクテリオファージのゲノムを定量化する適応。このプロトコルでは追加の DNA 精製することがなく高温加熱による安易なファージ DNA の調製法を説明します。メソッドには、熱処理したファージの量が少ないと qPCR 反応の量が少ないだけ必要があります。qPCR、高スループット、高速で処理し、列挙体の他のバクテリオファージのアプローチに 2-4 との比較における反応の 96 ウェル プレートからデータを取得することができる、qPCR は時間効率的です。ここでは、qPCR を使用して嚢胞性線維症のような粘液の in vitroモデルに対してバイオパニングから識別 T7 ファージを列挙します。バイオパニングの他のタイプを含む、他の実験から T7 ファージを定量化する qPCR 法を拡張できます (e.g。、バクテリオファージ スクリーニングの蛋白結合、体内を固定化) およびその他のソース (例えば、水システムまたは体液)。要約すると、このプロトコルは DNA でカプセル化されたウイルスを定量化する変更できます。

概要

1985 年にジョージ ・ スミスによって開発されたバクテリオファージ (ファージ) ディスプレイ技術は、ターゲットまたは細胞膜、病抗原、細胞細胞器官または特定の受容体に対するペプチドやタンパク質のリガンドを識別するために強力な高スループット方法臓器や組織で過去二十年1,2。ここでは、(通常 M13 または T7) に感染するバクテリオファージのコート蛋白質のポリペプチドや一本鎖抗体のランダムなライブラリが表示され、体外固定された蛋白質またはin vivoに対してパンから特異的なリガンドを識別できます。反復的な選択プロセスを生物学的システムは。次に、イメージングや治療エージェント疾患3,4の診断と治療をリガンドに結合できます。バイオパニングの複数のステップ中にファージを正確に列挙することが重要: 基質に結合するファージを定量化するには (1) と (2) 選択の各ラウンドでの濃縮があるかを決定するファージを定量化する (バクテリオファージ濃縮 biopanned を示しています。ターゲットのバクテリオファージが関係したため)。定量化、二重層プラクの試金のための現在のゴールド スタンダード複数課題;それは退屈な面倒なサンプル数が多いため不正確な可能性があります。したがって、当社グループは、バイオパニング5から M13 と T7 バクテリオファージの粒子を列挙する機密性の高い、再現可能な正確な時間効率的な量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) メソッドを開発しました。

qPCR、T7 と M13 ファージを正確に定量化する魅力的な実行可能な方法です。それぞれ個々 のバクテリオファージの粒子のみ (dsDNA または ssDNA) ゲノムの DNA の 1 つのコピーを含めることができます、ので 1 ファージのゲノムは 1 つのバクテリオファージの粒子; に相当バクテリオファージのゲノムの数を定量化することでファージの数を定量化することは不可能です。QPCR、蛍光レポーターの中に染料が非具体的バクテリオファージのゲノム DNA をバインドまたは具体的に配列特異プライマー PCR 増幅中と蛍光は、信号増幅の各ラウンドで増加します。蛍光信号を増幅のラウンド/サイクルしきい値に達したときは、しきい値サイクル (Ct) として示されています。標準曲線を確立する Ct 値に対する参照バクテリオファージ DNA 既知濃度のプロットします。DNA サンプルの Ct 値を持つ標準的なカーブを使用して、ファージの濃度を補間することができます。

多くの戦略を以前に開発し、広範囲バイオパニング ファージを定量化するために使用、それぞれの特定の課題があります。最も人気があり従来の方法は二重層プラクの試金です。ここでは、ホスト細菌シリアル希薄で作製したファージに感染している、固体寒天基板上メッキ、かぶせている寒天。ファージは、プラック数 (すなわち、プラーク形成単位または pfu) 寒天プレート上で列挙されます。プラクの試金は敏感が、退屈な時間のかかる、不正確で、特に多数のサンプルと高濃度5 です。また、酵素抗体法 (ELISA) は M13 と T7 ファージ粒子6,7、8を列挙に適応されています。異なる希釈率でファージがここでは、バインドされていると (すなわち、マイクロ プレート) 固体基板上捕獲、バクテリオファージ特異抗体を検出し、(例えば、酵素敏感 chromogenic 基板、フルオロ) の記者を使用して検出現在のバクテリオファージの粒子の数を決定します。サンプルの読み出し (例えば蛍光、吸光度) は、既知濃度のバクテリオファージの標準に対して未知濃度を定量化する使用できます。異なるファージを用いた Elisa が開発されているが、彼らは潜在的な制限があります。1 つのグループ 7 桁 (102-109 pfu/mL); スパン定量化の範囲で紙ベースのサンドイッチ elisa 法の開発ただし、このメソッドは、抗体コーティングの複数の手順が必要、試金8の全体の日取った。当社グループはまた M13 バクテリオファージの粒子を定量化する ELISA 法を開発したが、10 のより少なく敏感な検出範囲を持っていた6  1011 pfu/mL5。M13 を列挙する切替ランタニド蛍光プローブが開発され、定量データを取得; 20 分以内でした。ただし、この試金はダイナミック レンジの狭い 109 1012 pfu/mL9。1 つのグループは、ソリューションでは、M13 バクテリオファージの粒子を列挙する原子間力顕微鏡を使用が、これは高度な電子顕微鏡が必要ですのみ濃度10の狭い範囲の内で働いた。別の調査は、蛍光の M13 と T4 記者ファージをトラップし、蛍光の液滴の数によってファージをカウントする単分散エマルジョンを使用ただし、このアプローチはまた 10 から狭い定量化の範囲を展示2 106 pfu/mL11。液滴デジタル PCR は M13 ファージを定量化に使用されています中、は、このアプローチは伝染性および非伝染性のバクテリオファージの粒子の12の数の間で区別することができます。

当社グループは、qPCR T7 と M13 ファージに対して細胞の血液脳関門モデル 2 つの異なる蛍光レポーター色素5を使用してバイオパニングから特定の列挙方法を最近開発しました。前述の定量化方法と比較して、我々 が開発した qPCR 方法だった高スループットかつ多数サンプルを定量化する時間効率的であり DNase で伝染性および非伝染性のバクテリオファージの前処置を区別することが、バクテリオファージのサンプル。重要なは、このアプローチ再現性をもって、正確に定量化できます M13 と T7 バクテリオファージ バイオパニング サンプルから。バクテリオファージ qPCR 地区初心者研究者を導くためここで我々 は嚢胞性線維症 (CF)の in vitro粘液障壁に対してパン システインに制約があるライブラリ (CX7C) から T7 バクテリオファージの粒子を列挙する詳細な qPCR 法をについて説明します。この作品からは、バイオパニングの他の種類から、水、土壌、体液などの他のソースからのバクテリオファージの粒子を定量化する qPCR 法を拡張できます。

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プロトコル

1. プライマー設計や T7 バクテリオファージのゲノム DNA の解析

  1. T7 ファージのゲノム DNA の増幅用プライマーを設計します。
    注: F (フォワード) と R (リバース) プライマー (材料の表を参照してください) は、T7 DNA シーケンスを増幅ライブラリ変数領域 (図 1) の上流に位置します。
  2. 融解温度 (Tm)、パーセントの GC 含量 (GC %)、プライマー二量体、ヘアピン形成及び PCR 適合性 (図 1) を含むプライマーのパラメーターを評価する適切なプライマー アナライザーを選択します。
  3. プライマー オリゴヌクレオチド (oligos) を注文し、到着時に、100 μ M ストック濃度 1.5 mL 遠心チューブに数ヶ月-20 ° C で保存し DNase、RNase フリーの超純粋な水の凍結乾燥 oligos を再懸濁します。
  4. 100 μ M プライマー株式のいくつか因数 (各 1.5 mL チューブで約 50 μ L) を確認します。
    注: この手順は、頻繁に凍結融解を防ぐために使用されます。

2. T7 バクテリオファージのゲノム DNA の定量化のための標準を準備します。

  1. 直列 0.1 μ g/μ L (1.0 x 10 の8 fg/μ L) 参照 T7 バクテリオファージ DNA を希釈 (購入; 0.1 μ g/μ L の濃度既知のマテリアルを参照してください) 10 倍から 1.0 × 106 100 fg/μ 超純粋な H2O の 0.2 mL PCR チューブ x 1.0 に。各濃度 20 μ L (図 2) の容量を準備します。
  2. 渦 PCR チューブ希釈の各ステップで徹底的な混合を確実に。また、次の希釈に DNA のサンプルを追加するときは、ヒントを変更します。
    注: qPCR 実験バッチごとに標準的なカーブのための DNA 規格の新しいソリューションを準備することをお勧めします。
  3. 方程式 1 (下記参照) に変換するのに使用 T7 バクテリオファージ参考のため DNA 濃度 fg/μ L からゲノム コピー (gc)/µL (図 2)。
  4. T7 ファージ DNA 濃度 gc/μ L =
    figure-protocol-1(1)
    注: bp: 塩基対;参照 T7 DNA が 37314 bp。

3. バクテリオファージ サンプル前に、qPCR 反応準備の前処理

  1. (オプション 1)ピペット 20 μ L 1 つ T7 クローン (ファージ) の生体外で嚢胞性線維症 (CF) に対してバイオパニングから選択-1.5 mL 遠心チューブに粘液のモデルのようです。DNase の単位数として 1.25 を追加私 (0.5 μ L) 各 20 μ L のサンプルに。
    注: T7 ファージ システイン制約ヘプタペプチド ライブラリ (CX7C) 15 分 24 ウェル膜挿入 (材料の表を参照してください) にコーティングした CF のような粘液に対して biopanned をだった。詳細については、[結果] セクションで提供されます。1 つの T7 クローンは、溶出液からの qPCR のサンプル準備のため選ばれました。
    1. オプション 2: ピペット 200 μ L、T7 の 1.5 mL チューブにクローンし、DNase の 5 ユニットを追加私
      (2 μ L) 各サンプルに。
      注: このステップで選択したファージ サンプルのボリュームは、バイオパニングから収集量によって異なります。Biopanned バクテリオファージの qPCR のプロトコルのフォーカスがあるとき、手順 T7 バクテリオファージのユーザー プロトコルの詳細についてはバイオパニングのキット (材料の表を参照)13。
  2. T7 ファージ サンプル チューブ (ステップ 3.1) をキャップし、加熱乾燥風呂 (すなわち、熱ブロック) で 10 分の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
  3. 加熱乾燥浴 (図 3 a) で 15 分間 100 ° C で (ステップ 3.2) からチューブを孵化させなさい。
    注意: 蒸発・凝縮加熱ステップ中に発生するため、1.5 mL 遠心管が完全に制限されますを確認します。
  4. スピン渦のミキサーに管を置くことによってファージ設定 10 s、および 10 の 18,534 x gでスピンのタッチ活性化モードで 10 s. ミックス 18,534 x gでステップ 3.3 から熱処理ファージ再度 s。
    注: スピン ミックス サイクル温水バクテリオファージ サンプルも混在していることを確認することです。
  5. 一晩実験ベンチまたは冷蔵庫で 4 ° C でストアを残すことによって常温 (RT) サンプル チューブ冷却します。
    注: この手順で実験を休止できます。

4. qPCR 反応を準備します。

メモ: 1 つの PCR の反作用は 1 つのサンプルです。各 PCR の反作用を含む 5 μ L の qPCR マスター ミックス (材料を参照)、5 μ M のプライマーのペアのミックスの 1 μ L、2 μ L H2O の 2 μ L 熱処理 T7 バクテリオファージ サンプルの。複数の PCR の反作用のバクテリオファージ サンプルを除くすべての試薬は 1 つ 1.5 mL チューブに予混合します。プレミックスの各試薬の量は、qPCR のバクテリオファージのサンプルの数に依存します。

  1. 未知濃度の 10 biopanned ファージ サンプルと標準濃度 3 通の 7 サンプルの qPCR プレミックスを準備します。その結果、サンプルの合計 51 としたがって、51 の qPCR 反応 (すなわち、 1 サンプルあたり 1 つの反応) があります。51 反応、qPCR マスター ミックス (51 x 5 μ L)、プライマー (51 x 1 μ L)、51 μ L と H2O の 102 μ L (2 μ L × 51) 255 μ のプレミックスを準備します。
    注: 早かった qPCR 96 ウェル プレートの各ウェルに PCR ミックス中にボリュームの損失を補うためにいくつかの余分な PCR 反応を準備することをお勧めします。
  2. 51 井戸 (すなわち、 51 qPCR 反応) の合計は qPCR 96 ウェル プレートの各ウェルに PCR プレミックスの分注 8 μ L。早かった中にヒントを変更する必要はありません。
  3. 各ウェル (図 3 b); に熱処理 T7 バクテリオファージ サンプル (ステップ 3.4) の 2 μ L または T7 バクテリオファージ参照 DNA (ステップ 2.1) を追加します。クロスコンタミネーションを防ぐためにも別の DNA サンプルを追加するときは、ヒントを変更します。また、qPCR プレミックス (すなわち、 8 μ L の PCR プレミックスに) の表面の下に 2 μ L の DNA のサンプルを調剤します。
  4. QPCR プレート接着フィルムをシールします。
    注: この手順は、qPCR プレートの種類に関係なく、重要なです。おすすめのキットを使用して、プレートを完全にシールするにはPCR の間にボリュームの損失をプレートで任意の非密封の地域が発生するそれ以外の場合、サイクリングします。
  5. 蛍光退色を最小限に抑えるためにアルミ箔を qPCR プレートをラップし、qPCR 機器上で実行に進みます。

5. qPCR サイクリング条件

注: qPCR サイクリング条件に設置された特定の qPCR 装置 (材料の表を参照してください)。

  1. QPCR 機器の qPCR の 96 ウェル プレートを実行します。装置で次の実験条件 (図 3) を設定するのにはメニューから設定を選択します。
  2. 循環の 10 μ L のサンプル量を次のように条件を設定: 2 分の 50 ° C で 1 サイクル 2 分の 95 ° C で 1 サイクルに続いての 40 のサイクル (95 ° C、15 秒、1 分の 60 ° C)。後、融解曲線設定を実行: 15 秒、1 分の 60 ° C と 95 ° C 15 95 ° C の 1 サイクル。
  3. 手順 6 で説明したように、データを分析に進みます。

6. qPCR の生データを分析して qPCR から Ct 値変換 gc/μ L の T7 バクテリオファージ

  1. 生 qPCR データを分析し、raw データ (図 4) の特徴的なプロットを分析してデータの品質を評価します。
    注: 融解曲線プロット、多成分プロット プロット増幅 qPCR データの品質を検証するプロットの重要な特徴です。
  2. 標準曲線 (ステップ 2.1) の各濃度における帳票サンプルから平均しきい値サイクル (Ct) 値を計算します。
    1. ログ (gc/μ L) 線形曲線 Y を取得する (X) に対して平均 Ct (Y) をプロット kX + b = (k は、線形曲線の傾き、b は切片です)。
    2. 線形係数14 R2を計算 (R2する必要があります > 0.99)。
  3. 使用標準曲線 Y = kX + gc/μ L (図 5) で T7 ファージ バイオパニング サンプル (すなわちCF のような粘液に対して選択したファージ) の数を計算します。
    注: k は標準曲線の傾きです。
  4. 増幅効率を次式により計算します。
    figure-protocol-2(2)
    注: k は参照 DNA qPCR から生成された標準的な曲線の傾きです。増幅効率の理想的な範囲は 90-110% です。

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結果

異なるプライマー デザイン ・ ツールは、qPCR プライマーを設計する使用ことができます。通常、プライマー設計プログラムがある計算し、一般的にプライマー、GC %などTm、プライマー二量体またはヘアピン形成などの主要なパラメーターを検証する組み込みアルゴリズム、キー条件が異なるのと同様プライマー デザイン ・ ツール、およびプライマーは、その指示に従って設計できます。ブラストのプライマーはプライマーの特異性を確認する使用できます。1 つのプライマーのペア ゲノム DNA は図 1に示すように T7 の可変領域の上流を対象。バイオパニング、絶対からのバクテリオファージのサンプルの未知濃度を把握するには、バクテリオファージのゲノム DNA コピーを列挙する定量化手法 - 標準曲線の定量化 - が選ばれました。T7 バクテリオファージ DNA を参照 (参照資料) 既知濃度 0.1 μ g/μ L は、1.0 x 10 から希釈直列0 1.0 x 10

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ディスカッション

QPCR ファージ ゲノム DNA の5を定量化する方法を開発したし、ここで述べると CF のような粘液のバリアに対して選択された T7 ファージを列挙する qPCR 法を適応。出版物の量的なリアルタイム PCR 実験 (MIQE) のガイドラインについては最低限の情報は、開発し、qPCR T7 ファージ15の列挙法を検証する合わせられました。我々 はバイオパニング実験からファージを定量化するために開発されたプロトコルは、時間の効率的な信頼性の高い、かつ経済的なアプローチです。バクテリオファージ溶液の高温処理 (100 ° C、15 分) を使用し、に比べて従来戦略11,17、バクテリオファージ DNA 抽出と精製手順を必要としないだけの qPCR のサンプル準備のためのプロトコル 18。また、バクテリオファージの粒子をより正確に列挙する DNase はバク...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、PhRMA 財団研究スタート助成金によって支えられたし、国立心臓、肺、血液研究所健康のある国民の協会の受賞番号 R01HL138251 の下で付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Materials and Reagents
Primers forT7 genomic DNA IDTF: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG
R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select packaging control DNAEMD Millipore69679-1UG
MicroAmp optical 96-well reaction plateThermoFisher ScientificN8010560
qPCR マスターミックス--パワーアップ SYBR グリーンマスターミックスApplied biosystemsA25742
MicroAmp 光学接着フィルムキットThermoFisher Scientific4313663
T7Select 415-1 クローニングキットEMD Millipore70015ユーザープロトコル : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP
DNase I solutionThermoFisher Scientific90083
24ウェルトランズウェルプレートCorning3472
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2OInvitrogen10977015
Phosphate Buffered Saline (1x)Corning21040CV
NameCompany>カタログ番号コメント
strongEquipments
ViiA7 リアルタイムPCRシステム、高速96ウェルブロックサーモフィッシャーサイエンティフィック4453535
ヘレウスピコ21 微量遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック75002415
フィッシャーブランド デジタルボルテックスミキサーフィッシャーサイエンティフィック02-215-370
HERMO SCIENTIFIC マルチブロックヒーターThermoFisher ScientificModel:2001
Sorvall Legend X1 CentrifugeThermoFisher ScientificSpecialty 75004220
M-20 Microplate Swinging Bucket RotorThermoFisher Scientific75003624
NameCompanyカタログ番号コメント
ソフトウェア
QuantStudio リアルタイムPCRソフトウェアThermoFisher Scientificv1.2
リアルタイムqPCRプライマーデザインIDT
OligoAnalyzer 3.1IDT
T7ゲノムDNA用

参考文献

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