植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

サマリー

ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン シグナルペプチドと変更されています。

要約

真核生物遺伝子組換え分泌蛋白質構造および生化学的研究を表現する科学者のための挑戦だった。バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、いくつかの翻訳後修飾遺伝子組換えの真核生物の分泌蛋白質を表現するために使用するシステムの一つです。分泌タンパク質は、タンパク質の糖鎖修飾、ジスルフィド結合の形成および他のポスト翻訳の修正の分泌経路を介してルーティングされる必要があります。既存昆虫細胞分泌植物タンパク質発現を高めるためには、バキュロ ウイルス発現ベクターは GP67 のいずれかの追加またはプロモーターと多重クローニング サイトの間ヘモリン信号のペプチッド シーケンスによって変更されます。この新設計変更されたベクトル システムは、シロイヌナズナの可溶性組換え分泌植物受容体タンパク質の高収率に成功しました。X 線結晶学的研究 2 発現植物タンパク質、シロイヌナズナ TDR と PRK3 の細胞膜受容体の細胞外ドメインの結晶化しました。変更されたベクトル システムは動物の王国と同様に組換え分泌蛋白質の表現の可能性のある使用できる改良されたツールです。

概要

特に x 線結晶構造解析のための生化学的および生物物理学的特性の均質な組換えタンパク質の大量生産ができるように研究所が不可欠です。大腸菌酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞などそれらの間など定評の異種発現系が多い、バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、ほとんどの一つです。構造的に折り畳まれた大型真核生物に向けた組換えタンパク質タンパク質結晶化¹の大量に生産するのに技術が使用されます。

バキュロ ウイルス発現系の表現のベクトルは、強い由来ポリヘドリン遺伝子または遺伝子組換え細胞内タンパク質^2,3の高収率を生成する P10 プロモーターを含む設計されています。組換えバキュロ ウイルスをするためには、興味の遺伝子が違いによるとマルチ nucleopolyhedroviral ゲノム由来ポリヘドリン遺伝子 (polh) の軌跡を含む昆虫ベクトルに複製されます。結果としての構築は、シーケンシャルなその正しいオープンリーディング フレーム (ORF) が確認されます。正しいコンストラクト トランスフェクションのプロセスを介して宿主昆虫細胞に導入します。興味の遺伝子は相同組換えによってウイルスのゲノムに挿入されます。このイベントは、組換えウイルスのゲノムは、組み換え体を生....

プロトコル

注: 分泌植物蛋白発現および結晶化のための変更された表現のベクトルとバキュロ昆虫細胞システムが使用されます。

1. 植物タンパク質分泌発現の GP67 シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更

1. 5' BglII 切断サイト¹³GP67 の分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 a) とマルチ クローニング サイトを含む DNA 断片を合成します。
   注: BglII と病原が消化されるので同じ接着端で起因した DNA、焼なまし結紮順番 BglII と病原の両方のサイトは、劈開はシーケンスに変異が、一直線に並べられたベクトルが消化の DNA のフラグメントを縛ることができます。BglII または病原¹⁴。
2. BglII と XhoI、DNA のダイジェスト 4 μ g と病原と XhoI¹⁴発現ベクター DNA の 4 μ g。各制限酵素の 10 単位を混ぜて濃度反応バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM、100 μ g/mL BSA、pH 7.9 25 ° C で) x 1 の DNA と 4 h ....

結果

図 1に示すように、GP67 またはヘモリン信号シーケンスのいずれかの標的遺伝子の組み込み信号シーケンスに置き換えると分泌された蛋白質を表現する 2 つの変更された pFastBac1 バキュロ ウイルス発現ベクターが使用されました。ウイルス GP67 と昆虫ヘモリン遺伝子は、細胞の高い分泌発現レベルに実証されています。これらの 2 つの信号シーケンスのいずれかが付いている融合蛋白質が分泌発現レベルが大幅に向上する予定です。同一複数クローニング サイト (MCS) は、これらの 2 つの変更されたベクトルで設計されました。東北大学からのサイトは、東北大学からの他の多くの制限のサイトで現在最も一般的な 6 ヌクレオチド シーケンスではなく 8 塩基を持っているので意図的に最も 5' 側 mcs に置かれました。など、東北大学からのサイトは以下の制限の消化力と使用制限の他のサイトと比較してより現実的なほとんどのターゲット遺伝子のクローニングを行う他のほとんどの制限サイトよりターゲット遺伝子の存在です。ノッティと下位制.......

ディスカッション

サイズおよび生物学的システムで現在の蛋白質の何千もの安定性の多様性を考えると、それは実証研究のためはしばしば特定の蛋白質の表現のために選択される異種発現システムを決定する室します。大腸菌発現系は多くの場合¹⁹をスケール アップする細菌は、低コストの文化、メディアおよび相対的な容易さの短いライフ サイクルのための蛋白質の表現のための最初の選択肢です。大腸菌を使用して、しかし、60 kDa 以上のサイズを持つ大規模な真核生物タンパク質の発現システムはしばしば封入体または集計²⁰不溶性タンパク質の結果します。それらの困難なタンパク質発現および他から分泌されるタンパク質では、バキュロ ウイルス昆虫細胞発現系は大腸菌よりも有利かもしれません。特に分泌の真核生物の蛋白質を表現するとき、この変更されたバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系は好ましい選択にかもしれない。

分泌される分泌される植物蛋白質を含む真核生物のタンパク質には多くタンパク質折り畳みと分.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
インキュベーターシェーカー	VWR	Model Excella E25	27 oC
インキュベーター	VWR	Model 2005	27 oC
遠心分離	BECKMAN	モデル J-6	スイングバケットローター付き
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51
	のPCR増幅用BIO-RAD	モデル C1000 タッチ
インキュベーターシェーカー	ニューブランズウィック科学	モデルI 24	成長するバセリア培養用
顧客DNA合成	GENSCRIPT
BamHI (HF)	ニューイングランド バイオラボ	R3136S	制限 エンドヌクレアーゼ
BglII	ニューイングランド バイオラボ	R0144S	制限 エンドヌクレアーゼ
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriction Endonuclease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	細菌培養からのプラスミドDNA精製
アガロース	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15510-019	DNAゲル電気フェロシス
用 MAX 効率 DH5&α; 競合細胞	Invitrogen	18-258-012	DNAライゲーション混合物の形質転換用
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	細菌培養物を作るため
アンピシリンナトリウム塩	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11593-019	抗生物質
カナマイシン硫酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15160-054	抗生物質
テトラサイクリン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	64-75-5	抗生物質
ゲンタマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15710-064	抗生物質
MAX 効率 DH10Bac コンピテントセル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10361-012	バクミド DNA
S.O.C. ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15544-034	DNA 形質転換用
CellFECTIN II 試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10362-101	昆虫細胞トランスフェクション試薬
Bac-to-Bac 発現システム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10359-016	バキュロウイルス昆虫細胞発現キット
Bluo-gal	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15519-028	バクミドDNA
IPTG	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15529-019	バクミドDNA
pFastBac1	サーモフィッシャーサイエンティフィック	サイエンティフィック 10360014	バキュロリルス発現ベクター
Sf9細胞	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11496015	Sf9単層細胞
Hi5細胞	サーモフィッシャーサイエンティフィック	B85502	ハイファイブ昆虫細胞
グレースS 昆虫培地、無添加	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 細胞トランスフェクション最小培地
Grace'Thermo	Fisher Scientific	Scientific 11605102	Sf9単層細胞培養完全培地
Sf-900 II SFM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10902104	Sf9懸濁細胞培養培地(FBS
Express Five Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5細胞培養培地
ペニシリン・ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15140122	100 ml (10,000 I.U./ml)
L-グルタミン (200 mM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25030081	100 ml
FBS認証	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16000-044	500 ml
6ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	08-772-1B	平底
150 mmプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	サイエンティフィック 353025	100/ケース
1.5 ml 微量遠心チューブ	USA Scientific	1415-2500	500 tubes/bag
15 ml 円錐スクリューキャップ遠心分離管	USA Scientific	1475-0511	25 tubes/bag
50 ml 円錐スクリューキャップ遠心分離管	USA Scientific	1500-1211	25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA 樹脂
pH インジケーターストリップ	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14

機 DNAサーマルサイクラー DNAのPCR増幅用 ック