再現性の高い、正確で、時間効率的な定量的 PCR (qPCR) を列挙するメソッド T7 バクテリオファージを次に紹介します。プロトコルはバクテリオファージ DNA 調製法、PCR 反応の準備、qPCR サイクリング条件、qPCR データ分析明確にについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
このプロトコルでは、ファージの選択実験を (すなわち、 「バイオパニング」) から T7 ファージを列挙する定量的 PCR (qPCR) の使用について説明します。qPCR DNA を定量化する蛍光ベースのアプローチは、ここで、それはバクテリオファージの粒子のためのプロキシとしてバクテリオファージのゲノムを定量化する適応。このプロトコルでは追加の DNA 精製することがなく高温加熱による安易なファージ DNA の調製法を説明します。メソッドには、熱処理したファージの量が少ないと qPCR 反応の量が少ないだけ必要があります。qPCR、高スループット、高速で処理し、列挙体の他のバクテリオファージのアプローチに 2-4 との比較における反応の 96 ウェル プレートからデータを取得することができる、qPCR は時間効率的です。ここでは、qPCR を使用して嚢胞性線維症のような粘液の in vitroモデルに対してバイオパニングから識別 T7 ファージを列挙します。バイオパニングの他のタイプを含む、他の実験から T7 ファージを定量化する qPCR 法を拡張できます (e.g。、バクテリオファージ スクリーニングの蛋白結合、体内を固定化) およびその他のソース (例えば、水システムまたは体液)。要約すると、このプロトコルは DNA でカプセル化されたウイルスを定量化する変更できます。
概要
1985 年にジョージ ・ スミスによって開発されたバクテリオファージ (ファージ) ディスプレイ技術は、ターゲットまたは細胞膜、病抗原、細胞細胞器官または特定の受容体に対するペプチドやタンパク質のリガンドを識別するために強力な高スループット方法臓器や組織で過去二十年1,2。ここでは、(通常 M13 または T7) に感染するバクテリオファージのコート蛋白質のポリペプチドや一本鎖抗体のランダムなライブラリが表示され、体外固定された蛋白質またはin vivoに対してパンから特異的なリガンドを識別できます。反復的な選択プロセスを生物学的システムは。次に、イメージングや治療エージェント疾患3,4の診断と治療をリガンドに結合できます。バイオパニングの複数のステップ中にファージを正確に列挙することが重要: 基質に結合するファージを定量化するには (1) と (2) 選択の各ラウンドでの濃縮があるかを決定するファージを定量化する (バクテリオファージ濃縮 biopanned を示しています。ターゲットのバクテリオファージが関係したため)。定量化、二重層プラクの試金のための現在のゴールド スタンダード複数課題;それは退屈な面倒なサンプル数が多いため不正確な可能性があります。した....
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プロトコル
1. プライマー設計や T7 バクテリオファージのゲノム DNA の解析
- T7 ファージのゲノム DNA の増幅用プライマーを設計します。
注: F (フォワード) と R (リバース) プライマー (材料の表を参照してください) は、T7 DNA シーケンスを増幅ライブラリ変数領域 (図 1) の上流に位置します。 - 融解温度 (Tm)、パーセントの GC 含量 (GC %)、プライマー二量体、ヘアピン形成及び PCR 適合性 (図 1) を含むプライマーのパラメーターを評価する適切なプライマー アナライザーを選択します。
- プライマー オリゴヌクレオチド (oligos) を注文し、到着時に、100 μ M ストック濃度 1.5 mL 遠心チューブに数ヶ月-20 ° C で保存し DNase、RNase フリーの超純粋な水の凍結乾燥 oligos を再懸濁します。
- 100 μ M プライマー株式のいくつか因数 (各 1.5 mL チューブで約 50 μ L) を確認します。
注: この手順は、頻繁に凍結融解を防ぐために使用されます。
2. T7 バクテリオファージのゲノム DNA の定量化のための標準を準備します。
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結果
異なるプライマー デザイン ・ ツールは、qPCR プライマーを設計する使用ことができます。通常、プライマー設計プログラムがある計算し、一般的にプライマー、GC %などTm、プライマー二量体またはヘアピン形成などの主要なパラメーターを検証する組み込みアルゴリズム、キー条件が異なるのと同様プライマー デザイン ・ ツール、およびプライマーは、その指示に従って設計できます。ブラストのプライマーはプライマーの特異性を確認する使用できます。1 つのプライマーのペア ゲノム DNA は図 1に示すように T7 の可変領域の上流を対象。バイオパニング、絶対からのバクテリオファージのサンプルの未知濃度を把握するには、バクテリオファージのゲノム DNA コピーを列挙する定量化手法 - 標準曲線の定量化 - が選ばれました。T7 バクテリオファージ DNA を参照 (参照資料) 既知濃度 0.1 μ g/μ L は、1.0 x 10 から希釈直列0 1.0 x 10
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ディスカッション
QPCR ファージ ゲノム DNA の5を定量化する方法を開発したし、ここで述べると CF のような粘液のバリアに対して選択された T7 ファージを列挙する qPCR 法を適応。出版物の量的なリアルタイム PCR 実験 (MIQE) のガイドラインについては最低限の情報は、開発し、qPCR T7 ファージ15の列挙法を検証する合わせられました。我々 はバイオパニング実験からファージを定量化するために開発されたプロトコルは、時間の効率的な信頼性の高い、かつ経済的なアプローチです。バクテリオファージ溶液の高温処理 (100 ° C、15 分) を使用し、に比べて従来戦略11,17、バクテリオファージ DNA 抽出と精製手順を必要としないだけの qPCR のサンプル準備のためのプロトコル 18。また、バクテリオファージの粒子をより正確に列挙する DNase はバク.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、PhRMA 財団研究スタート助成金によって支えられたし、国立心臓、肺、血液研究所健康のある国民の協会の受賞番号 R01HL138251 の下で付与します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Materials and Reagents | |||
| Primers for | T7 genomic DNA IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT | |
| T7 Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR マスターミックス--パワーアップ SYBR グリーンマスターミックス | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp 光学接着フィルムキット | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 クローニングキット | EMD Millipore | 70015 | ユーザープロトコル : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24ウェルトランズウェルプレート | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | >カタログ番号 | コメント |
| strongEquipments | |||
| ViiA7 リアルタイムPCRシステム、高速96ウェルブロック | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 4453535 | |
| ヘレウスピコ21 微量遠心分離機 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 75002415 | |
| フィッシャーブランド デジタルボルテックスミキサー | フィッシャーサイエンティフィック | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC マルチブロックヒーター | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Specialty 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | カタログ番号 | コメント |
| ソフトウェア | |||
| QuantStudio リアルタイムPCRソフトウェア | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| リアルタイムqPCRプライマーデザイン | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
参考文献
- Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
- Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W.
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再版と許可
