方法論記事

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

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DOI：

10.3791/58216

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2018年9月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

この記事について

サマリー

人間の羊膜と動物モデルにおける組織移植のための準備の上に培養したひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞から成る網膜組織を設計する手法を提案します。

要約

目の病理学の条件をいくつかの機能および/または網膜色素上皮 (RPE) の生存に影響を与えます。網膜色素変性症 (RP) と加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) のいくつかのフォームが含まれます。細胞療法はすでに人間の予備的な結果を奨励することで、これらの病気を治すために提案された最も有望な治療戦略の一つです。ただし、移植片の作製法では、その機能的帰結in vivoが大きな影響を与える。確かに、細胞懸濁液として接ぎ木した網膜色素上皮細胞は同じ細胞網膜組織として移植より機能の低いです。ここで、エンジニア RPE 組織および生体内注入の準備簡単で再現性のある方法をについて説明します。ひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞は、生物学的サポート、ひと羊膜 (ハム) にシードされます。このサポート人工足場と比較して、内在性の網膜色素上皮細胞が接続されている、ブルッフ膜の近くにある基底膜を持っていることの利点があります。しかし、その操作は簡単ではない、適切な養殖のいくつかの戦略とin vivoの移植のための準備を行った。

概要

RPE は、生存と密接に関連付けられて1を光受容体の恒常性に不可欠です。その機能や生存、RP と AMD を含むいくつかの病理学の条件を変更します。

RP は、視細胞や網膜色素上皮細胞または両方2,3の機能に影響を与える継承のイネ突然変異のグループです。特に、網膜色素上皮に影響を与える突然変異細胞 RP2の 5% を占めていると推定されます。AMD は、リードの中心部に最終的に失明、網膜色素上皮層が変更される、別の条件です。AMD は、遺伝・環境要因の複雑な相互作用によって引き起こされ、高齢者4,5,6に影響を与えます。予測によると、AMD は 1 億 9600 万患者 2020年7によって世界の懸念になります。これらの疾患の効果的な治療法が存在しないと死者/機能しない既存 RPE 細胞8を補うために新しい網膜色素上皮細胞の移植は、提案された戦略の一つ。

最高の機能的な結果を確保するために接木される最終製品の定式化のモードが欠かせません。配信、簡単でわかりやすい方法であるにもかかわらず、細胞懸濁液として注入された RPE 細胞の生存、統合、および機能9,10、11,12に関する懸念します。,13。 科学者は今より多くの開発を提供する複雑な製剤設計網膜組織9,13,14,,1516。この文脈では、体外で RPE 移植9使用できる組織を生成する独自の方式を開発しました。

人間の萌芽期の茎 (ES) の細胞由来網膜色素上皮細胞バンクは、このプロトコルで使用されます。ただし、代替 RPE 細胞ソース別のセル(人間誘導された多能性幹細胞、主な網膜色素上皮細胞等)から銀行と別の方法で区別されるこのプロトコルに適しています。分化が含まれているサイトカインおよび/または小さい分子17,18,19,20,21,22を使用してプロトコルします。

移植するのに設計された組織を足場に準備されるべき。過去数年間で異なる足場はポリマーまたは生物学的起源13,23,24行列に基づいて開発されました。生物基質の使用は、ハムが、裸のブルッフ膜のようなその他の基板を実装できます。記載方法は RPE のネイティブ環境に関連する生物学的足場を使用しての利点があります。

ヒト ES 細胞由来網膜色素上皮細胞は、石畳単層として完全に編成するためには、少なくとも 4 週間培養します。その段階で得られる上皮が機能と9を偏光します。最後に、この組織に容易にしわがよったようハイドロゲル キャリア注入のプロシージャの間にそれを保護するためにそれ以上の剛性と弾力性を与えるしの薄い層に埋め込まれています。この製品は、移植まで 4 ° C で保存されます。

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プロトコル

このプロトコルで使用されるすべての人間材料は欧州連合の規則に従って使用され。本研究で使用される人間の ES 細胞株は、ユニークな胚から派生しました。胚を寄付した人カップルは完全に知らされた、匿名の寄付のための同意を与えた。臨床グレード ヒト ES 細胞株だったこの胚由来、バンク、修飾、および適切なロスリン細胞 (イギリス) によって記載されています。ハムは、病院ガイドライン (APHP、Hôpital セントルイス) に従って胎盤寄付のためのインフォームド コンセントを署名した母親の帝王無菌条件下で調達されました。

1. 培地や試薬の調製

  1. RPE 細胞培養培地の調製
    1. RPE 細胞培養培地を準備するには、4% 血清代替品 (500 mL の最終巻の 20 mL)、1,000 倍希釈 2-メルカプトエタノール (500 mL の最終巻の 500 μ L)、および 1 %eagle′s 最小値必要な媒体 (MEM) 非本質的なアミノ酸溶液 (5 mL に最終的なを追加します。500 mL の体積) ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 高グルコース (500 mL の最終巻の 475 mL) に。
  2. 交通機関/保存媒体の作製
    1. 輸送/保存媒体を準備するペニシリン-ストレプトマイシン (500 mL の最終巻の 5 mL) の 1% を CO2に追加-独立した媒体 (500 mL の最終巻、495 mL) 4 ° C で保管してください
  3. サーモライシン酵素の再懸濁
    1. サーモライシンのストック溶液の調製
      1. サーモライシンの貯蔵液の準備、雪解けの-20 ° C、常温で保存されていたサーモライシンの粉を実行します。
      2. 酵素活性は、バッチからの変数をすることができる、使用するバッチのサーモライシン粉末で提供される分析の証明書に基づいてこの活動を計算します。分割、「活動中性プロテアーゼの計算 = ANPC」(分析証明書で示される) 181 (あるチロシンの分子量) によって。得られた結果は、指定したサーモライシン パウダー (U/バイアル) の総酵素活性に対応します。
      3. 200 U/mL の原液を準備するには、200 (U/mL) で割った値総酵素活性 (U/バイアル) に対応する水の量を追加します。
      4. 上下に追加された水をピペットで酵素を溶解します。渦 30 s とチェックのためのソリューション、粉末が完全に中断されてかどうか。詳細ピペッティングによる解散の必要があります。
      5. 因数原液-20 ° C で保存
    2. サーモライシンの実用的なソリューションの準備
      注: サーモライシン ソリューションは、ハムの治療の日に準備されなければなりません。
      1. -20 ° C で保存されている 200 U/ml サーモライシンのストックの因数を解凍します。1 U/mL の最終的な酵素活性を得るためにリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で原液 200 x を希釈します。1-4 ハム パッチを治療するために 40 mL を準備します。
      2. 使用前に、0.2 μ m フィルターを通してサーモライシン ソリューションをフィルター処理します。
  4. ゼラチンの巻き上げ
    1. 20% ゼラチン液とブロックの準備
      注: 20% ゼラチン液とブロックでを使用する前に 1 週間を準備することがあります。
      1. 暖かい CO2-42 ° C (1 h) 最大で 30 分間湯せんする独立した媒体。50 mL のチューブで 40 mL にゼラチン 10 g ウォーム CO2を追加-独立した媒体と渦ソリューション。
      2. 42 ° c. で 30-60 分のゼラチンを溶かす渦ソリューションを均質化する各 10 分。
      3. ソリューションが均一と、4 つの 6 cm の培養皿に 20% のゼラチン溶液 4 mL を追加します。泡を避けるため。料理を守るプラスチック パラフィン フィルムを追加し、4 ° C で凝固するソリューション
    2. 8% ゼラチン溶液の調製
      注: 8% ゼラチン溶液が準備使用前に、の日と 4 ° C で保存
      1. 暖かい CO2-42 ° C (1 h) 最大 30 分まで独立した媒体。50 mL のチューブで 46 ml ゼラチン 4 g 暖めて CO2を追加-独立した媒体と渦ソリューション。
      2. 42 ° c. で 30-60 分のゼラチンを溶かす管を保護し、同じ日に使用する場合は、37 ° C で水のお風呂でそれを維持するプラスチック パラフィン フィルムを追加または後で使用する場合、4 ° C で保存します。

2. 人間の羊膜のサーモライシン治療

  1. ひと羊膜洗浄
    1. ハムの小さな断片 (約 30 mm × 30 mm) ナイロンの足場は、PBS で 4 ° C で既にいずれかの固定、または冷凍として供給があります。場合は 37 ° c 30 分のインキュベーターで膜を融解、凍結します。
    2. 膜を洗浄します。
      1. 80 mL の PBS を含む 250 mL ボトルに 1-4 膜を配置します。必要に応じてできるだけ多くのボトルを使用します。
      2. 5 分間高速でプレート シェーカーの各ボトルを振るし、PBS を破棄します。80 mL の PBS の繰り返しを追加します。
  2. サーモライシン治療
    1. サーモライシン (1 U/mL) 膜を含むボトルあたりの作業液の 40 ミリリットルを追加 (ボトルあたり 1-4 膜では一度に最大 3 本)。
    2. 5 分で 450 rpm と、渦のボトルを振る 30 を s. を繰り返して 1 倍。
    3. サーモライシン液を捨て、80 mL の PBS を追加します。
    4. 450 rpm で 5 分間ボトルを振る。PBS を破棄し、80 mL の PBS を追加します。3 倍を繰り返します。

3. 文化挿入時の人間の羊膜の固定

  1. ハムの 1 つずつを削除する (つまり、瓶の底に達することができる) 長い滅菌の鉗子を使用し、各ハムを 10 mL の PBS を含む 10 cm 培養皿に転送します。
  2. 10 mL の PBS を含む新しい 10 cm 培養皿で下向きナイロン膜の 1 つを配置します。2 つのナイロン膜を修正するために使用する 4 つのクリップをデタッチします。
  3. ナイロンと膜間文化挿入の小さいリングを挿入します。
  4. 膜が小さいリングを完全にカバーすることを確認します。膜の上に文化の挿入の 2 番目の部分をクリップします。ハムの基底膜は、文化挿入中直面しています。最後の 2 つのクリップを外します。
  5. 必要に応じて文化挿入外膜の過剰滅菌はさみでカットします。PBS を追加 12 ウェル プレートに文化挿入固定膜鉗子を使用して、転送し、37 ° C、5% CO2でインキュベーターでプレートを格納します。
  6. その他の膜 (ステップ 3.2 から 3.5) からこれらの操作を繰り返します。

4. 解凍と人間の羊膜の網膜色素上皮細胞の播種

  1. 網膜色素上皮細胞の融解
    1. RPE 細胞バンクは、液体窒素の極低温バイアルあたり 100 万セルに固定されます。必要に応じてできるだけ多くセラム チューブを解凍 (350,000 の細胞は膜ごとシード)。
    2. 極低温バイアルあたり RPE 培地 3 mL を含む 15 mL チューブを準備します。バイアルは解凍後、各チューブにセルを転送します。その他のバイアルに、この操作を繰り返します。
    3. 均質化 (上下に数回をピペット RPE 培地で細胞を再懸濁します) 細胞液の 10 μ L を取るし、1.5 mL チューブに転送。トリパン ブルーの 10 μ L を追加します。カウント室でこのソリューションの場所 15 μ L は、4 X 目的と顕微鏡下で実行可能なセル (青色で着色) の数をカウントします。その他のバイアルに、この操作を繰り返します。
    4. 一方で、110 x gで 5 分間破棄で 15 mL チューブに上清を遠心分離機し、700,000 細胞/ml で細胞を再懸濁します。
  2. 人間の羊膜に網膜色素上皮細胞の播種
    1. インキュベーターから膜を含む 12 ウェル プレートを取り外します。
    2. PBS を吸い出しなさい。4.1.4 文化挿入部で準備した細胞懸濁液 500 μ L を追加します。(よく) 内文化挿入外 RPE 媒体の 1 mL を追加します。その他の膜を繰り返します。
    3. インキュベーター内膜を含む 12 ウェル プレートを配置します。

5 人の羊膜の網膜色素上皮細胞培養のメンテナンス

  1. 更新中 2 週では、通常の月曜日と金曜日、まで、少なくとも x 文化の 30 日。
  2. 各ウェルの文化挿入外媒体を吸引し、新鮮な媒体 (文化挿入外 1 mL と 500 μ L 中) を更新します。37 ° C、5% CO2でインキュベーターでプレートを配置します。

6. 網膜色素上皮のパッチの移植のための準備

注: から始まる文化の 30 日、ティッシュは移植の準備ができて。

  1. 温かみのある 37 ° C で 30 分間の水のお風呂で 8% ゼラチン溶液チャンバー内部冷たい CO2と vibratome の-(4 ° C) で独立した媒体。
  2. Vibratome に 20% のゼラチンのブロックを配置します。
    1. 冷蔵庫から 20% のゼラチンのブロックを含む 6 cm 培養皿を取る。メスを使用すると、5 cm × 5 cm のブロックをカットします。シアノアクリ レート接着剤または同等のものをサポートするブロックの上面に貼り付けます。
    2. Vibratome に新しいブレードを配置します。
    3. かみそりの刃の同じレベルになるまでは、ブロックのレベルを調整します。
    4. サポートのまわりの浴室を詰めて新鮮な CO2-4 ° C で独立した媒体中程度の速度を使用してブロックを均一にカットまで、滑らかな表面につながる vibratome でブロックをカットします。0 の位置を設定します。
    5. それが完全に乾くまで、ゼラチンのブロックの周り中を吸引し、37 ° C の定温器からの組織を含む 12 ウェル培養プレート
    6. 鉗子を使用して、慎重にゼラチンのブロックの上に文化挿入を開きます。(細胞が培養されないリング) の外部のセルを含まない膜のすべての部分をはさみでカットします。全体の残留培地を吸引します。
    7. 37 ° C で膜をカバーするために 8% のゼラチン溶液の 1 mL を追加します。過剰に慎重に取り外します。5-8 分を固めるためのゼラチンを許可するを待ちます。
    8. 新鮮な CO2を追加-膜が覆われるまでお風呂に (4 ° C) 培地で独立しました。
    9. ブロックの動作の認識の残り、中速度-100 μ m の位置にある vibratome でカットします。セクションの終わりには、組織の方向を維持するために気をつけてください。
    10. メス、セクションの方向を識別するためにコーナーをカットします。
    11. ヘラでゼラチンに埋め込まれた膜を収集し、受信者の目に移植まで 4 ° C で保存媒体でいっぱい 6 ウェル プレートに配置します。
    12. 移植の時に、(1-3 のラット、ヒト以外の霊長類の約 10-15 mm2 ) 手術顕微鏡下で受信者の目のサイズにインプラントのサイズを調整します。

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結果

ハムには、網膜色素上皮細胞の播種する前に削除する必要があります上皮の層が含まれています。揺れ下サーモライシンと膜の酵素処理が実行されます。順番は (1 つの側面は上皮) 膜の極性を失う、それは組成物は、(図 1 a) プロバイダーによって異なる場合がありますサポートに固定されています。この段階でサポートする膜の密着性の確認、必要に応じてクリップを追加します。カルチャー ・ インサートの固定時に、膜に穴を避けるために慎重に作業し、(図 1 b) を直面している基底膜とその極性を維持します。細胞膜にシードされ、彼らはこれらの穴から脱出できるし、最終的な細胞濃度が低減されます。顕微鏡の下でまたは PBS が漏れているかどうかチェックを文化挿入中 PBS を追加して、穴の存在を視覚化できます。穴を持つ任意の膜を破棄する必要があります。

文化挿...

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ディスカッション

生物学的足場とその動物モデルにおける着床に備えて網膜色素上皮細胞の培養方法について述べる。プロトコルの重要な手順の 1 つは、ゼラチンに包含まで手順に沿ってハム向きのメンテナンスです。確かに、膜のネイティブの上皮が削除され、その基底膜露出9になります。網膜色素上皮細胞は、この基底膜の上にシードする必要があります。ゼラチンを埋め込むため作成時に定義された温度ですべての製品で作業することが重要です。確かに、ゼラチンは 4 ° C で液体ボディ温度 (37 ° C)9剛体するプロパティを持ちます。温度は使用されず、ゼラチンは固めるか、この効果が必要でない段階で液化します。

デスメ膜25またはハム26のようないくつかの生物学的足場が提案されている.特に、ハム、帝王切開で27日から示した網膜下のスペースによく容認する限られた炎症を引き起こすと脈絡膜血管新生...

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開示事項

オリビエ Goureau 保留中のひと多能性幹細胞からの網膜細胞の生成に関連する特許発明者は。他の作家が何を開示するあります。

謝辞

著者は、ここで説明する方法の設定の間に彼らの入力についてジェローム ・ Larghero と Valérie Vanneaux (Hôpital サン ルイ, パリ, フランス) を感謝したいです。

この作品は、ANR からの補助金によって支えられた [GPiPS: ANR-2010-RFCS005;SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02]、財団注ぐラ凝った Médicale [バイオ工学プログラム - DBS20140930777] LABEX オリビエ Goureau、クリステル Monville [ANR 10 LABX 73] を復活させるから。NeurATRIS、トランスレーショナルリサーチ インフラストラクチャ (Investissements d'Avenir) [ANR-11-INBS-0011] 神経科学、INGESTEM、国家インフラ (Investissements d'Avenir) biotherapies の多能性のエンジニア リングに支えられ、幹細胞分化 [ANR-11-INBS-000] クリステル Monville します。カリム ベン M'Barek は、DIM Stempole と LABEX 復活 [ANR 10 LABX 73] から奨学金によって支えられました。幹 Biotherapies 協会フランセーズ contre レ Myopathies (AFM) でサポートされているまれな疾患研究所の一部である-Téléthon。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
滅菌バイオセーフティキャビネットTechGen International適用
吸引用液体廃棄物処理システムVacuubrandBVC 21
CO2-controlled +37 °C細胞培養器サーモエレクトロン社BVC 21 NT
200 &マイクロ;Lピペット:P200ギルソンF144565
1 mLピペット:P1000Gilson F144566
Pipet aidDrummond75001
+4 °C 冷蔵庫リープヘル該当なし
ビブラートライカVT1000S
細ハサミWPI501758
鉗子 (x2)WPI555227F
ウォーターバスグラント サブアクア プロSUB6
精密天秤ザルトリウスCP225D
遠心分離機エッペンドルフ5804
顕微鏡オリンパスSC30
水平ロッキングシェーカーIKA-WERKEIKA MTS 214D
ボルテックスVWRラボダンサーS40
メスWPI500351
プラスチックパラフィンフィルムVWRPM992
0.200 & マイクロ;m シングルユースシリンジフィルターSARTORIUS16532
針なしシリンジ 50 mLDutscher50012
ボトル 250 mLDutscher28024
15 mL 滅菌ファルコンチューブダッチャー352097
50 mL 滅菌ファルコンチューブダッチャー352098
培養インサートScaffdexC00001N
60 mm細胞培養製品: B6Dutscher353004
12ウェル細胞培養プレートCorning3512
6ウェル培養プレートCorning3506
カミソリ刃Ted Pella, Inc121-9
シアノアクリレート接着剤Castorama3178040670105
PBS 1x (500 mL)SigmaD8537
ThermolysineRoche5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-メルカプトエタノール (50 mM)Invitrogen31350-010
ペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogen15140122
CO2-independent mediumGIBCO18045-054
ゼラチンMERCK104078
human amniotic membraneTissue bank St Louis hospital (Paris, France)該当なし
されない使い捨て

参考文献

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