方法論記事

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

DOI：

10.3791/58237

⸱

2018年6月14日

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1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

この記事について

サマリー

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ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) の欠乏を生成されます。

要約

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CRISPR/Cas9 技術が多くの細胞の種類が今のところ、遺伝子デリバリーのゲノム工学を加速し、安定した遺伝子の改変は、NK 細胞の挑戦されています。たとえば、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの伝達の使用 transgene 配信実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスにより NK 細胞を遺伝子組み換えの限られた収量結果になったCas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を使用してプライマリおよび拡張の NK 細胞を人間のゲノムの編集を DNA 法をご紹介します。このメソッドは、NK 細胞における HPRT1 遺伝子 TGFBR2と効率的なノックアウトをできました。RT-PCR のデータを示した遺伝子発現レベルが大幅に低下、代表的な細胞製品の細胞毒性の試金は RNP 変更 NK 細胞 TGFβ により少なく敏感になったことを提案しました。遺伝子組み換え細胞ことができる照射 mbIL21 発現刺激による拡張されたポスト エレクトロポレーション フィーダー細胞。

概要

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がん免疫療法は、近年進められています。遺伝子組み換えキメラ抗原受容体 (車) T 細胞は、癌免疫療法に正常に展開設計の免疫細胞の優れた例です。これらの細胞は最近に対する治療薬として FDA によって承認された CD19 + B 細胞悪性腫瘍、しかし、成功のいくつかの対象抗原を軸受の病気に限られているところし、免疫の脱出によって故障しやすいがこのような限られた抗原のレパートリーを対象とします。さらに、車の T 細胞は移植片対宿主病同種 T 細胞によって引き起こされるの危険のため自己の T 細胞の使用に注目されています。対照的に、NK 細胞は、抗原非依存性に腫瘍ターゲットを殺すことやがん免疫療法6,7,8,9の良い候補になる GvHD が発生しません。

CRISPR/Cas9 技術は、エンジニア リングの免疫細胞で最近使用されていますが、遺伝子組み換えプラスミドを持つ NK 細胞をリプログラミング常に挑戦されています。これは実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスと遺伝子組み換え NK 細胞4の限定生産を引き起こすレンチ ウイルス、レトロ ウイルスの伝達など DNA 依存的遺伝子配信の難しさによるずっと,9。

多くの自然免疫系細胞、病原体関連分子パターンの受容体の高レベルを表現レチノイン酸誘導性遺伝子私(リグ-私)、外来 DNA の高められた認識を有効にします。遺伝子組み換え10の DNA ベースのメソッドを使用する場合、これらの経路の抑制が NK 細胞の情報伝達効率を有効に。

プライマリと拡張のヒト NK 細胞 Cas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を利用の編集無料の DNA ゲノムを使用する方法をご紹介します。Cas9/結合組換え Cas9 蛋白質複合体 crRNA と tracerRNA から成る合成の単一ガイド RNA との複合体の 3 つのコンポーネントで構成されます。これらの Cas9/結合機能性錯体としての配信のための外国の DNA 依存性アプローチと比較して高効率なゲノムのターゲットを切断が可能です。また、Cas9/結合セルからの迅速なクリアランスは、アポトーシスの誘導などのターゲットをオフの効果を減らす可能性があります。したがって、彼らは、ノックアウト、またはノックを相同組換え6、7の DNA と組み合わせた場合を生成する使用できます。Cas9/結合のエレクトロポレーションを示した NK 細胞で遺伝子組み換えの前の制約を克服する簡単で比較的効率的な方法です。

TGFβ は、主要な免疫サイトカイン、活性化、NK 細胞の機能を阻害します。TGFβ 経路をターゲットで免疫細胞の機能を高めることができると言われています。我々 は TGFβ11.にバインドする TGBR2 外部ドメインをエンコーディング地域を対象と代表の結果は、この遺伝子の発現レベルが大幅に低下を示し、さらに変更された NK 細胞なる TGFβ に耐性を示します。さらに、変更されたセルに保持の生存率、増殖能拡張ポスト エレクトロポレーション照射フィーダー細胞.を使用することは、したがって、次のメソッドがいずれかの NK 細胞を遺伝子操作する有望なアプローチさらに臨床や研究の目的。

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プロトコル

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健康なドナー バフィー コート素材としてから中央オハイオ州地域米国赤十字社が得られました。この研究は、制度検討委員会の全国小児病院によって免除の研究に決定されました。

1. ヒト NK 細胞精製と拡大

  1. バフィー コート12から PBMCs を分離します。
    1. レイヤー Ficoll Paque の 15 mL のバフィー コート サンプルの 35 mL。
    2. ブレーキなし 20 分間 400 × g で遠心し、インターフェイスから、PBMC を収集します。
    3. PBS の少なくとも等しいボリュームを追加することによって回復した PBMCs を 3 回洗浄、400 × g で 5 分間遠心分離し、PBC を吸引洗浄します。NK 細胞は RosettesSep13でこの段階で分離することができます。
  2. 照射 10 x 106 mbIL21-表現で刺激することによって NK 細胞を展開し 0、7、および 14 日フィーダー細胞。メディアを置き換えて 10% を含む新鮮な RPMI 1 %fbs グルタミン、1% ペニシリン ストレプトマイシンおよび全体のメディア ボリューム一日おきの IL-2 の 100 IU/mL。

2. gRNA 設計と選択

  1. 対象に、オンライン ツール、例えばNCBI、アンサンブルを使用して特定のゲノム遺伝子座を選択します。
    例を示します。
    説明/コントロール: 成長因子 β 受容体 2 (TGFBRR2) の変換外部ドメイン
    レコードを表示: PF08917
    InterPro を表示: IPR015013
    位置: 49 157 aa
    目標とされたシーケンス: エクソン TGFBR2 遺伝子 (ENSG00000163513) の 4
  2. 設計、gRNAs を http://crispr.mit.edu、'Benchling' など CRISPR デザイン web ツールを使用します。
    1. 手順 2.1で選ばれた DNA シーケンスに入力します。ターゲット ゲノムとして人間 (hg 19) を選択します。CRISPR ガイド (PAM 並びに続いて 20 ヌクレオチド: NGG) 以前に入力シーケンスからスキャンされます。また、選択したゲノム全体オフのターゲット候補を示します。
    2. 彼らのターゲットに、ターゲットをオフ率に基づいて、最高のスコアを持つ最高の 3 gRNAs を選択します。たとえば、表 1は、対象とするエクソン 4 遺伝子 TGFBR2 の CRISPR デザイン web ツールによって提案された設計 CRISPR Rna を示します。
  3. 合成シーケンス固有の crRNAs として CRISPR Rna を注文します。
  4. 保存、注文、crRNA と部分的な相同性を介して対話する RNA (tracrRNA) を transactivating します。

3. デザイン削除プライマーのスクリーニング

  1. T7E1 突然変異の試金のための gRNA 胸の谷間サイトにまたがるプライマーを設計します。
  2. SgRNA ターゲット ・ サイトでの小さな挿入・削除 (オクターリピート) のように、予測された胸の谷間サイトから使用プライマー、少なくとも 100 bp は、1.5% の agarose のゲルの突然変異試験を次に表示されます。TGFBR2 外部ドメインを増幅するプライマーを表 2に示します。

4. 人間のプライマリおよび拡張された NK 細胞の情報伝達

注: NK に Cas9/結合要素の伝達は、4 D システムを次のように使用してエレクトロポレーションによって行われます。

  1. セル準備
    1. NK 細胞のため、4 日間 100 IU/mL IL-2 の存在下で RPMI 培地で新鮮単離の NK 細胞をインキュベートし、日 5 でエレクトロポレーションを実行します。以前と伝達の前に日を説明するよう毎日メディアを交換します。
    2. NK 細胞の拡張のため、日 0 1:1 の比率で照射フィーダー細胞と細胞を刺激し、一日 5、6 または 7 でエレクトロポレーションを実行します。以前と伝達の前に日を説明するよう毎日メディアを交換します。
    3. エレクトロポレーションの日 8 ml エレクトロポレーションと加湿の 37 ° C、5% CO2インキュベーターで事前 incubate フラスコ細胞の IL-2 の 100 IU/mL を含む新鮮な RPMI の T25 フラスコを準備します。
      注:解凍されたセルまたは 2ndや 3rdの刺激を受けた細胞は、前述の回復後にいつでも electroporated をすることができます。
    4. 3-4 × 106細胞伝達ミックスの 26 μ L の条件あたりを取る。
      注:エレクトロポレーション ソリューションの NK 細胞の非常に高濃度では、伝達率を向上させます。
    5. 3 回通常 RNase 活性を含むすべての FBS を削除する PBS のセルを洗浄します。8 分の 300 x g でそれぞれの時間をそれらを回しなさい。
      注:ない Cas9/結合と 1 つのコントロールと 2 つの gRNAs (gRNA1 gRNA2、gRNA1 gRNA3、gRNA2 + gRNA3) の組み合わせ Ca/結合が 1 つの gRNA (gRNA1、gRNA2、gRNA3) として 7 エレクトロポレーション条件を検討してください。
  2. CrRNA:tracerRNA を形成する複雑な/
    1. 1 x 200 μ M の最終濃度にテ ・ ソリューションでは、crRNAs (gRNA1、gRNA2、および gRNA3)、tracerRNA を再懸濁します。200 μ M tracerRNA表 3に示すように各 200 μ M gRNA のミックス 2.2 μ L。
    2. 95 ° C、5 分でサンプルを加熱、室温 (15-25 ° C) にベンチの上に冷却すること。ストアは、Rna と crRNA を再停止される: tracerRNA/複合体後で使用のための-20 ° C で。
  3. RNP 複合体を形成します。
    注:    時間を節約する形成 RNP の洗濯物の中に複雑なステップ 4.1.5 。
    1. 単一 crRNA:tracrRNA 二重反応は、表 4の例で示すように、36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼを薄くしなさい。
    2. CrRNA:tracrRNA デュプレックスの組み合わせの伝達の希釈 36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼの例で示すように、テーブル 5 。
    3. ピペット チップ、30 以上を旋回しながらゆっくりと crRNA:tracrRNA 二重に Cas9 エンドヌクレアーゼを追加 1 分に s。
    4. 15 〜 20 分のための部屋の温度で混合物を孵化させなさい。インキュベーション後の混合物を使用する準備ができていない場合、は、使用するまで氷の混合物を保ちます。
  4. エレクトロポレーション
    1. エレクトロポレーション ソリューション P3 に全体の補足を追加し、部屋の温度でそれを維持します。
    2. P3 主な 4 D エレクトロポレーション ソリューションの 20 μ l ( 4.1.5 のステップからの 3-4 × 106細胞) 細胞ペレットを再懸濁します。ピペッティングしながら気泡を避けるため。
      注: セル P3 ソリューションで長い間放置してはなりません。
    3. すぐに細胞懸濁液に RNP 複合 (ステップ 4.3) の 5 μ L を追加します。
    4. Cas9/結合/セルに 100 μ M Cas9 エレクトロポレーション エンハンサーの 1 μ L ミックスを追加します。
    5. エレクトロポレーション短冊 20 μ Cas9/結合/セル ミックスを転送します。
    6. サンプルがストリップの底をカバーすることを確認するストリップを軽くたたきます。
    7. 4 D エレクトロポレーション システムを起動し、 EN 138プログラムを選択します。

5. ポスト伝達

  1. 細胞のストリップで 3 分間休憩をしましょう。
  2. キュヴェットへ事前釣合い文化メディア 80 μ L を追加し、そっとフラスコにサンプルを転送します。
  3. 導入後、48 時間は、スクリーニング遺伝子の削除の 5 × 105細胞からゲノム DNA を抽出します。
  4. ステップ 3.2 Taq DNA ポリメラーゼのキットで設計したプライマーを使用して興味の遺伝子を増幅します。
  5. PCR 増幅 heteroduplexes T7EI の消化を形成し、37 ° C で T7EI 酵素で 30-60 分間インキュベート製品
    注:アッセイは、スクリーニングとは、高速、簡単なを提供します T7EI は、測量アッセイを用いたに比べて電気泳動結果をクリーンアップします。ただし、このメソッドの削除と挿入を検出できません < Cas9 結合実験14(NHEJ) の活動に参加する非相同末端によって生成された 2 拠点。
  6. 1.5% の消化の DNA を実行 30-45 分、110 V で agarose のゲル 15 分ごとを視覚化するゲル。
  7. MbIL21 発現と細胞の残りの部分を刺激する 1:1 の比率でフィーダー細胞。
  8. 刺激後 5 日間は、qPCR を使用して遺伝子発現レベルの RNA を抽出します。
  9. 以前に報告された12としてカルセイン アッセイを実施します。簡単に言えば、カルセイン AM (例では、3 μ g/mL/1,000,000 DAOY 細胞を用いて) を用いた標的細胞をロードします。NK 細胞の細胞毒性の試金に備える IL2 で一晩休んで (100 IU/mL) プラスまたはマイナス 10 ng/mL 水溶性 TGFβ。NK 細胞は、一晩で休んでいた同じサイトカイン カルセインの試金を実施します。

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結果

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エレクトロポレーション効率

Cas9/結合へのエレクトロポレーションを最適化するため、我々 は NK 細胞に GFP を対象とした siRNA とプラスミドの伝達で 16 の異なるプログラムをテストしました。流れの cytometry の試金を認めたEN 138細胞生存率および伝達効率 (35% ライブ GFP 陽性細胞) (図 1 ・図 2) 両方の粒子の割合が最も高い。興味深いことに、Cas9/結合エレクトロポレーションのこのプログラムを使用して効率は高い TGFBR2 mRNA 発現レベル (図 5) で 60% 削減しました。さらに、遺伝子組み換えの NK 細胞が成長して 30 日間、凍結保存 (データは示されていない) に展開します。

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ディスカッション

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4,9NK 細胞の DNA 依存した変更にチャレンジしております。我々 は、したがって、直接総合的前もって形成されたリボ核タンパク質 (結合) 複合体と Cas9 タンパク質精製タンパク質としてに導入プライマリおよび拡張された NK 細胞8。このメソッドを使用すると、キャップを排除するために実行できましたが、尾行と他の転写と翻訳プロセス開始 RNA ポリメラーゼ II は、DNA 依存性伝達方法に関連付けられている NK 細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があります。

さらに、報告されたメソッドはここで Cas9/結合、アクティブなエレクトロポレーションの直後、すぐに、ターゲット上の増加、現在のプロトコルにオフターゲット効果を減少して品質が低下として使用浄化された Cas9 タンパク質複合体5,6

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開示事項

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DAL は、提供しています/宅配治療や黒曜石治療、Intellia 治療薬、メルク研究所 Miltenyi バイオテックのコンサルタントを務めてし、資本/リーダーシップは、CytoSen 治療。

謝辞

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原稿を編集で彼の親切な助けのブライアン ・ トゥッリウス ・を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ロゼットSep™ヒトNK細胞濃縮カクテルSTEMCELLテクノロジーズ15065ロゼットSep™Human NK Cell Enrichment Cocktailは、ネガティブセレクションにより全血からNK細胞を分離するように設計されています。
フィコル・パケ®プラスGEヘルスケア - ライフサイエンス17-1440-02
Alt-R®CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA Technologies1072532化学修飾を含むTracrRNAは、ヌクレアーゼ耐性を増加させます。crRNAにハイブリダイズしてCas9酵素
Alt-R®を活性化します。CRISPR-Cas9 crRNAIntegrated DNA TechnologiesAlt-R®として合成的に生産されました。CRISPR-Cas9 crRNA、intrest Alt-R®の遺伝子を標的とする設計済みgRNAの配列に基づく
。ゲノム編集検出キット統合DNA技術1075931各キットには、T7EIエンドヌクレアーゼ、T7EI反応バッファー、T7EIアッセイコントロールが含まれています。
プラチナ®Taq DNAポリメラーゼハイフィデリティInvitrogen11304-011
4D-ヌクレオフェクター™システムロンザAAF-1002B
人間の組換えIL-2タンパク質ノバルティス65483-0116-07
P3初代細胞4D-Nucleofector™XキットロンザV4XP-3032はpmaxGFP&tradeが含まれています。ベクター、ヌクレオフェクター&貿易;溶液、サプリメント、16ウェルNucleocuvette™ストリップ
非ターゲティング:カスタムsiRNA、標準0.05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1074181Cas9 Nuclease
DNeasy®ブラッド&ティッシュハンドブックQiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGFβバイオレジェンド580706
Alt-R®CRISPR-Cas9コントロールキット、ヒト統合DNAテクノロジー1072554tracrRNA、HPRTポジティブコントロールcrRNA、ネガティブコントロールcrRNA#1、HPRTプライマーミックス、ヌクレアーゼフリーデュプレックスバッファーが含まれています。
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)統合DNAテクノロジー11-01-02-02
Alt-R®Cas9エレクトロポレーションエンハンサー統合DNA技術1075915Cas9エレクトロポレーションエンハンサー
独自の

参考文献

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NKNKTGFBR2HPRT1Nucleofector EN138IL21

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