方法論記事

ミツバチから脳ホモジネート ホスホリパーゼ C 活性の検出

DOI：

10.3791/58173

⸱

2018年9月14日

 ,  , 
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミツバチの脳の異なる領域におけるホスホリパーゼ C (PLC) 薬理学的薬剤の抑制効果をテストするためこれらの地域で PLC 活性を測定する生化学的アッセイを提案する.この試金は PLC 活動組織の中でだけでなく、さまざまな動作を示すミツバチの間での比較に役に立つかもしれません。

要約

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ミツバチは、複雑な行動や学習、メモリ、および分業化などの高次脳機能を評価するためのモデル生物です。きのこ体 (MB) は、複雑なミツバチの行動の神経基盤をことを提案する高次脳センターです。以前の研究では、MBs と他の頭脳領域に発現する蛋白質および遺伝子を特定が各地域の蛋白質の活動はまだよくわかっていません。頭脳のこれらの蛋白質の機能を明らかにする薬理学的解析が可能なアプローチでは、薬理学的操作が実際にこれらの脳部位でのタンパク質の活性を変更を確認するの先決です。

我々 は以前ホスホリパーゼ C (PLC) 他の頭脳領域よりも MBs の遺伝子の高発現を識別され、薬理学的ミツバチ動作における PLC の関与を評価しました。その研究では、我々 は生化学的 2 薬理学的薬剤をテストし、彼らが MBs と他の頭脳領域における PLC 活性を減少したことを確認します。ミツバチ脳ホモジネートの PLC 活性を検出する方法の詳細な説明を紹介します。このアッセイ系で異なる脳の領域から派生した乳剤の合成蛍光基質と反応していると PLC 活動から生じる蛍光の定量化し脳部位間で比較しました。また同じシステムを使用して PLC 動作の特定の薬の抑制効果の評価について述べる。このシステムは、他の内因性蛍光化合物および/またはアッセイ コンポーネント及び組織の吸光度によって影響を受ける可能性がありますは、このシステムを使用して PLC 活性の測定は従来の試金を使用してより安全で簡単、標識基板が必要です。簡単な手順と操作 PLC 活性脳と異なる社会的課題に関わるミツバチの他の組織を調べることができます。

概要

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ヨーロッパのミツバチ (セイヨウミツバチl.) は社会性昆虫と女性の蜂カースト依存再現と年齢依存した分業を表示します。たとえば、'workers' と呼ばれる蜂の生殖不能のカーストでは、若い個人フィード成鳥古い飼料花の蜜と花粉ハイブ1外中。学習・記憶能力は、ミツバチの生活の中で非常に重要なので、採餌する必要があります食料源と巣の間行ったり来たり繰り返し行い、その後ダンスを通じてその nestmates を良い食料源の場所コミュニケーション1。以前の研究は、MB、昆虫、高次脳中枢がミツバチ2,3,4の学習・記憶能力に関与していることを示した。ミツバチ5,6,7,8,9,10 の様々 な脳領域における特異的発現遺伝子やタンパク質を識別されています。、11、彼らが脳の各領域のユニークな機能に関連が示唆されました。薬理学的抑制や興味の蛋白質の活性化ミツバチ行動12,13,14で蛋白質の機能を明らかにするためよく使用される方法ですが、すべてが医薬品かどうか知られているそれはないです。ミツバチの脳の異なる領域に機能への影響があります。このような薬物の機能の検証を強化する行動薬理学の研究の結論。

ここでは、我々 は PLC マウス認知15,16,17,18に関与する酵素の一つに焦点を当てます。PLC は、イノシトール三リン酸 1,4,5-(IP3) とジアシルグリセ ロール (DAG)19,20,21にホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) を分解によるカルシウム シグナル伝達をトリガーします。IP3 IP3受容体の小胞体 (ER)、小胞体からのカルシウム イオンの放出につながるが開きます。リリースされたカルシウムは、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) カルモジュリンとプロテインキナーゼ C (PKC) DAG の存在下でアクティブにします。両方の蛋白質キナーゼ学習とメモリ22,23, PLC の関与がこのプロセスに一貫して関与しています。Plc は、PLCβ、PLCγ、PLCε、20代の構造に基づいてなどのサブタイプに分類されます。各 PLC サブタイプが20の別のコンテキストでは、アクティブ化され、さまざまな組織にそれらのサブタイプ遺伝子発現します。我々 は以前ミツバチ MBs が残りの脳領域24より高いレベルで PLCβ と PLCε のサブタイプをコードする遺伝子を表現し、2 つパン PLC 阻害剤 (edelfosine とネオマイシン硫酸 [ネオマイシン]) が PLC 活性を減少させることを実証異なる脳の領域と、確かに、ミツバチの24の学習・記憶能力に影響します。

伝統的にを使用して標識 PIP225、適切な訓練、機材、および設備を必要とする PLC の酵素活性を測定しました。合成蛍光基板 PLC の近年、確立された26, PLC 標準研究室の活動を評価するために簡単です。ここでは、蛍光基板を用いたミツバチの異なる脳の領域で PLC アクティビティを検出し、その後これらの組織で PLC edelfosine とネオマイシンの抑制効果をテストするための詳しいプロトコルを提案する.プロトコルは、基本的な操作のみを必要とするため他の組織における PLC 活動または社会の異なるタスクに割り当てられているミツバチの脳領域の研究に適用があります。

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プロトコル

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1. ミツバチの捕獲

  1. ローカル ディストリビューターからミツバチのコロニーを購入します。
  2. 虫取り網を使用して、後ろ足の花粉袋でハイブに戻るハチ蜂をキャッチします。標準的な 50 mL のプラスチック円錐管にミツバチを転送し、キャップ チューブ (図 1)。ミツバチを麻酔する氷のチューブを置きます。
    注: は、蜂に刺さを避けるために養蜂のため指定されたジャケットを着用します。看護の蜂は、実験によって収集されたことができます。看護婦に蜂をキャッチするには、ワックス櫛上の蜂の行動を観察し、くよくよセル翼またはピンセットを使用して胸部の幼虫を養うために頭を突っ込んでいる看護婦に蜂をキャッチします。その後、50 mL プラスチック チューブにミツバチを置いて、チューブ、キャップ、ステップ 1.2 で述べたように氷の上に置きます。
  3. ランダムに 12 採餌をキャプチャします。
    注: このプロトコル 6 ロット、ロットごとの 2 つのミツバチを使用します。複数のミツバチは 1 つの管でキャッチでき、各ロットで蜂が後で結合される、単管では、ミツバチの数は重要ではありません (3.1.1 の手順を参照してください)。管に高温を傷つけるミツバチとして、夏には、チューブ冷静さを保ちます。

2. ミツバチ脳の解剖

  1. 研究室では、少なくとも 30 分6蜂を麻酔するため氷の上 50 mL チューブを配置します。
  2. 郭清の段階を準備する歯科用ワックスの部分を半分に折る (結果のサイズは約 3.5 x 7.5 cm)、プラスチックの皿 (60 x 15 mm) に押し込みます。
    注: 折り返しのワックスはしっかりと昆虫ピンを保持します。
  3. 双眼顕微鏡 [ピンセットでその体から蜂の頭を分離し、歯科用ワックスの上方位置 (図 2A) に頭の前方で保持するために各アンテナの基部に昆虫ピンを挿入することによってそれを修正します。
    注: 使用、エタノールまたは滅菌水を使用する前にピンセットを洗います。
  4. それをカバーするために頭に注ぎ、十分な食塩水 (0.13 mol/L 塩化ナトリウム、5 ミリ モル/L、塩化カリウム 1 モル/L CaCl2-2 H2O)。頭に浮かぶソリューションの場合ピンと再び頭に穴を開けます。必要に応じて、氷冷生理食塩水ソリューションを使用します。
    注: ただし、このプロトコルは冷たい食塩なし作品します。
  5. ピンセット (図 2B) を使用してアンテナを取り外します。
  6. メスを使用して化合物の目の国境で縦のアンテナ、基地近くの水平カットを作る。頭の上部に水平カットを行います。脳 (図 2C) でウィンドウを開くにキューティクルを削除します。
    注: 必要な場合は洗ってエタノールまたは使用前に滅菌水のメスです。
  7. 単眼とピンセット (図 2D) を使用して、脳の前方の表面の気管から、網膜を削除します。
  8. メス (図 2E) による背側と腹側に, は、化合物の目の国境でカットを展開します。次、目キューティクル (図 2F) の下で直接ピンセットを挿入することによって化合物の目のキューティクルと網膜の間の結合組織を削除します。
  9. 複眼のキューティクルを破棄します。ピンセットで化合物の目の網膜の背のヒントを選択し、慎重に (図 2G) 網膜剥離する腹側方向にピンセットを移動します。
  10. ピンセット (図 2H) を使用して、脳の前方の表面に残りの気管を慎重に取り外します。
  11. 脳間とピンセットを使用して、組織の周囲の結合組織をカットそしてヘッド カプセル (図 2H) から脳を解剖します。
  12. (図 2私) ピンセットを使用して脳の後部表面に気管をはがします。
  13. メスを使用して、MBs と MBs (図 2J) の一部である垂直の葉の横にある他の頭脳領域間の接続をカット.
  14. 切り裂かれた MBs の場所と残りの 1.5 mL チューブに、急速に脳組織は、ドライアイスまたは液体窒素 (図 2K) でフリーズします。-80 ° C で凍結組織を使用するまで保存します。
    注: は、指定された手袋、コールドの燃やすと窒息を避けるために換気と液体窒素を処理します。ドライアイスは、手袋で慎重に処理する必要があります。プロトコルはここで一時停止することができます。組織であるべき脳の解剖・ タンパク質分解を避けるために一度に 1 つのハチを実行しました。

3. 脳ホモジネートの準備

  1. 均質化 50 ミリ モル/L HEPES バッファー構成の 10 μ L を追加-島 (pH 7.2) 70 ミリ モル/L、KCl と 1.0 ミリ モル/L CaCl2冷凍する脳の組織とプラスチック製の杵で手動で加圧して 1.5 mL チューブで組織をホモジナイズしてください。ストロークの組織、少なくとも 200 x。
    注: は、氷の上 3 のセクションで説明されている操作を実行します。右フィット乳棒を使用して十分に組織を粉砕する管内では簡単に均質化バッファーのフロートします。
    1. 多くの次の組織を均質化組織ソリューションを転送し、同じ方法で組織をホモジナイズしてください。
      注: 各ロットでミツバチは、この段階で結合されます。このプロトコルは、6 ロットを使用します。
  2. 均質化バッファーの 30 μ L を追加します。
  3. 約 900 × g27と 4 ° C で 10 分間の均質化組織サンプルを遠心分離します。
  4. 上清を新しい 1.5 mL チューブに転送し、再び約 9,500 × g27と 4 ° C で 20 分間それを遠心
  5. 新しい 1.5 mL チューブに上清を配置します。使用するまで-20 ° C でホモジネートを格納します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。
  6. ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを用いたタンパク質濃度を決定します。
    1. 17.5 μ L の滅菌水 (したがって磨砕液から 8 倍に希釈します) を持つ磨砕液の 2.5 μ L を希釈し、希釈の磨砕液を使用します。
      注: マイクロ ピペットを使用してサンプリング磨砕液は、高粘度のため慎重に行う必要があります。
    2. BCA アッセイを基準として 20 μ L に 0、0.1、0.2、0.4、1.0、および 2.0 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を使用してを実行します。
      注: 変更、必要に応じて BCA アッセイのスケール ホモジネートおよび標準試料の量に基づきます。プロトコルはここで一時停止することができます。

4. PLC 反応脳ホモジネート

  1. 50 µmol/L の滅菌水に溶解し蛍光基板 WH 1526のストック溶液を調製し、-80 ° C で保存
    注: は、退色を防ぐために箔で基板を含むソリューションをカバーします。
  2. 10 μ L で反応混合物の次の構成を達成するために必要なボリュームの反応予を準備: 50 ミリ モル/L HEPES-島 (pH 7.2) 70 ミリ モル/L KCl、1.0 ミリ モル/L CaCl2、2.0 ミリ モル/L ジチオトレイトール 50 mg/L、BSA と 12.5 µmol/L WH-15。
  3. 必要な場合は、均質化バッファーの磨砕液を薄くしなさい。
  4. ミックス反応予混合気と磨砕液 10 μ L 反応混合物の最終的なボリュームを達成するためにポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブの蛋白質の 1.3 μ g を含みます。
    1. 統計分析用制御混合物の 2 つのタイプを準備する: 磨砕液がない WH-15 (制御混合物 1) の混合物と逆(制御混合物 2) を置きます。
      注: は、反応混合物および蛋白質の分解と PLC の反応を防ぐために氷の上制御混合物を準備します。制御混合物 1 と 2 は、それぞれホモジネートおよび無料の基板からの蛍光を検出に使用されます。
  5. チューブをフラッシュし、25 ° C で 30 分間熱 cycler でインキュベート
  6. 25 モル/L のエチレング リコール ビス (β aminoethylether) の 2 μ L の追加によって反作用を停止-N, N, N', N'-四酢酸。
    注: 適切な蛋白質の量と反応時間は実験によって異なります。したがって、反応条件の最適化に、蛍光性は直線的に増加するまでの蛋白質量と潜伏期間を変更することで予備実験の手順 4.1 5.3 で説明した手順を繰り返す必要がある場合があります。参考のため他の頭脳領域から派生した乳剤を使用すると、反応は通常 1.3 μ g で直線動作または蛋白質の少なくとも 2.7 μ g または 90 分または lo の培養時間内 30 分ですが直線性の蛋白質の少ない減少未病体質調査。

5. PLC 活動から生じる蛍光性の検出

  1. 反応混合物、約 310 g28 x で 5 分間制御の混合物を遠心し、384 ウェル マイクロ プレート蛍光検出のために適当に上澄みの 10 μ L をさまざまな坑井に転送します。
    注: フェージングやほこりの混入を防ぐため、箔でプレートをカバーします。
  2. マイクロ プレート用の遠心分離機を使用してマイクロ プレートをフラッシュします。
  3. マイクロ プレート リーダーにプレートを設定し、技術的な 3 通と蛍光を検出します。
    注: 励起と放射の波長は、344 nm、530 nm、それぞれ。(マイクロ プレート リーダー) によって該当する場合ミックス 5 サンプル混合物の各検出前に s。プロトコルは、ここで停止することができます。

6. 阻止作用と薬理学的薬剤のテスト

  1. Edelfosine、適切な濃度でネオマイシンの貯蔵液の準備、使用まで保管: 5.0 ミリ モル/L、-20 ° C で edelfosine550 ミリ モル/L と 4 ° C でネオマイシン
  2. 前述の反応予を準備する際のステップ 4.2、阻害剤を加える適切な最終的な濃度を達成するために予: edelfosine、1.0 ミリ モル/L;。ネオマイシン, 0.55 ミリ モル/l.
  3. 4.4 ステップのように反応予混合気と適切な制御混合物に磨砕液を追加します。
    1. 制御混合物の 3 種類を準備: 磨砕液と阻害剤しかしない基板を入れて制御混合物 1;追加基板と阻害剤がない磨砕液制御混合物 2;磨砕液または基板、阻害剤の入れ制御混合物 3。
  4. PLC の反応と手順 4.5 5.3 では蛍光性の検出を実行します。

7. 統計解析

  1. セクション 4 で説明されている混合物を使用して PLC 活性の検出、ホモジネートまたは無料基板から次のように放出される蛍光を引いて PLC と基板との反応から派生した蛍光を計算します。

    フロリダ (PLC 活動) = Fl (反作用の組合せ) - {フロリダ (ctrl 1) + フロリダ州 (ctrl 2)}
    ​
    注: フロリダ (PLC 活動)、フロリダ (反作用の組合せ)、フロリダ (ctrl 1)、フロリダ (ctrl 2) 示す PLC 活動から派生した善意蛍光、蛍光検出反応混合物および制御混合物の 1 と 2、それぞれ。
    1. 4.1 5.3 の手順の説明に従って混合物の蛍光の測定後手順 7.1 の式と、各ホモジネートの技術的な 3 通のフロリダ (PLC 活性) の平均によるとフロリダ (PLC 活性) を計算します。
    2. 7.1.1 の手順で得られた技術的な 3 通の平均 Fl (PLC 活性) を使用して、MBs と他の頭脳領域の生物学的複製の平均 Fl (PLC 活性) を再度計算し、脳組織の間の値を比較します。
  2. セクション 6 で説明されている混合を用いた阻害剤存在下での PLC の活動の検討、ホモジネート、基板、阻害剤の反応から派生して次のように蛍光を計算します。

    フロリダ (PLC 活性阻害剤) = Fl (反作用の組合せ) - {フロリダ (ctrl 1) + フロリダ州 (ctrl 2)} + フロリダ州 (ctrl 3)

    注: ここでは、Fl (PLC 活性阻害剤) はbona fide蛍光 PLC 活性阻害剤存在下での結果です。フロリダ (反作用の組合せ)、フロリダ (ctrl 1)、フロリダ (ctrl 2)、フロリダ (ctrl 3) が制御混合物 1、反応混合物に蛍光信号制御混合物 2、および制御混合物 3、それぞれ。
    1. 6.1 6.4 の手順の説明に従って混合物の蛍光の測定後手順 7.2 の式によるとフロリダ (PLC 活性阻害剤) を計算します。それぞれの磨砕液の技術的な 3 通の平均 Fl (PLC 活性阻害剤) を取得します。
    2. 7.2.1 ステップで計算された平均値を使用して、各脳組織から派生した生物の複製の平均 Fl (PLC 活性阻害剤) を計算します。フロリダ (PLC 活性阻害剤) と各脳組織の 7.1.2 のステップで得られたフロリダ (PLC 活性) を比較します。

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結果

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脳ホモジネート中のタンパク質濃度:
ハチ蜂を使用して乳剤をご用意しました。オリジナル乳剤計算されるタンパク質の濃度は図 3のとおりです。元磨砕液のおおよそのタンパク質の濃度は以下のとおりです。: MBs で 1.5 mg/mL と他の頭脳領域で 2.3 mg/mL。我々 は、ロットごとの 2 つのミツバチを使用し、6 ロットを行った。

脳ホモジネート PLC 活性の検出:
パイロット実験における MBs により他の頭脳領域で高い蛍光を検出しました。したがって、我々 は他の頭脳領域の磨砕液を用いた実験を繰り返し、反応時間 (すなわち、30 分) および蛋白質量 (すなわち、1.3 μ g) を決定します。これらの条件下での反応の結果を

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ディスカッション

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タンパク質の活性の生化学検査が深く重要な酵素の活動は基質と阻害剤などの様々 な分子に影響、一緒に変更できます、したがって、ので、脳内分子シグナリングを理解するため動物の行動 (例えば、学習およびメモリ)5。ミツバチの研究で酵素アデニル酸シクラーゼやリン酸化 CaMKII PKC サイクリック GMP 依存性プロテインキナーゼ サイクリック AMP 依存プロテインキナーゼ A などに基づくさまざまな脳領域に発現するのに報告されます。免疫組織化学5,10,29,30,31。脳地域の中での酵素活性の違いは、唯一の部分的に報告された6ただし、です。ここでは、PLC のアクティビティを検出し、MBs と他の頭脳領...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図 4B - 4 D Suenamiらから変更されました。24生物学オープンの権限を持つ。著者は、アクセス許可のパブリッシャーに感謝しています。この作品は、ショタ Suenami し亮宮崎人間のフロンティア科学プログラム (RGY0077/2016) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227タンパク質濃度測定用試薬キット
Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mLThermoFisher Scientific23209BCAアッセイに使用される標準サンプル
パラフィンワックスGC13B1X00155000141解剖段階として使用される歯科用ワックス
昆虫ピン志賀No. 0ステンレス製ソリッドヘッド
PLCglowKXT BioKCH-0001
384ウェルマイクロプレートCorning4511黒色の低容量丸底プレート
Gemini EMマイクロプレートリーダーMolecular Devices
EdelfosineSanta Cruz Biotechnologysc-201021pan-PLC inhibitor
硫酸ネオマイシンSanta Cruz Biotechnologysc-3573pan-PLC阻害剤
PLC の蛍光基質

参考文献

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