プロトコルの目的は、レーザー マウス眼房内で胸腺のインプラントで顕微鏡による胸腺細胞の縦の生体リアルタイム追跡を示すことです。角膜の透明性と血管新生血管前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口を継続的に記録が可能です。
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この記事について
サマリー
要約
提示されているメソッドの目的は、最初の時間のため、新生児 thymi生体内で縦のリアルタイム モニタ リング、血管内 thymocytes´ ダイナミクスの同質の成体マウスの前眼房への移植を表示するは胸腺のセグメント。次の移植、レーザー顕微鏡 (LSM) 角膜は、携帯電話の解像度レベルでの繰り返し非侵襲的イメージング体内をことができます。重要なは、アプローチに追加しますイメージング モデル以前の生体の T 細胞の成熟に連続前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口の録音の可能性同じ動物。システムの付加的な利点は、移植組織の巨視的急速な監視を許可する接木部透明性と全身トリートメントに加え、インプラントへのアクセシビリティがローカライズされました。組織のボリュームをされている主な制限するは葉のトリミングを要求する目の商工会議所の省スペースに収まります。オルガンの整合性は、成熟した T 細胞の生産で機能する以前にパターンで胸腺ローブを解剖によって最大化されます。技術は可能性のある自己免疫疾患、免疫不全、中枢性トレランス; を含む胸腺機能に関連する医学的に関連の質問の環境調査に適していますプロセス定義が不十分な機械論的に残っています。胸腺細胞の移動、分化と選択を導くメカニズムの細かい解剖は、新規治療戦略開発 T 細胞をターゲットにつながるはずです。
概要
胸腺内 T 細胞分化と T 細胞亜集団の選択は、開発と脊椎動物1の細胞性免疫能の維持のため重要なプロセスを構成します。このプロセスは、複雑な一連の血流や細胞増殖の移行から前駆細胞の募集、サブセットの大規模なプログラム細胞死および膜タンパク質の発現を含むしっかりと組織のイベント選択します。結果は最小化された自己のペプチッド、レスポンスを表示しながら、成熟 T 細胞に外国の抗原の広いスペクトル反応のリリースを最後まで個々2,3の末梢リンパ器官を植民地化します。ΑβTCR レパートリーの迷入胸腺選択は、自己免疫疾患や免疫のアンバランス4主に正または負の前駆体選択の過程それぞれ欠陥から派生したに します。
胸腺で胸腺細胞の方向性の移行は T 細胞の成熟のすべての段階に組み込み、ケモカイン、接着剤を含む複数の刺激、同時またはシーケンシャルのシリーズとして構想・解消接着細胞外マトリックス (ECM)蛋白質の相互作用の3、5。固定組織の研究が表示される定義された胸腺微小5,
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プロトコル
機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、マイアミ大学の IACUC ガイドラインに従ってすべての実験を承認しました。
1. 分離と新生児 Thymi のトリミング
- すべての試薬・ オートクレーブまたは滅菌条件の確保、その他の方法で機器を準備します。
- 、汚染を最小限に抑えるには、層流フードの下ですべての手術を実行します。
- ドナー マウスを安楽死させる前に滅菌の prechilled 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) x で 60 mm 滅菌皿を埋める、氷の上に置きます。それは、洗浄し、移植前にドナーから摘出した thymi を格納する使用されます。
- 倫理的なガイドラインに従い、斬首で新生児ドナー マウスを安楽死させるのに進んでください。
- 背直立位置とスプレーで無菌の吸収紙タオルの上にマウスを置くし、後で拭く、70% エタノールでマウスの腹部。
- 下腹部のレベルで表面的な V 字切開することによって胸腔内を公開解剖はさみ次の約 0.5-1 の開口部を残して腹側正中線ストレート 10 cm のペアで皮膚をカットして cm 胸のレベルで。胸腔内を公開する胸の各側面上の皮膚を折る。
- 横隔膜と前方の胸腔内で上縦隔にアクセスするはさみの同じタイプの胸部を作る 2 つの深い 0.5-1 cm 横切開します。胸腺は、中心部のすぐ上の ....
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結果
新生児マウス胸腺がB6 から分離されました。Cg Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jasマウスこのプロトコル (手順 1.1 1.9) で説明されているようです。これらのトランスジェニック マウスにおける鶏 β アクチン プロモーターは赤色蛍光タンパク質変形した DsRed 発現を指示します。インプラントの追跡を促進する早い即時エンハンサー サイトメガロ ウイルス (CMV) の影響の下で MST。
拒絶反応を遺伝子型と同質の個人を防ぐために: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/Jは、ホストとして選ばれました。これらのトランスジェニック マウスにおける人間ユビキチン C プロモーターは受信者とドナー組織の間の明確な差別化を可能にするすべての組織に強化された緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現を指示します。人間ユビキチン C プロモーターのアクションは、特定の造血幹細胞の種類で差分の.......
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ディスカッション
個々 の免疫能力4 T 細胞の成熟過程の重要性と成熟 T 細胞胸腺2,3プロデュースの前駆細胞の動態の推定の影響のため多大な努力に投資されています。古典的な組織を固定する選択肢を開発するアプローチをスナップショットしました。
研究での使用組織スライスとその他の植が明らかに単分子膜または集計の胸腺器官培養14,15より組織アーキテクチャの再現に優れた、vasculature への接続がない場合に制限、エントリまたは小さじ (血管内皮細胞の境界を越えた前駆細胞の転流) と出口 (血管内皮細胞のバリアを越えて成熟 T 細胞の転流) の臓器からの手順。同様に T 細胞のダイナミクスが他の細胞と接触、仮定、胸腺間質細胞と大脳皮質と髄質内にある微小でその運動を含む決定の分化状態と亜種のプロセス選択 (正と負)
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は NIH 助成金 R56DK084321 (AC)、R01DK084321 (AC)、R01DK111538 (AC)、R01DK113093 (AC)、R21ES025673 (AC) とベスト/2015/043 グラント サポートされている (Consellería ・ デ ・ Educació、文化会館私 esport、ジャナラリター バレンシア, バレンシア, スペイン) (EO)。サンペドロマルティル山脈バレンシア バレンシア ・ カトリカ大学サン ・ ビセンテ、スペイン、ビデオ撮影・編集のセントロ ・ デ ・危惧プリンシペ フェリペ、バレンシア、スペインでアルベルト ・ エルナンデスに送信チームを著者に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| イソフルオラン気化器(イソフルオラン | ケント・サイエンティフィック・コーポレーション | VetFlo-1215 | |
| 解剖スコープ(光源付き | ツァイス | ステミ 305 | |
| 微細解剖鉗子 | WPI | 500455 | |
| 中解剖鉗子 | WPI | 501252 | |
| 湾曲した先端微細解剖鉗子 | WPI | 15917 | |
| バンナスはさみ | WPI | 503371 | |
| 解剖はさみ | WPI | 503243 | |
| メス | WPI | 500353 | |
| 40ミリメートル18G針 | BD | 304622 | |
| 使い捨てトランスファーピペット | サーモフィ | ッシャー201C | |
| ヒートパッドとヒートランプ | トサイエンティフィック株式会社 | 赤外線 | |
| エタノール 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm 滅菌皿 | SIGMA | CLS430166 | |
| 滅菌 1x PBS pH(7,4) | サーモフィッシャー | 10010023 | |
| 滅菌ワイプ | キンバリー・クラーク | LD004 | |
| 疼痛管理薬 | シグマ・アルドリッチ | A3035-1VL | |
| 生理食塩水またはビスコティアーズ | ノバルティス | N/A | |
| 実体顕微鏡 | ライカ | MZ FLIII | |
| ヘッド保持アダプター | 成重 | SG-4N-S | |
| ガスマスク | 成重 | GM-4_S | |
| 共焦点顕微鏡 | ライカ | TCS SP5 II | |
| 層流フード | Telstar | BIO IIA |
参考文献
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006). ....
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再版と許可
