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方法論記事

オープン パッチ ・ クランプのピペットで非撹拌の境界層におけるイオン濃度の測定: 流体によるイオン チャネルの制御の流れ

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DOI：

10.3791/58228

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2019年1月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, KU Open Innovation Center, Research Institute of Medical Science, Konkuk University School of Medicine, 2Department of Emergency Medical Services, Eulji University, 3Department of Mechanical Engineering, Sungkyunkwan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

機械刺激感受性イオン チャネルは、パッチク ランプ記録を持つ流体の流れ/せん断力感度の面でよく勉強しました。ただし、実験的プロトコルによってイオン チャネルの流体フロー規則に結果は、誤ったことができます。ここでは、防止および理論的根拠とそのようなエラーを修正するためのメソッドを提供します。

要約

流体の流れは、流体の流れによる血管拡張など、多くの生理学的および病理学的プロセスを制御する重要な環境刺激です。流体の流れ/せん断力に対する生体の応答の分子メカニズムは完全に理解されていないがイオン チャネルのゲートの流体フロー パミン批判的に貢献するかもしれない。したがって、せん断流力感受性イオン チャネルのパッチ ・ クランプの技術を使用して研究されています。しかし、実験的プロトコルによって結果とデータの解釈することができます誤った。ここで、流体の流れに関連するエラーの実験的・理論的な証拠は提示、見積もり、防止、およびこれらのエラーを修正するためのメソッドを提供します。銀/塩化銀参照電極と入浴液間電位の変化は 3 M KCl。 流れがいっぱい開いているピペットを用いて測定したし、液体/金属接合の約 7 に潜在的な mV をシフトします。逆に、流体の流れによる電圧変化を測定することにより非撹拌の境界層内のイオン濃度を推定しました。静的な状態で細胞膜表面での銀/塩化銀参照電極またはイオン ・ チャネル入口に隣接して実際のイオン濃度は低流動状態での約 30% を達することができます。3 M、アガロースを配置する入浴液と参照電極間の KCl ブリッジ防げた可能性がありますこのジャンクションの潜在的なシフトの問題。ただし、細胞膜表面に隣接する非撹拌レイヤー効果は、この方法で固定ないできませんでした。ここでは、イオン電流の流体流動誘起制御を勉強しながら agarose の塩橋を使用しての重要性を強調してオープン パッチ ・ クランプ ピペットと非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法を提供します。したがって、非撹拌の境界層中のイオンの実際の濃度を考慮すると、この新規のアプローチ可能性があります実験デザインとデータ解釈イオン チャネルの流体のせん断応力規制に関連有用な洞察力を提供.

概要

液体の流れが流体の流れによる血管拡張や流体せん断力依存血管リモデリングと開発1,2など多くの生理学的および病理学的プロセスを制御する重要な環境のキュー 3,4,5。流体せん断力に対する生体の応答の分子メカニズムは完全に理解されていないが、イオン チャネルの開閉の流体の流れを介した制御流体流れによる応答5に批判的に貢献するかもしれないといわれています。,6,7,8しますたとえば、内皮の内側整流器 Kir2.1 と Ca2 +の活性化-活性化 K+ (KCa2.3、KCNN3) チャンネルは流体に貢献する流動による Ca2 +流入が示唆されている後。血管拡張の流動誘起6,7,8。したがって、多くのイオン チャネル、特に機械的に活性化または抑制のチャンネルは、パッチ ・ クランプの技術6,9,10と流体の流れ/せん断力感度の面で研究されています。,11します。 ただし、パッチ ・ クランプ記録中に行った実験的プロトコルによって成果とイオン チャネルの流体フロー規制に関するデータの解釈、誤った10,11。

パッチ ・ クランプ記録における流体流動誘起成果物の 1 つのソースは、浴液と銀/塩化銀参照電極11と潜在的な接合からです。液体/金属接合部入浴液と銀/塩化銀電極の電位は一定である入浴液の Cl-濃度が一定として入浴ソリューション間の化学反応を考慮したを一般的に考えられています。する銀/塩化銀電極:

Ag + Cl-↔ AgCl + 電子 (e-) (式 1)

ただし、入浴ソリューションと銀/塩化銀参照電極 (式 1) の全体的な電気化学的反応が左から右に進行する場合、銀/塩化銀に隣接する入浴液の Cl-濃度を参照します。電極 (非撹拌境界層12,13,14,15) は、十分な対流輸送を確保しない限り、ソリューションを入浴の大部分よりもはるかに低い可能性があります。Ag の不十分な塩素処理と古いまたは非理想的な銀/塩化銀電極を用いるそのようなリスクを高める可能性があります。参照電極、実際には、この流体フロー関連のアーティファクトは、入浴液と参照間の従来の agarose 塩橋を単に置くことによって除くことができる電極、アーティファクトが実際 Cl-の変化に基づいているので濃度は銀/塩化銀電極11に隣接します。本研究で提示されたプロトコルでは、ジャンクションのフロー関連の潜在的な変更を防ぐため、非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法について説明します。

入浴液と銀/塩化銀参照電極の KCl の架け橋、アガロースを配置した後に考慮すべきもう一つの重要な要因がある: Cl-電極のようにちょうど参照として銀/塩化銀電極機能、イオン チャネルにも機能することができますようイオン選択的な電極。入浴液と銀/塩化銀参照電極との間の非撹拌の境界層の状況は、膜イオン チャネルを介して細胞外および細胞内のソリューションのイオンの動きの間に発生します。これは、流体の流れによってチャンネルはイオンの規制を解釈するときに注意を使用することを意味します。電気化学的勾配が存在する溶液中のイオンの動きによって3 つの異なるメカニズムが発生する可能性が私たちの以前の研究11で説明するよう: 拡散、移行、および対流、拡散の動きです濃度勾配による、移行が電気的勾配によって駆動される動きと対流は流体での動き。これらの 3 つのトランスポート メカニズムの中では、対流モードは、イオン11 (> 1,000 回以上拡散または通常のパッチ ・ クランプの設定の下で移行) の動きにほとんどを貢献しています。これはなぜ入浴液と銀/塩化銀参照電極間電位は非常に異なる静的および流体条件11の下ですることができますの理論の基礎を形作る。

上記仮説に従ってイオン チャネル電流の流れのいくつかの手掛かり効果は実質イオン濃度膜表面 (非撹拌境界層) でチャネルの入口に隣接する対流の復元から推論する可能性があります10です。 この場合、イオン チャネル電流の流体流動誘起効果は単にイオン チャネルの開閉の制御からの電気化学的イベントから生じています。同様のアイデアは以前バリーと同僚12,13,14,15に基づいて厳密な理論的考察と実験的証拠、非撹拌層として知られているが示唆されたか数の影響を運ぶ。単一チャネルのコンダクタンスと十分な輸送料金 (非撹拌膜表面でよりも膜の高速輸送率)、チャネルを通じて境界層効果を提供するために十分な長さのオープン時間が生じることがありますいくつかのイオン チャネルがある十分な場合.対流に依存したトランスポートはイオン現在10,12,13,14,15の最終的な流体流動誘起昔話に貢献することができます。

本研究で我々 は寒天やアガロースを使用しての重要性を強調するイオン電流の流体流動誘起規制を勉強しながら塩橋。我々 はまた銀/塩化銀参照電極と膜イオン チャネルに隣接する非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法を提供します。さらに、イオン チャネル電流 (すなわち、対流仮説または非撹拌層トランスポート数の影響) の流体流動誘起変調の理論的解釈は、設計との研究の解釈のための貴重な洞察力を提供できます。イオン チャネルのせん断の力規制。非撹拌境界層トランスポート数効果によると場合膜イオン チャネルのすべての種類を介してイオン チャネル電流が流体、流体せん断力にだけ、彼らの生物学的感性の独立によって促進されることができることを予測します。イオン チャネルがある十分な単一チャネルのコンダクタンスと長いオープン タイム。高いイオン チャネル電流密度は、細胞膜表面の境界層の非撹拌効果を高める可能性があります。

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プロトコル

建国大学制度のガイドラインに従ってすべての実験を行った。

1. Agarose 塩橋バス ソリューションと銀/塩化銀参照電極との間

注: Agarose 3 M KCl 塩橋が以前に生成される説明12マイナーなバリエーションを持つ。

  1. 橋の形成
    1. 適切な U 字型を形成する火ガラス毛管管を曲げます。毛細血管の内径は、大型イオン電流を記録するときに直列抵抗を減らすために十分な大きさにする必要があります。2-5 mm の内径の管が通常は許容です。
  2. アガロース 3 M KCl 溶液の調製
    1. 3 M KCl 溶液 100 mL を準備 (1 M または 2 M、許容)。
    2. 寒天 3 g の重量を量る。
    3. 90 ~ 100 ° C のホット プレートに KCl (すなわち3% の agarose) の 100 mL のアガロースを解散します。
  3. 3 M の KCl の agarose が付いて橋の読み込み
    1. 容易なロード agarose KCl 溶液中 U 字型ガラス橋を浸します。
      注: agarose KCl ソリューションが浅いと広範なコンテナーに含まれる場合、ガラスの橋を掘る簡単です。
    2. 室温を設定し、強化する agarose (RT) で一晩おきます。
    3. セット/硬化 agarose 塩からガラスの agarose KCl ロード橋を慎重に掘る。
  4. 橋を保存します。
    1. 十分なボリュームを準備 (すなわち、 500 mL) 首の全体のボトルの 3 M KCl 溶液。
    2. 冷蔵庫にボトルに準備されたアガロース塩橋を格納します。

2. 流体せん断力のパッチ用のチャンバーで電池への応用

注: パッチ ・ クランプの実験の設定の概略図は、図 1に示すです。

  1. コンテナーが入浴ソリューション搭載場所 (ボリュームと高さには測定する必要があります既に) 上記のパッチ ・ クランプの商工会議所。
  2. パッチ ・ クランプをチャンバーに入浴ソリューションとチューブを吸引によって。
  3. 流体の流れを停止するには、流体の流れをブロックするコンテナーの側にチューブをクリップし、同時に吸引を停止する吸込側にチューブをクリップします。これは、「定常」コントロールの条件です。
  4. 流体せん断力を適用するには、同時にコンテナーと吸引側両方のチューブを開きます。
  5. 前に、または流体せん断力をセルに適用した後、mL/分の流量を測定します。
  6. 与えられた時間をかけて体液量の減少を測定することにより流量を算出します。
  7. 測定流量から入浴室のジオメトリ (構造)、(議論のセクションを参照してください) 流体の流れによってセルに適用するせん断力を見積もる必要があります。
  8. また、(手順 2.3 2.6) の流量を制御するためには、灌流ポンプを使用します。この場合、拍動流ではなく、定数を確保するように注意します。

3. バス ソリューションと銀/塩化銀参照電極 (図 3 a) 流動による液体金属接合部電位の変化を測定

  1. 銀/塩化銀電極または agarose の塩橋なし、既製の製品から利用可能なペレットを使用します。
  2. 生理的塩食塩を入浴室 (例えば、143 mM の NaCl、KCl、5.4 mM 0.33 mM NaH2PO4、5 mM HEPES、0.5 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、11 mM D-グルコース; NaOH で 7.4 に調整 pH) に備えます。
  3. パッチ ピペット ピペットと入浴ソリューションとのジャンクションの潜在的なシフトを最小限に抑えるためチャンバー内 3 M KCl 溶液を配置します。
  4. 現在のクランプにクランプ電圧増幅器を修正 (「私 = 0"または"CC")。
  5. 初期オフセット電位をヌル後様々 な流量による電圧の変化を測定します。
  6. 電圧の変化が液体/金属接合電位であることを確認、再流動のバス ソリューションと銀/塩化銀電極間 agarose 塩ブリッジを使用して接合部電位に及ぼす影響を調べる。

4. 銀/塩化銀電極 (図 3 b) 静的な条件の下に隣接する非撹拌層で実際 Cl-濃度の検討

  1. ステップ 3 の結果から接合の可能性 - 流量関係を描画して、ジャンクション スープラ流体流量による潜在的なシフトの (飽和) 最大値を推定します。
  2. Cl の様々 な濃度のソリューションを準備(すなわち、 50、99、147、195、NaCl の 288 mM)。
  3. Cl-入浴液中濃度を変更することによって接合の可能性-[Cl-] 関係を描きます。流体の速度定数と十分に高いする必要があることに注意してください (> 30 mL/分) 隣接する銀/塩化銀参照電極の Cl-濃度の低下を防ぐために。
  4. 2 つの関係曲線から測定されたジャンクションの潜在的なシフトから Cl-濃度の変化を推定します。

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結果

全セル電圧依存性 L 型 Ca2 +チャネル (VDCCL) 電流、酵素によって分散したラット腸間膜動脈平滑筋細胞、前述11として記録されました。動脈平滑筋細胞されたナイスタチン穿孔の構成で Cs の豊富なピペット液 VDCCL11,16によって電流の流れを容易にする二価陽イオン無料入浴の透析。脱分極電圧ランプまたは-70 の持株電位の電圧ステップを簡単な mV、VDCCL電流を引き出すために適用されました。代表的な電流-電圧 (私V) VDCCL不在そして、アガロース KCl 橋と記録 (5 mL/分または約 0.004 m/s)、流体の流れの存在の関係は図 2 aに示すように。流体の流れわずか電圧に依存しない方法で現在 ...

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ディスカッション

本研究で行った高 KCl でいっぱいオープン パッチ ・ クランプ ピペットと液体金属の接合部の電位を決定することにより銀/塩化銀参照電極に隣接する非撹拌層で実際の Cl-濃度を測定する方法濃度。静的から流体条件に切り替えるとき、境界層における Cl-濃度の変化は接合部電位のシフトにつながります。単に参照電極と入浴液の KCl の架け橋、agarose を使用してはパッチ ・ クランプ記録中に Cl-濃度に関連するエラーまたは成果物を防ぐことができます。

寒天やアガロース塩橋の重要性を強調して、他非撹拌の境界層における実際のイオン濃度でこのメソッドの別のアプリケーションは次のとおりです。原形質膜のイオン チャネルが非撹拌の境界で本物のイオン濃度 (ちょうどとして銀/塩化銀電極機能 Cl-電極のような)、イオン選択性電極として機能することができるため層細胞膜チャネルの入口に隣接します。表面は、バルク液体の平均濃度から異なることがあります。この違い、バルクのイオン濃度の流体と非撹拌層細胞膜に隣接する...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、研究財団韓国国立科学省 ICT によって資金を供給を通じて基本的な科学研究プログラム (2015R1C1A1A02036887、NRF 2016R1A2B4014795) パイオニア研究センター プログラム (2011 0027921)、によって支えられて・将来計画、韓国健康技術 R & D プロジェクト韓国健康産業開発研究所 (KHIDI) からの助成金によって韓国共和国 (HI15C1540) 福祉厚生省によって資金を供給し、。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RC-11オープンバスチャンバーワーナーインスツルメンツ、アメリカW4 64-0307
Ag/AgCl電極ペレットワールドプレシジョンインスツルメンツ、アメリカEP1
ガロースシグマアルドリッチ、アメリカA9793
クランプアンプHEKA、ドイツEPC8
電圧クランプアンプレキュラーデバイス、アメリカAxopatch 200B
液体ポンプKNF Flodos、スイスFEM08
ア電圧モ

参考文献

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