プロトコルの目的は、レーザー マウス眼房内で胸腺のインプラントで顕微鏡による胸腺細胞の縦の生体リアルタイム追跡を示すことです。角膜の透明性と血管新生血管前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口を継続的に記録が可能です。
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この記事について
サマリー
要約
提示されているメソッドの目的は、最初の時間のため、新生児 thymi生体内で縦のリアルタイム モニタ リング、血管内 thymocytes´ ダイナミクスの同質の成体マウスの前眼房への移植を表示するは胸腺のセグメント。次の移植、レーザー顕微鏡 (LSM) 角膜は、携帯電話の解像度レベルでの繰り返し非侵襲的イメージング体内をことができます。重要なは、アプローチに追加しますイメージング モデル以前の生体の T 細胞の成熟に連続前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口の録音の可能性同じ動物。システムの付加的な利点は、移植組織の巨視的急速な監視を許可する接木部透明性と全身トリートメントに加え、インプラントへのアクセシビリティがローカライズされました。組織のボリュームをされている主な制限するは葉のトリミングを要求する目の商工会議所の省スペースに収まります。オルガンの整合性は、成熟した T 細胞の生産で機能する以前にパターンで胸腺ローブを解剖によって最大化されます。技術は可能性のある自己免疫疾患、免疫不全、中枢性トレランス; を含む胸腺機能に関連する医学的に関連の質問の環境調査に適していますプロセス定義が不十分な機械論的に残っています。胸腺細胞の移動、分化と選択を導くメカニズムの細かい解剖は、新規治療戦略開発 T 細胞をターゲットにつながるはずです。
概要
胸腺内 T 細胞分化と T 細胞亜集団の選択は、開発と脊椎動物1の細胞性免疫能の維持のため重要なプロセスを構成します。このプロセスは、複雑な一連の血流や細胞増殖の移行から前駆細胞の募集、サブセットの大規模なプログラム細胞死および膜タンパク質の発現を含むしっかりと組織のイベント選択します。結果は最小化された自己のペプチッド、レスポンスを表示しながら、成熟 T 細胞に外国の抗原の広いスペクトル反応のリリースを最後まで個々2,3の末梢リンパ器官を植民地化します。ΑβTCR レパートリーの迷入胸腺選択は、自己免疫疾患や免疫のアンバランス4主に正または負の前駆体選択の過程それぞれ欠陥から派生したに します。
胸腺で胸腺細胞の方向性の移行は T 細胞の成熟のすべての段階に組み込み、ケモカイン、接着剤を含む複数の刺激、同時またはシーケンシャルのシリーズとして構想・解消接着細胞外マトリックス (ECM)蛋白質の相互作用の3、5。固定組織の研究が表示される定義された胸腺微小5,6、渡り鳥のキューの胸腺細胞の表現のパターンに関する重要な情報ex vivoの研究は 2 つを明らかにした流行胸腺細胞器官の 2 つの組織の領域の移住性の動作: 遅い確率的な運動皮質と髄質7,8,9,10高速、限られた運動,11,12,13。 胸腺の肯定的な選択13と渡り鳥の増加率の相関と負の淘汰は胸腺旅の速度が適切なを決定すること仮説を支えるクロールの動作に関連付けられています。胸腺細胞の成熟。その妥当性にもかかわらず胸腺間質細胞の相互作用のトポロジおよび T 細胞の成熟に伴う臓器微小で胸腺細胞運動のダイナミクスは不明確なままです。
ほとんどは、前のヴィヴォの日付に対して研究胎児または胸腺器官培養14,15、切片または胸腺細胞の動きが 2 光子レーザーのスキャンによって可視化してそのまま胸腺葉外植片を再集約顕微鏡 (TPLSM)8、制限最大作動距離および組織に従い 1 mm の深さのイメージングと生体イメージング技術は、16を検討しました。胸腺スライス技術と特定のサブセットのままの胸腺葉アプローチ許可制御導入の両方であらかじめラベル 3 D 構造を形成する長期の潜伏時間に依存する骨の折れる胸腺器官培養と対照をなしてネイティブの組織アーキテクチャ環境に胸腺細胞。ただし、血流があるので欠席これらのモデルで胸腺胸腺実質または成熟 T 細胞の胸腺の egression のダイナ ミックス (Tsp) 前駆細胞をセトリングの採用プロセスを研究するため明確に限定されます。
In vivoモデル マウスにおける胸腺 T 細胞の成熟の生理学の研究のためには、全体の器官葉腎カプセル17または掻き18内に配置またはフラグメントの移植が含まれます。動物の奥深くまたは不透明な組織の層で覆われている胸腺移植片の位置が体内でインプラントの検査のための使用を制限がこれらのオプションは、組織の機能生着全身を尋問する彼らの有用性を示したTPLSM。
目の前房は角膜のレイヤーの透明度のおかげで、移植組織の直接監視の簡単にアクセスできるスペースを提供します。利点の虹彩によって形成されたチャンバのベースは血管や自律神経終末、急激な血行再建術と移植19,20の神経再生を有効にするが豊富です。博士カイセードがメンテナンスおよび過去21膵島の縦断的研究のためこの解剖学的領域を使用して正常に。ここで、紹介はこの戦略だけでなくネイティブ器官の構造内の胸腺細胞のダイナミクスを研究するための有効なアプローチを構成するも一意に前駆募集の研究に縦の録音は、生体内で拡張することができますが、マウス成熟 T 細胞 egression の手順。
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プロトコル
機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、マイアミ大学の IACUC ガイドラインに従ってすべての実験を承認しました。
1. 分離と新生児 Thymi のトリミング
- すべての試薬・ オートクレーブまたは滅菌条件の確保、その他の方法で機器を準備します。
- 、汚染を最小限に抑えるには、層流フードの下ですべての手術を実行します。
- ドナー マウスを安楽死させる前に滅菌の prechilled 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) x で 60 mm 滅菌皿を埋める、氷の上に置きます。それは、洗浄し、移植前にドナーから摘出した thymi を格納する使用されます。
- 倫理的なガイドラインに従い、斬首で新生児ドナー マウスを安楽死させるのに進んでください。
- 背直立位置とスプレーで無菌の吸収紙タオルの上にマウスを置くし、後で拭く、70% エタノールでマウスの腹部。
- 下腹部のレベルで表面的な V 字切開することによって胸腔内を公開解剖はさみ次の約 0.5-1 の開口部を残して腹側正中線ストレート 10 cm のペアで皮膚をカットして cm 胸のレベルで。胸腔内を公開する胸の各側面上の皮膚を折る。
- 横隔膜と前方の胸腔内で上縦隔にアクセスするはさみの同じタイプの胸部を作る 2 つの深い 0.5-1 cm 横切開します。胸腺は、中心部のすぐ上の 2 つの薄い葉として表示されます。
- 胸腺と完全な臓器を抽出するために垂直方向にプルの下にカーブタイプ鉗子のセットを配置します。鉗子のペアで胸部のフォールドを防止します。必要な場合は、慎重に、臓器を抽出する前にカプセルを中断することがなく臓器を囲む結合組織をバラバラにする微細鉗子を使用します。
注: この手順は、切り裂くスコープの使用によって促進されます。 - 冷滅菌 1 × PBS (pH 7.4) 以前 60 mm 滅菌皿に表示され、メスと結合の地峡をカット胸腺ローブを区切るために孤立した胸腺が水没します。お皿からカプセルを損なうことがなく任意の残骸を削除します。Thymi が公開される時間を最小限に抑えるためにインプラントの前にタイムの葉をトリミングします。
注: 両方の目にインプラントを受け取るとき、それぞれ孤立した新生児胸腺は最大 3 つのホスト マウス幅約 1 mm の六つのセグメントをレンダリング通常されます。 - 各ドナー マウス手順 1.4 1.9 を繰り返します。Thymi が公開される時間を最小限に抑えるため、一度に 1 つの胸腺を分離します。
2. 胸腺目の前房内注入
- 移植前にタグし、各受信者のマウスの重量を量る。
- 受信者のマウスを麻酔する isofluorane 蒸気の 1-2% 間の用量を使用します。手術の手順を開始する前に次のつま先ピンチを反射の不在によって適切な anesthetization を確認します。
- 胸腺のセグメントの移植と手順に従います。
- その 1 つ目が向いているので、切り裂くスコープのレンズに直接さらされるよう側側臥位でマウスを配置します。
- 消費税冷 1x PBS (pH 7.4) で横になっている孤立した胸腺ローブの 1 つ-の部分にインプラントの最大 1 mm 幅で 60 mm ディッシュをいっぱい。胸腺皮質と髄質が各セグメントに含まれていることを確保するためジグザグ パターンに従います。図 1 aに示したガイドラインによるとトリミングの vannas はさみを使用します。
注: 胸腺のトリミングは、組織の生着を最適化するためにインプラントの前にされるべきであります。 - 外科領域に対応する角膜のベースから、解剖はさみの先端を導入することができますように、外部角膜層に小さな切開を作成する 40 mm G18 針のヒントをご紹介します。
- 再シールしないようにしっかりと角膜の開口部を押しながら vannas はさみを使って角膜のベースの周りに直接切開の側面 5 〜 10 ミリメートルを作る。フラット端が鉗子を使用して、組織の損傷を避けるために。
- カットの角膜上皮を把握し、胸腺セグメント開口部を押しながらフラット エンド鉗子のペアで角膜を保持することによって開口部を公開します。操作が完了するまで組織の乾燥を防ぐために必要に応じて滅菌 1 × PBS (pH 7.4) または人工涙液で目を濡れています。
- Eye´s 関数を維持するために生徒に対して横方向位置に導入された組織のセグメントをスライドに眼の表面に軽く押します。移植がいじめによるイメージングと後部の干渉を防ぐために開く目と反対の位置にあることを確認します。
- フラット鉗子の援助を押してしっかりとの約 3-5 秒、お互い自己シールを促進するために角膜の開口部の 2 つの側面。手術では、すべてのステープル処理や縫製は必要ありません。
- 両方の目に、移植を行う場合は、直接手順 2.3.2-2.3.7 を繰り返す解剖顕微鏡のレンズに 2 番目の目を公開し反対側をマウスを裏返します。
- 手術が完了した後は、熱ランプを prewarmed 空ケージにマウスを返します。
- その各移植マウスは他の動物と共有ケージにそれを配置する前に完全なモビリティと意識を取り戻すかどうかを確認します。これは通常手術後 1 時間以内の場所をかかります。
- 移植時に、必要に応じて鎮痛剤を持つマウスを治療し、1.6 mg/mL の飲料水中の濃度でアセトアミノフェンとマウスを提供します。
- 各受信者のマウス手順 2.2 2.9 を繰り返します。
- 潜在的な健康の合併症を検出する注入の目の出現と同様、術後の動物の活動を監視します。
3 D 単一光子蛍光共焦点顕微鏡を用いた注入 Thymi の 3 共焦点イメージング
- Isofluorane 蒸気の 1-2% 間の線量を使用して受信者のマウスを麻酔します。イメージの作成手順を開始する前に次のつま先ピンチを反射の不在によって適切な anesthetization を確保します。
- その 1 つ目が向いているので側側臥位での固定ステージ顕微鏡プラットフォームにマウスを配置します。熱パッドは、記録中にマウスの一定の体温を確保するため顕微鏡プラットフォームに配置されます。
注: 詳細については補足の図 1を参照してください。 - 脳定位固定装置 headholder にマウスの頭を挿入し、胸腺移植を持って目に対物レンズの直接アクセスを許可する側の位置にマウスの頭を抑えるノブを調整します。
- マウス鼻をプロシージャ全体で麻酔した動物を維持する防毒マスクに配置します。これは、必要に応じて isofluorane 蒸気の調整が可能します。
- 録音中に目のまぶたの取り消しを回避しながら安定化しやすく、角膜の縁に付すポリエチレン チューブで覆われて彼らのヒントを持っているピンセットのペアに目を押しながらまぶたを引いて、UST 2 ユニバーサル ジョイント。この配置は頭と目が安定した固定が可能前述22として、目の血流の中断することがなく柔軟性を提供しています。
注:補足図 1 b Cは、完全なアセンブリを表示します。 - 角膜とレンズの間浸漬液としてマウスの目に対物レンズを配置する前に滅菌生理食塩水や人工涙を数滴を追加します。
注: 追加滴は顕微鏡パスを維持し目の乾燥を防ぐための手順の必要性に分配されます。 - まず低倍率 (5 X) を使用して、顕微鏡分野で胸腺を探します。長作動距離を持つ目標を浸漬より高い解像度 (10、20、40 X) 水液浸に切り替えます。LSM の生成や最小限のレーザー パワーを適用することで胸腺のインプラントの漂白を回避し、可能な限り、スキャン時間を短縮します。これは顕微鏡の共振型スキャナーを使用して実現されます。
注: 共焦点顕微鏡を用いてが共鳴スキャン ミラー 25 フレーム/秒の画像を収集することが備わっています。他のブランドはある共鳴スキャナーで独自の顕微鏡です。 - 顕微鏡のソフトウェアを使用して集録モードを選択し、共振型スキャナー モードを開始します。XYZT 画像モードを選択し、取得設定を次のように。
- アルゴン レーザーをオンにして蛍光励起の 30% に電力を調整します。
- 励起レーザー ラインを選択し、発光波長の異なるの音響光スプリッター (AOBS) 制御を設定します。さらに、後方散乱を検出して組織構造を描く、同時に反射検出を使用します。
注: 励起 (GFP と RFP) のための色のセットを選択すると、直接試料の上にこれらの励振線とそれらの間の放射を送信するは自動的に、AOBS はプログラムします。GFP および RFP は、例えば、励起光 488 周りの狭い反射バンドを使用我々 nm と 561 nm、それぞれ。これはレーザー パワーと集録時間の必要性を減らす放出される蛍光の光子のコレクションのための広いバンドを残します。反射モードで、AOBS は蛍光発光検出のために使用されるものから任意の波長で反射光を画像に 50/50 ビームスプリッターとして使用されます。 - 選択した波長で放出を収集、512 × 512 ピクセルの解像度を選択し、必要に応じて利得レベルを調整するLiveボタンを押して、イメージングを開始 (典型的な利得は約 600 V)。
- 胸腺のインプラントの上に焦点を当て、先頭と z スタックの末尾を定義、開始を選択し、最後の移植胸腺に集中することができますし、終了を選択面に移動します。5 μ m の z ステップ サイズを使用します。ソフトウェアは、共焦点平面の数を自動的に計算されます。
- 各 z スタック (通常 2 秒に 1.5) の獲得のための時間間隔を選択し、連続イメージングのために停止するまでを取得オプションを選択します。
- 初期化開始ボタンを押します。
- 3.1 3.9 の手順を繰り返すことによって、同じ動物から異なる時間に繰り返しグラフトをイメージします。
注: 動物は、両方の目に移植を保持している場合どちらの目からの録音はマウスの頭の直立位置側の切り替え後 3.2 3.9 の手順を繰り返すことによって撮影することができます。
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結果
新生児マウス胸腺がB6 から分離されました。Cg Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jasマウスこのプロトコル (手順 1.1 1.9) で説明されているようです。これらのトランスジェニック マウスにおける鶏 β アクチン プロモーターは赤色蛍光タンパク質変形した DsRed 発現を指示します。インプラントの追跡を促進する早い即時エンハンサー サイトメガロ ウイルス (CMV) の影響の下で MST。
拒絶反応を遺伝子型と同質の個人を防ぐために: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/Jは、ホストとして選ばれました。これらのトランスジェニック マウスにおける人間ユビキチン C プロモーターは受信者とドナー組織の間の明確な差別化を可能にするすべての組織に強化された緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現を指示します。人間ユビキチン C プロモーターのアクションは、特定の造血幹細胞の種類で差分の...
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ディスカッション
個々 の免疫能力4 T 細胞の成熟過程の重要性と成熟 T 細胞胸腺2,3プロデュースの前駆細胞の動態の推定の影響のため多大な努力に投資されています。古典的な組織を固定する選択肢を開発するアプローチをスナップショットしました。
研究での使用組織スライスとその他の植が明らかに単分子膜または集計の胸腺器官培養14,15より組織アーキテクチャの再現に優れた、vasculature への接続がない場合に制限、エントリまたは小さじ (血管内皮細胞の境界を越えた前駆細胞の転流) と出口 (血管内皮細胞のバリアを越えて成熟 T 細胞の転流) の臓器からの手順。同様に T 細胞のダイナミクスが他の細胞と接触、仮定、胸腺間質細胞と大脳皮質と髄質内にある微小でその運動を含む決定の分化状態と亜種のプロセス選択 (正と負)
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は NIH 助成金 R56DK084321 (AC)、R01DK084321 (AC)、R01DK111538 (AC)、R01DK113093 (AC)、R21ES025673 (AC) とベスト/2015/043 グラント サポートされている (Consellería ・ デ ・ Educació、文化会館私 esport、ジャナラリター バレンシア, バレンシア, スペイン) (EO)。サンペドロマルティル山脈バレンシア バレンシア ・ カトリカ大学サン ・ ビセンテ、スペイン、ビデオ撮影・編集のセントロ ・ デ ・危惧プリンシペ フェリペ、バレンシア、スペインでアルベルト ・ エルナンデスに送信チームを著者に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| イソフルオラン気化器(イソフルオラン | ケント・サイエンティフィック・コーポレーション | VetFlo-1215 | |
| 解剖スコープ(光源付き | ツァイス | ステミ 305 | |
| 微細解剖鉗子 | WPI | 500455 | |
| 中解剖鉗子 | WPI | 501252 | |
| 湾曲した先端微細解剖鉗子 | WPI | 15917 | |
| バンナスはさみ | WPI | 503371 | |
| 解剖はさみ | WPI | 503243 | |
| メス | WPI | 500353 | |
| 40ミリメートル18G針 | BD | 304622 | |
| 使い捨てトランスファーピペット | サーモフィ | ッシャー201C | |
| ヒートパッドとヒートランプ | トサイエンティフィック株式会社 | 赤外線 | |
| エタノール 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm 滅菌皿 | SIGMA | CLS430166 | |
| 滅菌 1x PBS pH(7,4) | サーモフィッシャー | 10010023 | |
| 滅菌ワイプ | キンバリー・クラーク | LD004 | |
| 疼痛管理薬 | シグマ・アルドリッチ | A3035-1VL | |
| 生理食塩水またはビスコティアーズ | ノバルティス | N/A | |
| 実体顕微鏡 | ライカ | MZ FLIII | |
| ヘッド保持アダプター | 成重 | SG-4N-S | |
| ガスマスク | 成重 | GM-4_S | |
| 共焦点顕微鏡 | ライカ | TCS SP5 II | |
| 層流フード | Telstar | BIO IIA |
参考文献
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